蘿卜AHP基因家族鑒定與表達(dá)模式分析

銀珊珊 張寧 武春成 劉美妍 謝洋

摘? ? 要：細(xì)胞分裂素在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抵御系列非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。為了探討蘿卜（Raphanus sativus L.）細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AHP）的生物學(xué)功能與表達(dá)模式，對(duì)蘿卜AHP基因家族成員的數(shù)量、進(jìn)化關(guān)系、順式元件、基因結(jié)構(gòu)、發(fā)育及非生物脅迫下基因表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，蘿卜AHP基因家族有6個(gè)成員，其中RsAHP2和RsAHP5為片段重復(fù)基因，RsAHP3和RsAHP4為串聯(lián)重復(fù)基因;系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)蘿卜、擬南芥和白菜的AHP家族具有同源性;其啟動(dòng)子序列中含有光響應(yīng)、激素響應(yīng)和防御應(yīng)激等順式作用元件;蘿卜AHP均在根中表達(dá)量高而在葉中表達(dá)量低;不同非生物脅迫條件下，RsAHP1、RsAHP2和RsAHP5差異表達(dá)顯著。研究結(jié)果可為解析蘿卜AHP基因功能提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蘿卜;組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;非生物脅迫;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S631.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2021）08-007-08

Identification and expression pattern analysis of AHP gene family in radish

YIN Shanshan， ZHANG Ning， WU Chuncheng， LIU Meiyan， XIE Yang

（Hebei Key Laboratory of Horticultural Germplasm Excavation and Innovative Utilization/College of Horticulture Science and Technology， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066004， Hebei， China）

Abstract： Cytokinins play important roles in plant growth and development and resistance to a series of abiotic stresses. In order to explore the expression pattern and function of histidine phosphate transporters （AHP） of cytokinins signal transduction pathway in radish（Raphanus sativus L.）， the number of members， evolutionary relationships， cis element， gene structure， and gene expression patterns of radish AHP genes family under development and abiotic stress were analyzed . A total of six members in the AHP gene family of radish， and RsAHP2 and RsAHP5 were fragment duplicates， and RsAHP3 and RsAHP4 were tandem duplicates. Phylogenetic analysis showed that the AHP family of radish， Arabidopsis and Chinese cabbage share homology. There were many cis-acting elements in the promoter sequence of AHP gene in radish， which are resposive to light response， hormone response and stress response. The expression level of AHP gene family was high in roots but low in leaves. Under different abiotic stress conditions， RsAHP1， RsAHP2 and RsAHP5 in radish were significantly differentially expressed.The results could provide a theoretical basis for analyzing the function of AHP in radish.

Key words： Radish; Histidine phosphate transporter; Abiotic stress; Gene expression

細(xì)胞分裂素是六類重要植物激素之一，在細(xì)胞周期中起著重要作用，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[1]。細(xì)胞分裂素除了可以促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)發(fā)育外，還通過(guò)抑制植物中葉綠素、核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分解，將必需的氨基酸、激素、無(wú)機(jī)鹽等化合物重新分配到植物的其他部位，從而阻礙植物衰老[2]。越來(lái)越多的研究表明，細(xì)胞分裂素可以減輕脅迫對(duì)植物造成的傷害，但還不清楚在逆境脅迫下細(xì)胞分裂素響應(yīng)逆境的分子作用機(jī)制[3]。

在植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素信號(hào)傳遞是利用了一種類似于細(xì)菌中的雙元組分系統(tǒng)進(jìn)行的[4]。在細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，磷酸基團(tuán)的傳遞主要是通過(guò)3種蛋白協(xié)同完成，即組氨酸蛋白激酶（histidine kinases， HK）、磷酸轉(zhuǎn)移蛋白（arabidopsis histidine phosphotransfer proteins， AHP）以及反應(yīng)調(diào)節(jié)因子（response regulators， RR）[5]。其中AHP是在受體組氨酸激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)因子之間調(diào)控磷酸的轉(zhuǎn)移，AHP上保守的組氨酸位點(diǎn)接受來(lái)自細(xì)胞分裂素受體HK的磷酸基團(tuán)后，從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，隨后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移并定位于細(xì)胞核的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子RR上，從而激活下游基因的表達(dá)以完成信號(hào)傳遞[6]。

目前，對(duì)水稻、擬南芥、小麥、玉米等多種植物中的AHP基因家族研究較多[7-11]，但對(duì)蘿卜中的AHP基因家族還未有系統(tǒng)的研究。擬南芥的AHP1-5保守結(jié)構(gòu)基序?yàn)閄HQXKGSSXS，存在可被磷酸化的組氨酸殘基。AHP6中組氨酸（H）被天冬氨酸（N）代替，不具備磷酸轉(zhuǎn)移蛋白的活性，且對(duì)磷酸基團(tuán)的傳遞起負(fù)向調(diào)控作用[12]。擬南芥中組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AHP2、AHP3和AHP5均受鹽、干旱和ABA抑制表達(dá)，其三重突變體ahp2，3，5對(duì)鹽和干旱的耐受性也顯著高于野生型對(duì)照[13];擬南芥中AHP4對(duì)花藥內(nèi)壁次生細(xì)胞壁的增厚為負(fù)調(diào)控[14];擬南芥中AHP1、AHP2、AHP3在根中表達(dá)量多，在葉和莖中表達(dá)量很少[15];擬南芥中AHP2、AHP3、AHP5是細(xì)胞分裂素信號(hào)通路中CKI1下游促進(jìn)擬南芥雌配子體發(fā)育的主要因子[16]。在水稻中對(duì)AHP基因的研究表明，OsAHP1和OsAHP2受干旱抑制表達(dá)，其RNAi植株對(duì)干旱的耐受性也顯著高于野生型對(duì)照;相反，OsAHP1受鹽誘導(dǎo)表達(dá)，其RNAi植株對(duì)鹽的耐受性顯著低于野生型對(duì)照[17];在小麥中對(duì)AHP基因的研究表明，TaHP1在地上部上調(diào)表達(dá)，并對(duì)葉片衰老有抑制作用[18]。以上研究結(jié)果為篩選和鑒定蘿卜AHP基因家族及其相關(guān)研究提供了重要的思路。

蘿卜是重要的世界性蔬菜作物之一，屬十字花科一、二年生草本植物。非生物逆境如重金屬、鹽、熱、干旱、低溫和弱光等是限制蘿卜高效生產(chǎn)和育種的重要因素。AHP基因家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面和對(duì)逆境的響應(yīng)過(guò)程中都有參與[19-21]，因此筆者對(duì)蘿卜AHP基因家族進(jìn)行鑒定，系統(tǒng)分析其氨基酸特性、進(jìn)化關(guān)系、順式作用元件、基因結(jié)構(gòu)，并對(duì)其在不同時(shí)期不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究RsAHP的基因功能和提高植物的非生物脅迫耐受性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與非生物脅迫處理

試驗(yàn)于2021年2—3月在秦皇島河北科技師范學(xué)院園藝實(shí)驗(yàn)樓人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。將濰縣蘿卜（濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成品種，購(gòu)于昌邑市永昌種業(yè)有限公司）播種于V草炭∶V蛭石∶V珍珠巖=3∶1∶1的混合基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，在溫室中培養(yǎng)，溫度為25 ℃/16 ℃（晝/夜），光周期14 h（光）/8 h（暗）。將25 d 苗齡的幼苗進(jìn)行不同脅迫處理：干旱（3 d，田間持水量50%，中度干旱）、冷害（4 ℃，36 h）、遮光（3 d，完全遮光）和對(duì)照。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，每處理3次重復(fù)，混合取樣，收集處理后的葉子取0.2 g用于后續(xù) RNA 提取。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘿卜AHP基因家族成員鑒定與蛋白理化性質(zhì)分析 利用Pfam在線軟件 （http：//pfam.xfam.org/） 檢索擬南芥AHP蛋白，獲取AHP結(jié)構(gòu)特征序列的種子文件PF01627，隨后通過(guò)HMMER 3.0軟件以該種子文件為索引在蘿卜數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，獲得與該蛋白結(jié)構(gòu)特征相匹配的序列，即為蘿卜AHP家族候選成員[22]。利用NCBI （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線網(wǎng)站blastp驗(yàn)證已獲得的蘿卜AHP家族候選成員，具有AHP結(jié)構(gòu)域的候選蛋白即為蘿卜AHP家族成員，將編碼這些蛋白質(zhì)的基因定為RsAHP 基因。將蘿卜AHP家族成員的蛋白序列提交至ExPASy在線網(wǎng)站（http：//web.expasy.org/protparam/），運(yùn)行ProtParam程序，預(yù)測(cè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、亞細(xì)胞定位和三級(jí)結(jié)構(gòu)等相關(guān)的理化性質(zhì)。

1.2.2 蘿卜AHP基因家族染色體定位與共線性分析 利用Map Inspect軟件分析AHP家族基因在染色體上分布情況。在蘿卜基因組內(nèi)進(jìn)行 BLASTP 搜索（E< 1×10-5），利用 MCScanX 軟件進(jìn)行共線性區(qū)塊預(yù)測(cè)（閾值 ≤ 1×10-5）[23]。

1.2.3 蘿卜AHP基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 分別在蘿卜、擬南芥tair和Brassica數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//brassicadb.org/brad/geneFamily.php）下載蘿卜、擬南芥和白菜全基因組數(shù)據(jù)，獲取蘿卜、擬南芥和白菜AHP基因家族的蛋白序列，利用MEGA 6.0軟件，采用Neighbor-Joining方法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 蘿卜AHP基因順式作用元件預(yù)測(cè) 從蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中提取 RsAHP 基因上游 1000 bp 序列，提交至 PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(kù)，用于基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析。

1.2.5 蘿卜AHP家族成員基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析 利用Gene Structure Display Server（GSDS）（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線軟件展示蘿卜AHP基因家族各成員的基因結(jié)構(gòu)信息;利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）網(wǎng)站在線分析該家族共有的保守結(jié)構(gòu)。

1.2.6 蘿卜AHP基因的表達(dá)模式分析 植物總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄分別使用RNAprep Pure Plant Kit和FastKing RT Kit（With gDNase）（天根，中國(guó)），依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書提取植物總RNA，檢測(cè)合格后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物設(shè)計(jì)利用Beacon Designer 7.0 軟件設(shè)計(jì)（表1），內(nèi)參基因由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)蘿卜課題組提供。按照Super PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒（天根，中國(guó)）操作步驟加樣，在 LightCycler? 480 實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)（Roche，Germany）中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）及數(shù)據(jù)分析。利用前人報(bào)道的蘿卜RNA-Seq數(shù)據(jù)信息，獲取蘿卜生長(zhǎng)發(fā)育不同階段（7 、14 、20 、40 、60 、90 d）不同組織（皮層、形成層、木質(zhì)部、根和葉片） [24]以及鹽脅迫[25]、熱脅迫[26]、鉻脅迫[27]、鉛脅迫[28]和鎘脅迫[29]等脅迫下AHP家族基因及其表達(dá)量數(shù)據(jù)信息。基因表達(dá)水平用RPKM值表示，利用Cluster 3.0和Tree View軟件進(jìn)行蘿卜AHP家族基因表達(dá)量的熱圖制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜AHP基因家族成員鑒定、染色體定位與共線性分析

在蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，總共檢索到7條與AHP結(jié)構(gòu)序列特征相匹配的蛋白序列（E-value < 0.01）。去除序列結(jié)構(gòu)不完整蛋白（無(wú)起始密碼子或終止密碼子）和在NCBI中blastp （檢索物種Raphanus sativus L.和Arabidopsis thaliana）注釋信息都不是AHP結(jié)果的蛋白，最終確定6個(gè)AHP蛋白。根據(jù)序列匹配值由高到低，依次命名為RsAHP1～ RsAHP6。蘿卜AHP蛋白的分子質(zhì)量（MW）在17.3～19.9 kDa范圍內(nèi)，除了RsAHP（19.9 kDa）MW值在19 kDa以上，其余各蛋白MW值分布集中在17.3～17.6 kDa。理論等電點(diǎn)pI值分布在4.88～5.92之間不等，屬于酸性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)平均值為37.1（< 40.0），這說(shuō)明AHP蛋白結(jié)構(gòu)偏穩(wěn)定。預(yù)測(cè)蘿卜AHP蛋白均為親水性蛋白，并且亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核上（表2）。

利用Map Inspect軟件分析AHP家族基因在染色體上的分布情況?；騌sAHP2、RsAHP5和RsAHP6分別成功定位到蘿卜Chr1、Chr4和Chr9號(hào)染色體上，另外3個(gè)基因RsAHP1、RsAHP3和RsAHP4均未定位到9條染色體上，其中RsAHP2和RsAHP5屬于片段重復(fù)基因，RsAHP3和RsAHP4屬于串聯(lián)重復(fù)基因（圖1）。

2.2 蘿卜AHP基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

為揭示蘿卜AHP蛋白與十字花科作物擬南芥和白菜的AHP蛋白在進(jìn)化上的位置與親緣關(guān)系，利用MEGA 7.0軟件對(duì)蘿卜（Rs）、擬南芥（At）和白菜（Bra）的AHP蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖2可知，蘿卜、擬南芥和白菜AHP家族蛋白可以分為4個(gè)大的亞群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 和 Ⅳ），其中Ⅰ類亞群（11個(gè)成員）中，蘿卜RsAHP1、RsAHP2、RsAHP5和RsAHP6分別與白菜Bra028236/擬南芥AtAHP3、白菜Bra025394/擬南芥AtAHP2、白菜Bra036215/擬南芥AtAHP2和白菜Bra033398/擬南芥AtAHP5親緣關(guān)系最近;Ⅱ類亞群（4個(gè)成員）中，蘿卜RsAHP3和RsAHP4與白菜Bra023876/擬南芥AtAHP1親緣關(guān)系最近;而Ⅲ類亞群（3個(gè)成員）和Ⅳ類亞群（2個(gè)成員）均沒(méi)有蘿卜RsAHP家族成員。

2.3 蘿卜AHP基因順式作用元件分析

為了解蘿卜AHP基因的表達(dá)調(diào)控方式，筆者利用PlantCARE軟件對(duì)該基因家族啟動(dòng)子區(qū)（ATG上游1000 bp）的順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示，預(yù)測(cè)到的順式作用元件除了CAAT-box和TATA-box外，還包括激素響應(yīng)（7種，AuxRE、GARE-motif、TGA-element、ABRE、TGACG-motif、TCA-element、CGTCA-motif）、防御應(yīng)激與脅迫響應(yīng)（4種，TC-rich repeats、STRE、MYB、MYC）、干旱誘導(dǎo)（MBS）、光響應(yīng)（12種，ATC-motif、Gap-box、TCT-motif、Box 4、G-Box、GT1-motif、GA-motif、LAMP-element、GATA-motif、ACE、AE-box、chs-CMA1a）以及低溫響應(yīng)（LTR）等44種作用元件。其中激素響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件和光響應(yīng)元件所占比率較高，說(shuō)明激素調(diào)節(jié)、光環(huán)境和脅迫刺激在植物生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。其中，RsAHP1～RsAHP5序列中包含STRE和MYB脅迫響應(yīng)元件，RsAHP1、RsAHP2、RsAHP5、RsAHP6序列中包含MYC脅迫響應(yīng)元件，以上這些順式作用元件的表達(dá)與蘿卜耐脅迫生長(zhǎng)密切相關(guān)。

2.4 蘿卜AHP家族成員基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

利用GSDS和MEME網(wǎng)站分別在線分析蘿卜AHP家族成員基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域特征。由圖3可知，除RsAHP6基因含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子外，其余RsAHP基因均只含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子;蘿卜AHP家族蛋白均含有4個(gè)保守基序（Motif），即Motif1、Motif2、Motif3和Motif4。

2.5 蘿卜AHP基因在發(fā)育和非生物脅迫下的表達(dá)模式分析

基于Mitsui等[24]報(bào)道的RNA-Seq數(shù)據(jù)，提取RsAHPs家族基因在蘿卜生長(zhǎng)發(fā)育不同階段和不同組織中的RPKM表達(dá)量數(shù)據(jù)信息，利用Cluster 3.0軟件對(duì)其進(jìn)行聚類分析和Treeview軟件展示聚類結(jié)果。結(jié)果顯示，RsAHPs家族基因均在葉中表達(dá)量低，根中表達(dá)量高，尤其RsAHP5表達(dá)量最高，RsAHP2表達(dá)量次之，RsAHP3和RsAHP4表達(dá)量最低;其中RsAHP5在皮層、木質(zhì)部和形成層中表達(dá)量最高，RsAHP2在根中任意組織中表達(dá)量均相當(dāng)，而RsAHP1、RsAHP3和RsAHP4則是在根尖中表達(dá)量最高（圖4-a～b）。此外，通過(guò)維恩圖分析發(fā)現(xiàn)，RsAHP1、RsAHP2和RsAHP5在蘿卜根尖、木質(zhì)部、形成層、皮層和葉片中都高表達(dá)（RPKM > 5）（圖4-c）。

利用前人發(fā)表的蘿卜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取鹽脅迫、熱脅迫、鉻脅迫、鉛脅迫和鎘脅迫等非生物脅迫下AHP家族基因及其表達(dá)譜信息（歸一化表達(dá)水平）。結(jié)果表明，RsAHP1、RsAHP2和RsAHP5均響應(yīng)鹽脅迫、熱脅迫、鉻脅迫、鉛脅迫和鎘脅迫，且其表達(dá)模式略有差異。例如，RsAHP1在熱脅迫、鉻脅迫、鉛脅迫和鎘脅迫下均下調(diào)表達(dá)，而在鹽脅迫下為上調(diào)表達(dá);RsAHP2在鹽脅迫、鉻脅迫、鉛脅迫和鎘脅迫下均上調(diào)表達(dá)，而在熱脅迫下為下調(diào)表達(dá);RsAHP5在鹽脅迫、鉻脅迫、鉛脅迫和熱脅迫下均上調(diào)表達(dá)，而在鎘脅迫下為下調(diào)表達(dá)（圖5）。此外，RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下RsAHP1、RsAHP3和RsAHP4均顯著上調(diào)表達(dá)，較對(duì)照組表達(dá)量高5～9倍;RsAHP3和RsAHP4均對(duì)冷害與遮光無(wú)響應(yīng)，而RsAHP6對(duì)遮光響應(yīng)顯著且上調(diào)表達(dá)（圖6）。綜上，蘿卜AHP家族基因可能在響應(yīng)干旱、鹽、鉻、鉛、鎘等非生物脅迫方面表現(xiàn)出重要作用。

3 討論與結(jié)論

蘿卜是十字花科重要的根菜類蔬菜作物，是我國(guó)出口創(chuàng)匯的蔬菜之一[30]。蘿卜的產(chǎn)品器官肉質(zhì)直根是一種復(fù)合器官（變態(tài)器官），除了具有植物學(xué)根的特性以外，還有下胚軸發(fā)育而來(lái)的膨大肉質(zhì)直根[31]。蘿卜肉質(zhì)直根膨大形成發(fā)育的好壞直接關(guān)系到最終的產(chǎn)量與品質(zhì)的高低[32]。實(shí)質(zhì)上，蘿卜肉質(zhì)直根膨大形成是由細(xì)胞分裂（細(xì)胞數(shù)目）與細(xì)胞膨大（細(xì)胞體積）決定的，而細(xì)胞分裂素的合成、代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在蘿卜肉質(zhì)直根膨大形成過(guò)程中起到重要的作用[33]。研究已證實(shí)，AHP是細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子，可以將來(lái)自組氨酸激酶HK的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至位于細(xì)胞核的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子RR上，從而激活下游基因的表達(dá)以完成信號(hào)傳遞[6]。因此，開(kāi)展蘿卜AHP基因家族鑒定與功能分析等相關(guān)研究對(duì)于蘿卜品質(zhì)育種有重要理論意義。

隨著新一代測(cè)序（NGS）技術(shù)廣泛應(yīng)用，生物組學(xué)（omics）數(shù)據(jù)大量涌現(xiàn)。利用生物信息學(xué)技術(shù)將這些龐大數(shù)據(jù)信息進(jìn)行有效整合，將為挖掘植物重要性狀相關(guān)基因提供理論基礎(chǔ)[34]。筆者以蘿卜為研究對(duì)象，利用生物信息學(xué)技術(shù)，鑒定出6個(gè)蘿卜AHP基因家族成員（RsAHP1～RsAHP6）。其中，RsAHP2、RsAHP5和RsAHP6分別定位到蘿卜Chr1、Chr4和Chr9號(hào)染色體上，存在片段重復(fù)（RsAHP2/RsAHP5）和串聯(lián)重復(fù)（RsAHP3/RsAHP4）基因?qū)?，這對(duì)于蘿卜AHP基因家族的擴(kuò)張和植物更好地適應(yīng)外界環(huán)境變化提供了遺傳基礎(chǔ)。同時(shí)為了探究蘿卜AHP基因作用機(jī)制，分別提取蘿卜AHP家族基因的起始密碼子（ATG）上游1000 bp序列進(jìn)行順式作用元件分析。啟動(dòng)子序列分析表明激素響應(yīng)元件（7種，4/6）、脅迫響應(yīng)元件（4種，6/6）和光響應(yīng)元件（12種，6/6）種類所占比率較高、覆蓋蘿卜AHP家族成員個(gè)數(shù)較多，說(shuō)明激素調(diào)節(jié)、光環(huán)境和脅迫刺激在蘿卜肉質(zhì)根生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的物質(zhì)形態(tài)建成、激素和脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要的作用。

為了探究蘿卜AHP基因在植物發(fā)育不同時(shí)期不同組織及系列非生物脅迫條件下的功能，筆者對(duì)其在蘿卜生長(zhǎng)發(fā)育不同階段和不同組織以及鹽、熱、鉻、鉛、鎘、干旱、冷害、遮光脅迫下的表達(dá)譜進(jìn)行綜合分析。擬南芥中的AHP1、AHP2、AHP3在根中表達(dá)量多，在葉和莖中表達(dá)量很少[15]，基因表達(dá)譜分析表明蘿卜AHP家族基因均在葉中表達(dá)量低，根中表達(dá)量高，這與前人研究結(jié)果一致，尤其是RsAHP5在蘿卜皮層、木質(zhì)部和形成層中表達(dá)量最高，而RsAHP1、RsAHP3和RsAHP4在蘿卜根尖中表達(dá)量最高，說(shuō)明蘿卜AHP家族基因具有時(shí)空表達(dá)特性，且RsAHP5可能在蘿卜肉質(zhì)根膨大形成過(guò)程中細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起到重要作用。非生物脅迫條件下，蘿卜轉(zhuǎn)錄組分析表明RsAHP1、RsAHP2和RsAHP5均顯著差異表達(dá)，表明這些基因響應(yīng)了鹽、熱、鉻、鉛和鎘脅迫。在鹽脅迫條件下，擬南芥AtAHP2、AtAHP3和AtAHP5均受抑制表達(dá)，這與本研究中蘿卜RsAHP2和RsAHP5的表達(dá)模式相一致，但是與RsAHP1表達(dá)模式相反[13];水稻OsAHP1受鹽脅迫誘導(dǎo)，并且其RNAi植株耐鹽性減弱，這與蘿卜鹽脅迫下RsAHP1表達(dá)模式類似[17]，說(shuō)明RsAHP1可能對(duì)鹽脅迫響應(yīng)起正向調(diào)控作用。筆者還發(fā)現(xiàn)蘿卜在熱脅迫下，RsAHP5上調(diào)表達(dá)，RsAHP1和RsAHP2下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明熱脅迫下RsAHP5可能對(duì)熱耐性響應(yīng)起正向調(diào)控作用，這與前人證實(shí)的“大多數(shù)熱休克（HS）反應(yīng)蛋白因細(xì)胞分裂素的增加而增加”這一結(jié)論相一致[35]。此外，在重金屬脅迫下，蘿卜RsAHP2在鉻脅迫、鉛脅迫和鎘脅迫下均表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，表明RsAHP2可能在響應(yīng)和抵御重金屬脅迫方面具有正向調(diào)控作用。同時(shí)，非生物脅迫條件下，RsAHP3、RsAHP4和RsAHP6的表達(dá)無(wú)差異性變化，說(shuō)明蘿卜AHP家族基因可能在功能上存在冗余現(xiàn)象。蘿卜AHP基因?qū)Σ煌巧锩{迫的不同響應(yīng)，揭示了細(xì)胞分裂素信號(hào)因子與蘿卜非生物脅迫應(yīng)激反應(yīng)之間的復(fù)雜相互作用，其具體的相互關(guān)系需進(jìn)行更深入的試驗(yàn)論證。

筆者基于蘿卜基因組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和RT-qPCR分析結(jié)果，在全基因組水平上篩選鑒定蘿卜AHP家族基因，進(jìn)一步分析其氨基酸理化性質(zhì)、作用元件、進(jìn)化關(guān)系、發(fā)育與非生物脅迫下基因表達(dá)模式等。結(jié)果表明，鑒定到的6個(gè)蘿卜AHP基因家族成員（RsAHP1～RsAHP6）中存在片段重復(fù)（RsAHP2/RsAHP5）和串聯(lián)重復(fù)（RsAHP3/RsAHP4）基因?qū)?系統(tǒng)進(jìn)化分析表明蘿卜、擬南芥和白菜的AHP家族具有很強(qiáng)的同源性和保守性;蘿卜AHP基因啟動(dòng)子序列含有光響應(yīng)、激素響應(yīng)和防御應(yīng)激與脅迫響應(yīng)等多種順式作用元件;蘿卜AHP家族基因均在根中表達(dá)量高而在葉中表達(dá)量低，不同非生物脅迫條件下，RsAHP1、RsAHP2和RsAHP5表達(dá)差異顯著，表明蘿卜AHP基因家族與植物發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫有密切關(guān)系。本研究結(jié)果為深入挖掘響應(yīng)蘿卜非生物脅迫的AHP基因及其作用機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。

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