歐亞旋覆花總黃酮對(duì)肢體缺血再灌注骨骼肌影響的研究

楊盺宇

【摘要】目的：探討歐亞旋覆花總黃酮（total flavones extracted from Inula britannica L，TFIB）對(duì)肢體缺血再灌注骨骼肌的保護(hù)作用。方法：健康成年家兔20只，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只，建立兔肢體缺血再灌注損傷動(dòng)物模型。在即將恢復(fù)血流灌注時(shí)，兩組分別自耳緣靜脈注射生理鹽水（對(duì)照組）、歐亞旋覆花總黃酮注射液（實(shí)驗(yàn)組）。分別在缺血前、缺血后2h、再灌注后1h、再灌注后3h采集術(shù)側(cè)股靜脈血樣。測(cè)定血清乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）的含量。取上述各時(shí)相點(diǎn)動(dòng)物脛前肌組織，測(cè)定骨骼肌組織濕/干重比值并觀察肌組織微細(xì)和超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組再灌注后LDH、CK明顯低于對(duì)照組（P<0.01），骨骼肌組織濕/干重比值低于同期對(duì)照組（P<0.05）。光鏡及電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組骨骼機(jī)損傷輕于對(duì)照組。結(jié)論：歐亞旋覆花總黃酮能夠緩解組織水腫，保護(hù)缺血再灌注骨骼機(jī)。

【關(guān)鍵詞】歐亞旋覆花總黃酮;骨骼肌;再灌注損傷

【中圖分類號(hào)】R681;【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A; 【文章編號(hào)】2026-5328（2021）02-025-05

Abstract：Objective：To study the protective effect and mechanism of Total flavones extracted from Inula britannica L （TFIB）on ischemia reperfusion injury of skeletal muscle. Methods：The experimental model of ischemia reperfusion injury in extremity were produced in 20 healthy adult rabbits which were randomly divided

into experimental and control groups（each of 10 rabbits）. Normal saline injection and TFIB were infused intravenously into rabbits of control group，experimental group respectively just before blood reperfusion. At preischemia，2 hours post-ischemia，1 hour post-reperfusion and 3 hours post-reperfusion，sample of blood was collected from the femoral veins respectively for measurements of lactic dehydrogenase（LDH），creatine kinase（CK） by means of biochemical methods in every rabbit. Meanwhile the tibialis anterior muscles were harvested for the measurements of Wet/Dry ratio of skeletal muscle and for the microscope and ultrastructure examinations by using optical microscope and electronic microscope respectively . Results ：After reperfusion，the contents of LDH、CK were dramatically higher in control group（P<0.01） but were not in experimental group（P>0.05）. The Wet/Dry ratio of skeletal muscle had not obvious difference in every group（P>0.05） before reperfusioin. The skeletal muscle injury of experimental groups，after reperfusion was of a mild degree than of control group in light microscope and electronic microscope examinations. Conclusion：TFIB can effectively improve soft tissue swelling and protec skeletal muscle from ischemia reperfusion injury.

Key words：Total flavones extracted from Inula britannica L;Skeletal muscle; Reperfusion injury

肢體的創(chuàng)傷、斷肢再植、血栓形成、組織移植以及止血帶的應(yīng)用時(shí)間過長(zhǎng)均可引起肢體缺血。隨著血流的恢復(fù)，在隨后的一段時(shí)間內(nèi)組織損傷不僅不減輕反而逐漸加重，這種現(xiàn)象稱為肢體缺血再灌注損傷。它不僅影響缺血肢體組織的存活及功能，而且可累及全身多器官，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)多器官功能衰竭而導(dǎo)致患者死亡[1，2]。歐亞旋覆花是菊科旋覆花屬，多年生草本植物，性味咸、溫;入肺、腎經(jīng)。其黃酮類物質(zhì)的含量高達(dá)10.9%，黃酮類化合物具有清除自由基和抗應(yīng)激反應(yīng)的能力。歐亞旋覆花含有槲皮素、木犀草素、槲皮苷等多種黃酮類化合物，具有抗氧化活性[3，4]。有報(bào)道歐亞旋覆花總黃酮（ total flavones extracted from Inula Britannica L.，TFIB）注射液在休克、腎損傷、大腦缺血再灌注損傷中有保護(hù)作用[5、6]。然而有關(guān)歐亞旋覆花總黃酮對(duì)肢體缺血再灌注損傷的作用，目前尚無報(bào)道。本文用家兔肢體缺血再灌注損傷模型，探討中藥制劑歐亞旋覆花總黃酮對(duì)肢體缺血再灌注骨骼肌的作用。

1 材料與方法

1.1 歐亞旋覆花總黃酮的制備

取歐亞旋覆花適量加10倍量水，回流提取3 次，1 h/次，合并提取液濃縮;然后用AB-8大孔吸附樹脂柱富集，提取物上樣濃度為0.2 g/ml，用70%乙醇進(jìn)行洗脫，冷凍干燥，測(cè)得總黃酮含量為89.5%[7]。

1.2 動(dòng)物分組及模型的建立

健康成年家兔20只，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。參照Crinnion等方法[8，9]建立肢體缺血再灌注損傷動(dòng)物模型。術(shù)前12h禁食，3%戊巴比妥鈉（40～60mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉。無菌手術(shù)暴露左大腿股血管鞘，于腹股溝韌帶處用微血管夾阻斷股動(dòng)、靜脈，在阻斷處以下用橡皮帶彈性環(huán)扎以阻斷側(cè)支循環(huán)。2h后取下橡皮帶和血管夾，恢復(fù)肢體血供。在即將恢復(fù)血流再灌注時(shí)，從耳緣靜脈注射歐亞旋覆花總黃酮注射液（50 mg/kg），對(duì)照組從耳緣靜脈注射生理鹽水注射液2ml。

1.3 檢測(cè)項(xiàng)目及方法

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別在缺血前、缺血后2h、再灌注后1h、再灌注后3h4個(gè)時(shí)相點(diǎn)自術(shù)側(cè)股靜脈采集血樣，并取術(shù)側(cè)脛前肌組織。

血清LDH、CK的測(cè)定：采用美國(guó)貝克曼CX-4型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中LDH、CK的含量（U/L）[10，11]。LDH、CK測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

骨骼肌組織濕/干重比值的測(cè)定： 取上述各時(shí)相點(diǎn)動(dòng)物小塊脛前肌肉標(biāo)本稱濕重后，置60℃恒溫箱中，60h后稱骨骼肌干重，然后計(jì)算骨骼肌組織濕/干重比值。

石蠟切片制備及光鏡觀察： 每組任選2只動(dòng)物骨骼肌標(biāo)本切成2cm×1 cm×0.5cm大小的組織塊，固定于標(biāo)本筐中，然后置于4%多聚甲醛液中固定6h。常規(guī)梯度乙醇脫水，透明，包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察并照相（每組取4個(gè)樣本，每樣本做4張切片，包括肌纖維縱橫兩個(gè)切面）。

超薄切片制備及電鏡觀察：將上述肌肉標(biāo)本切成1mm3大小的組織塊，經(jīng)3%戊二醛液4℃前固定，0.2M二甲胂酸鈉緩沖液沖洗，1%鋨酸4℃后固定，常規(guī)梯度上行乙醇脫水，Epon812包埋劑浸透、包埋，超薄切片，H-7500型透射電鏡觀察并攝片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示（），統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中LDH、CK變化

血清LDH變化（表1）： 對(duì)照組再灌注后LDH明顯增高（P <0.01）。再灌注后實(shí)驗(yàn)組LDH明顯低于對(duì)照組（P <0.01）。

2.3 顯微結(jié)構(gòu)的變化

光鏡觀察：缺血后2h鏡下見橫紋肌纖維輕度變性（濁腫），部分橫紋可見，肌核存在。再灌注后1h和再灌注后3h對(duì)照組見肌纖維明顯水腫，橫紋消失，部分區(qū)域肌核消失，胞漿凝固，肌核固縮（圖A）。再灌注后1h和再灌注后3h實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)部分肌纖維輕度腫脹，間質(zhì)水腫，肌核接近正常（圖B）。

透射電鏡觀察：缺血2h后見肌纖維邊緣線粒體有髓樣變，糖原、內(nèi)皮細(xì)胞改變不明顯。對(duì)照組再灌注后3h顯示線粒體髓泡樣變和空泡樣變、嵴斷裂、糖原顆粒減少、雙側(cè)終池電子密度增高、橫小管粗細(xì)不等（圖C）。實(shí)驗(yàn)組再灌注后3h三聯(lián)體、糖原顆粒較對(duì)照組增多，但肌纖維旁有髓樣變線粒體，三聯(lián)體較對(duì)照組完整（圖D）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血清中LDH、CK在缺血后2h較缺血前都有所升高，但升高不明顯;再灌注后對(duì)照組較缺血前和缺血后2h明顯升高（P<0.01）。光鏡及電鏡觀察也發(fā)現(xiàn)骨骼肌在缺血后2h已出現(xiàn)損傷，但并不甚嚴(yán)重，再灌注后骨骼肌細(xì)胞損傷則非常明顯，說明再灌注后細(xì)胞的損害并未停止而是進(jìn)一步加重，即發(fā)生了缺血再灌注損傷。再灌注后3h血清LDH、CK兩組均高于再灌注后1h，尤以對(duì)照組明顯，提示可能在肢體缺血再灌注損傷后的一定時(shí)間內(nèi)，灌注的時(shí)間越長(zhǎng)則組織的損傷程度越重。而歐亞旋覆花總黃酮可減輕骨骼肌缺血再灌注損傷。用藥后LDH、CK含量明顯下降（P<0.01），說明對(duì)LDH、CK的釋放有明顯的抑制作用，保護(hù)組織細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，減輕骨骼肌細(xì)胞損傷程度。光鏡及電鏡的觀察結(jié)果也表明實(shí)驗(yàn)組肌細(xì)胞損傷程度較同期對(duì)照組明顯減輕。

骨骼肌組織濕/干重比值可反映組織損傷后水種程度。組織受損時(shí)，花生四烯酸代謝產(chǎn)物增多，吸收大量炎性細(xì)胞進(jìn)入組織或粘附于血管內(nèi)皮。由于炎性細(xì)胞浸潤(rùn)毛細(xì)血管壁，增加血管通透性，導(dǎo)致組織細(xì)胞水腫。隨著骨骼肌組織損傷程度進(jìn)一步加重，組織細(xì)胞水腫進(jìn)一步增加，骨骼肌組織濕/干重比值明顯增大。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示再灌注后兩組骨骼肌組織濕/干重比值較缺血前和缺血后2h有所升高，而實(shí)驗(yàn)組骨骼肌組織濕/干重比值則低于對(duì)照組。光鏡及電鏡觀察到實(shí)驗(yàn)組組織水種程度較對(duì)照組明顯減輕。說明歐亞旋覆花總黃酮具有顯著的消腫作用，其消腫機(jī)制可能是一方面通過藥物的物理作用，它有明顯高滲脫水作用，減少水流入細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞內(nèi)水分吸出細(xì)胞外，維持細(xì)胞容積，防止細(xì)胞及細(xì)胞器破裂;另一方面通過藥物的化學(xué)作用，它能夠清除氧自由基，通過阻斷自由基的連鎖反應(yīng)，減輕氧自由基對(duì)骨骼肌細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化的損傷，保護(hù)內(nèi)源性SOD和GSH活力，改善肌細(xì)胞代謝[3，4]。

缺血再灌注損傷機(jī)制非常復(fù)雜，已知有許多因素參與再灌注損傷過程，如自由基、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)效應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、一氧化氮、炎性介質(zhì)損傷等[5～6]，目前認(rèn)為自由基損傷在其中發(fā)揮著重要的作用[7]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，歐亞旋覆花總黃酮對(duì)骨骼肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。歐亞旋覆花總黃酮作為中藥制劑，不存在排異反應(yīng);藥源廣泛，無明顯毒副作用;歐亞旋覆花總黃酮具有吸收迅速、分布廣泛的特點(diǎn)。因此，歐亞旋覆花總黃酮可應(yīng)用于骨骼肌缺血再灌注損傷的治療。

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【作者簡(jiǎn)介】楊昕宇，（1999-04），女，蒙，內(nèi)蒙古通遼市，本科，臨床藥學(xué)系。