UPLC法同時(shí)測定感冒解痛散中10種成分的含量

張 丹，王小旭，謝賀賀

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2.北京德立福瑞醫(yī)藥科技有限公司，北京 102101)

感冒解痛散由荊芥、白芷、陳皮、蒼術(shù)、甘草和麻黃6味中藥制備而成，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十一冊，具有祛風(fēng)除濕散寒、宣肺化痰止咳的功效，主治風(fēng)寒咳嗽、鼻流清涕、惡寒無汗、頭痛身困等癥[1]。中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，臨床療效是多味藥材中多成分協(xié)同作用的結(jié)果，為保證中藥質(zhì)量，需對處方藥材的特征成分及有效成分進(jìn)行定量測定，同時(shí)需盡量涵蓋方中的大部分藥材。本處方中荊芥辛苦而溫、芳香而散，具有解表祛風(fēng)、鎮(zhèn)痛抗炎之功效，臨床主治風(fēng)寒感冒、咽喉腫痛等癥[2]；白芷祛風(fēng)散寒、宣痹止痛，為臣藥，為祛風(fēng)散寒、通竅止痛、燥濕止帶的要藥[3]；方中陳皮歸肺、脾經(jīng)，性溫味苦辛，能理氣健脾、燥濕化痰[4]；蒼術(shù)古稱赤術(shù)，氣芳香辛烈，能祛風(fēng)燥濕、通絡(luò)止痛[5]；麻黃苦辛性溫，善開腠發(fā)汗，祛在表之風(fēng)寒[6]；甘草清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥[7]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅采用理化鑒別法和薄層色譜(TLC)法定性分析麻黃成分，缺少定量分析指標(biāo)，無法全面、有效地控制該制劑的質(zhì)量。文獻(xiàn)報(bào)道僅有對感冒解痛散中橙皮苷的定量測定研究[8]，涉及藥材有限，本文選擇芹菜素、槲皮素、木犀草素、歐前胡素、異歐前胡素、橙皮苷、川陳皮素、蒼術(shù)素、甘草苷和鹽酸麻黃堿10種成分作為檢測指標(biāo)，利用超高效液相色譜法(UPLC)同時(shí)測定10種成分的含量，為制定和提升感冒解痛散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters超高效液相色譜儀(ACQUITY UPLC)儀，包括QSM二元溶劑管理器、二極管陣列檢測器(PDA)，SM-FTN樣品管理器、CH-A型柱溫箱和Empower3色譜工作站，美國Waters公司；ABS-135S型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(功率400 W，頻率50 kHz)，昆山超聲波儀器有限公司。

1.2試藥 對照品：芹菜素(批號(hào)111901-201603，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.2%)；槲皮素(批號(hào)100081-201610，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.1%)；木犀草素(批號(hào)111520-201605，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.6%)；歐前胡素(批號(hào)110826-201918，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.0%)；異歐前胡素(批號(hào)110827-201812，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.6%)；橙皮苷(批號(hào)110721-201918，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：96.3%)；蒼術(shù)素(批號(hào)111924-201906，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.7%)；甘草苷(批號(hào)111610-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：95.0%)；鹽酸麻黃堿(批號(hào)171241-201909，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.9%)，均購自中國食品藥品檢定研究院。川陳皮素(批號(hào)MUST-15090814，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.8%)，成都瑞芬思生物科技有限公司。荊芥(批號(hào)20181128，產(chǎn)地：安徽亳州)為唇形科植物荊芥SchizonepetatenuifoliaBrip.的干燥地上部分；白芷(批號(hào)180428，產(chǎn)地：河北安國)為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.etHook.f.或杭白芷Angelicadahurica(Fisch.Ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana (Boiss.) Shan et Yuan的干燥根；陳皮(批號(hào)20181227，產(chǎn)地：廣西)為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco.及其栽培變種的干燥成熟果皮；蒼術(shù)(批號(hào)190307，產(chǎn)地：安徽六安)，為菊科植物茅蒼術(shù)Atrac-tylodeslancea(Thunb.)DC.或北蒼術(shù)Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖；甘草(批號(hào)20190219，產(chǎn)地：陜西)為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖；麻黃(批號(hào)20190908，產(chǎn)地：甘肅)為麻黃科植物草麻黃EphedrasinicaStapf中麻黃EphedraintermediaSchrenket C.A.Mey.或木賊麻黃EphedraequisetinaBge.的干燥草質(zhì)莖。以上藥材經(jīng)鑒定均為真品。感冒解痛散(批號(hào)分別為：1801015、1801208、1900122、1903206、1900523、1900619，規(guī)格:10 g·袋-1)，吉林天益藥業(yè)有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，MERCK公司；磷酸(色譜純)，天津益仁達(dá)科技有限公司；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Waters XTERRA C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)。流動(dòng)相：乙腈(A)-8 mL·L-1磷酸(含0.1 mL·L-1三乙胺)(B)，梯度洗脫(0～6 min，12%A～36%A；6～10 min，36%A～52%A；10～16 min，52%A～78%A；16～18 min，78%A；18～20 min，78%A～12%A)。流速為0.2 mL·min-1；檢測波長：0～4 min 237 nm(甘草苷)、4～6 min 215 nm(鹽酸麻黃堿)、 6～10 min 360 nm(芹菜素、槲皮素、木犀草素、橙皮苷)、10～12 min 326 nm(川陳皮素)、12～16 min 249 nm(歐前胡素、異歐前胡素)、16～20 min 336 nm(蒼術(shù)素)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL[9-11]。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 精密稱取10種對照品適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為144.8、310.4、140.3、907.8、963.5、324.9、466.7、313.6、151.4、136.2 μg·mL-1的混合對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2供試品溶液 取感冒解痛散5袋，研勻，精密稱取2.0 g，置于100 mL棕色量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇80 mL，室溫超聲處理(400 W，40 kHz)45 min，取出，放冷至室溫，用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，以8 500 r·min-1離心5 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3陰性對照溶液 按照感冒解痛散的工藝方法分別制備缺荊芥、白芷、陳皮、蒼術(shù)、甘草、麻黃的陰性樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取2.2項(xiàng)下制備的溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果理論塔板數(shù)均大于8 500，10種有效成分與相鄰色譜峰之間的分離度大于1.5，10種有效成分色譜峰對稱因子在0.99～1.05之間。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL，分別置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液。按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，10種成分在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；將對照品溶液逐級(jí)稀釋后，以信噪比(S/N)為10時(shí)的質(zhì)量濃度為各成分的定量限(LOQ)，以信噪比(S/N)為3時(shí)的質(zhì)量濃度為各成分的檢測限(LOD)。結(jié)果見表1。

表1 10種有效成分的回歸方程及線性范圍

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果10種成分峰面積的RSD值(n=6)分別為0.49%、0.51%、0.63%、0.42%、0.39%、0.59%、0.61%、0.72%、0.54%、0.68%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下制備的供試品溶液(批號(hào)1903206)，分別于制備后0、5、10、15、20、24 h按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果10種成分峰面積的RSD值(n=6)分別為0.79%、0.92%、1.05%、0.88%、1.02%、0.91%、0.75%、1.04%、0.82%、0.97%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取感冒解痛散(批號(hào)1903206)6份，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果樣品中10種成分的平均含量分別為0.130 6、0.300 2、0.111 3、0.625 8、0.731 2、0.262 3、0.351 4、0.211 7、0.089 2、0.074 5 mg·g-1，含量的RSD值 (n=6)分別為0.59%、0.91%、0.84%、0.77%、1.03%、0.89%、0.96%、1.11%、1.07%、1.24%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取含量已知的感冒解痛散(批號(hào)1903206)6份，每份1.0 g，分別置于100 mL棕色量瓶中，精密加入混合對照品溶液(10種成分質(zhì)量濃度分別為0.025 3、0.056 6、0.022 2、0.119 8、0.139 4、0.052 2、0.069 1、0.040 2、0.017 6、0.014 3 mg·mL-1)5.5 mL，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計(jì)算得平均回收率在98.51%～100.95%范圍內(nèi)，RSD值分別為0.73%、0.54%、1.08%、0.52%、0.90%、0.91%、0.75%、0.51%、0.62%、0.64%(n=6)，結(jié)果表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，見表2。

表2 10種成分的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.5樣品含量測定 取感冒解痛散6批，分別按照2.2.2項(xiàng)下方法平行制備3份供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖及峰面積，結(jié)果見表3。

表3 各成分的含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇 感冒解痛散中荊芥為君藥，其中的芹菜素、槲皮素、木犀草素等黃酮類化學(xué)成分具有抗炎解熱、抗氧化、抗腫瘤的藥理活性；香豆素類是白芷中生物活性最強(qiáng)的成分，最具代表性的是歐前胡素和異歐前胡素，具有抑制細(xì)菌、霉菌和清除氧化自由基的作用；研究表明，陳皮中二氫黃酮類橙皮苷和甲氨基黃酮苷類川陳皮素為主要有效成分，具有抗病毒、抑制炎癥、抗菌等藥理作用；蒼術(shù)中蒼術(shù)素屬于聚乙烯炔類化合物，具有抗炎、利膽等作用，但其具有呋喃環(huán)，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，應(yīng)避光操作；甘草的含量測定指標(biāo)為黃酮類化學(xué)成分甘草苷，在抗腫瘤、抗氧化、抗病毒方面作用顯著。麻黃的主要活性成分為鹽酸麻黃堿，是國家規(guī)定需要嚴(yán)格控制的毒、麻類成分，如果長期大量使用，會(huì)產(chǎn)生失眠、震顫、心悸等不良反應(yīng)，感冒解痛散現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)尚未將鹽酸麻黃堿的含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)。本研究參照《中國藥典》2015年版對感冒解痛散中6味藥材的指標(biāo)成分進(jìn)行控制，最終選擇性質(zhì)穩(wěn)定、含量測定重復(fù)性好、藥效確切的芹菜素、槲皮素、木犀草素、歐前胡素、異歐前胡素、橙皮苷、川陳皮素、蒼術(shù)素、甘草苷和鹽酸麻黃堿10種成分作為感冒解痛散的質(zhì)量控制指標(biāo)[12-14]。

3.2液相色譜儀的考察 高效液相色譜在中藥學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，隨著各種分析技術(shù)的不斷革新，分析技術(shù)更加精細(xì)。近幾年在HPLC的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)了UPLC技術(shù)，借助于HPLC的原理，涵蓋了填料顆粒小、進(jìn)樣體積少、流速低及檢測速度快等全新技術(shù)，相對于HPLC具有更好的分離效果、峰容量和靈敏度。本實(shí)驗(yàn)以感冒解痛散為研究對象，分別考察HPLC色譜儀和UPLC色譜儀，結(jié)果UPLC法相比HPLC法不僅顯著縮短了分析時(shí)間(由70 min縮短到20 min)，且各主要成分的分離效果更好，靈敏度更強(qiáng)，測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于感冒解痛散的質(zhì)量控制[15-16]。

3.3色譜條件的優(yōu)化 采用PAD檢測器在190～400 nm全波長進(jìn)行了篩選；對Waters XTERRA C18(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)、Agilent Zorbax C18(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)等色譜柱進(jìn)行了篩選；對乙腈-水、乙腈-磷酸(1、5、8 mL·L-1)溶液及含不同量(0.1、0.5、1.0 mL·L-1)的三乙胺、甲醇-磷酸(1、5、8 mL·L-1)系統(tǒng)進(jìn)行了不同梯度洗脫條件優(yōu)選；對不同柱溫(25、30、35 ℃)進(jìn)行了優(yōu)選；為提高測定的專屬性、準(zhǔn)確度和靈敏度，最終選擇分段變換波長檢測法對10種化學(xué)成分進(jìn)行測定并優(yōu)化得到了本研究所需的色譜條件。

目前關(guān)于感冒解痛散中有效成分的含量測定文獻(xiàn)資料較少，本文建立了UPLC法同時(shí)測定感冒解痛散中10種成分的含量，與HPLC法相比大大縮短了分析時(shí)間，經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率等方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果準(zhǔn)確、有效，可為感冒解痛散的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。