食品中金黃色葡萄球菌檢測(cè)能力驗(yàn)證的結(jié)果與分析

董慧明

摘 要：為提高微生物實(shí)驗(yàn)室金黃色葡萄球菌的檢測(cè)能力，于2020年參加乳粉中金黃色葡萄球定量檢測(cè)能力驗(yàn)證，依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）進(jìn)行檢驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)用科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色平板和3M金黃色葡萄球菌測(cè)試片作為對(duì)照手段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并應(yīng)用VITEK2進(jìn)行生化鑒定，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，樣品CODE TF02490061結(jié)果報(bào)告為1 100 CFU/g、樣品CODE TF02490062結(jié)果報(bào)告為4 800 CFU/g，反饋結(jié)果為滿意，z值均<2。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌;能力驗(yàn)證;平板計(jì)數(shù)

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種食源性病原菌，為無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛的革蘭氏陽(yáng)性球菌。金黃色葡萄球菌是食品致病菌污染主要的病原菌，其產(chǎn)生的腸毒素可引起食物中毒，導(dǎo)致腹瀉和上呼吸道感染[1];該菌也可以引起局部化膿炎癥感染、肺炎、心包炎等，甚至導(dǎo)致敗血癥、膿毒癥等全身感染[2]。

能力驗(yàn)證活動(dòng)是利用實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力[3]。為有效提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平和人員技術(shù)能力，遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心于2020年參加了中國(guó)食品藥品檢定研究院組織的乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)（NIFDC-PT-249）能力驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 樣品

待測(cè)能力驗(yàn)證樣品為兩件，每件樣品由1個(gè)菌球及相應(yīng)奶粉組成，編碼分別為CODE TF02490061、CODE TF02490062。在生物安全柜內(nèi)將金黃色葡萄球菌樣品的西林瓶打開，將西林瓶?jī)?nèi)小球加入到225 mL無(wú)菌生理鹽水稀釋液中，充分溶解，然后再將與西林瓶相同編碼的奶粉樣品加入到上述稀釋液中，充分均質(zhì)混勻。依此方法，分別對(duì)2件樣品進(jìn)行處理。

1.2 試劑和儀器

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538及表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC12228，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物有限公司;Baird-Parker平板（B-P平板）、0.85%無(wú)菌生理鹽水、平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）、革蘭氏染色液、腦心浸出液肉湯（BHI），均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;凍干兔血（美國(guó)BD公司）;漿金黃色葡萄球菌顯色平板（法國(guó)科瑪嘉公司）;金黃色葡萄球菌測(cè)試片（美國(guó)3M公司）;革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌鑒定卡（GP卡）（法國(guó)梅里埃公司）。

A2型生物安全柜（美國(guó)NUAIRE公司）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder公司）;生物顯微鏡（日本奧林帕斯公司）;高壓滅菌鍋（日本Tomy公司）;均質(zhì)器（法國(guó)梅里埃公司）;VITEK 2全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)（法國(guó)梅里埃公司）。

1.3 方法

依據(jù)作業(yè)指導(dǎo)書及《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）[4]第二法平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)用科瑪嘉金葡顯色平板和金葡測(cè)試片作為對(duì)照手段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，金葡顯色平板每皿接種量為0.1 mL，3M金葡測(cè)試片每片接種量為1 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 典型菌落計(jì)數(shù)

金黃色葡萄球菌在B-P平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤(rùn)、菌落直徑為2～3 mm，顏色灰黑至黑色，有光澤，周圍有不透明圈（沉淀環(huán)），其外有一透明圈（卵磷脂環(huán)），菌落有黃油樣粘稠感;在金葡顯色培養(yǎng)基上顯紫紅色，其他菌顯藍(lán)綠色或無(wú)色;在3M金葡測(cè)試片上為紫紅色點(diǎn)，需要確認(rèn)片進(jìn)行確認(rèn)。典型菌落特征見圖1。

選擇同一稀釋度所有典型菌落數(shù)合計(jì)在20～200 CFU的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。金黃色葡萄球菌3種計(jì)數(shù)方法結(jié)果見表1，可見3種方法結(jié)果無(wú)明顯差異，3個(gè)結(jié)果都在同一數(shù)量級(jí)上。

2.2 確證試驗(yàn)（鑒定）

從CODETF02490061和CODE TF02490062適宜稀釋度的B-P平板典型菌落中選取5個(gè)菌落，分別做革蘭氏染色鏡檢和血漿凝固酶試驗(yàn)，并應(yīng)用VITEK2進(jìn)行生化鑒定，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2.1 染色鏡檢

取典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性球菌，直徑為0.5～1.0 μm，顯微鏡下排列成葡萄串狀排列。

2.2.2 血漿凝固酶試驗(yàn)

挑取B-P平板上典型菌落5個(gè)，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)，同時(shí)以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538和表皮葡萄球菌ATCC12228的肉湯培養(yǎng)物作對(duì)照，典型菌落和陽(yáng)性菌株對(duì)照血漿凝固酶試驗(yàn)均在2 h產(chǎn)生凝固，陰性菌株對(duì)照菌株觀察6 h不產(chǎn)生凝固。典型菌落均為血漿凝固酶陽(yáng)性，陽(yáng)性比例為100%。

2.2.3 VITEK2生化鑒定

將挑取B-P平板上典型菌落劃線接種至PCA平板，36 ℃

培養(yǎng)24 h，取新鮮培養(yǎng)的菌落進(jìn)行VITEK2生化儀器鑒定，鑒定結(jié)果均為金黃色葡萄球菌，說(shuō)明B-P平板對(duì)金黃色葡萄球菌的選擇性非常好，特征明顯能夠明確區(qū)別于其他葡萄球菌。

2.3 結(jié)果報(bào)告及反饋

以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果為本次能力驗(yàn)證的報(bào)告結(jié)果，即證實(shí)為金黃色葡萄球菌菌落陽(yáng)性比例乘以相應(yīng)稀釋度B-P平板計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，為樣品中金黃色葡萄球菌結(jié)果報(bào)告數(shù)，單位為CFU/g。編號(hào)CODE TF02490061樣品結(jié)果報(bào)告為1 100 CFU/g，編號(hào)CODE TF02490062樣品結(jié)果報(bào)告為4 800 CFU/g。

經(jīng)能力驗(yàn)證組織機(jī)構(gòu)反饋，本實(shí)驗(yàn)室CODE TF02490061

金黃色葡萄球菌的檢測(cè)結(jié)果為3.041，指定值為3.176，z值為-0.5;CODE TF02490062金黃色葡萄球菌的檢測(cè)結(jié)果為3.681，指定值為3.712，z值為-0.1;z值均<2，兩個(gè)樣品的結(jié)果評(píng)價(jià)為滿意。

3 結(jié)論與討論

本能力驗(yàn)證中采用多種方法同步進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢測(cè)，以保證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。3種計(jì)數(shù)方法結(jié)果無(wú)明顯差異，3個(gè)結(jié)果均在同一數(shù)量級(jí)上，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確無(wú)誤，B-P平板與金葡顯色平板計(jì)數(shù)結(jié)果相近，而3M金葡測(cè)試片計(jì)數(shù)結(jié)果略低。金葡測(cè)試片中相對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分較少，且含有抑制其他菌生長(zhǎng)的物質(zhì)[5]，故其檢測(cè)結(jié)果略低。最后的結(jié)果報(bào)告以B-P平板上菌落數(shù)為主，金葡顯色平板和3M金葡測(cè)試片上的菌落數(shù)為參考，經(jīng)反饋兩個(gè)樣品的結(jié)果評(píng)價(jià)為滿意。

金黃色葡萄球菌檢測(cè)的關(guān)鍵控制點(diǎn)，①在實(shí)驗(yàn)前將B-P平板提前放在培養(yǎng)箱中，使平板表面干燥。涂布時(shí)用L棒小心涂勻，注意不要觸及平板邊緣，涂布后先正置培養(yǎng)，保證水分完全吸收后再倒置培養(yǎng)，以免細(xì)菌在平板邊緣縫隙生長(zhǎng)，影響觀察計(jì)數(shù)。②進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)時(shí)，以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538和表皮葡萄球菌ATCC12228的肉湯培養(yǎng)物作對(duì)照，典型菌落和陽(yáng)性菌株對(duì)照血漿凝固酶試驗(yàn)應(yīng)在6 h內(nèi)產(chǎn)生凝固，陰性菌株對(duì)照菌株觀察6 h不產(chǎn)生凝固，以確保血漿凝固酶試驗(yàn)準(zhǔn)確。

參考文獻(xiàn)

[1]曾博雅.食品微生物金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)能力驗(yàn)證[J].現(xiàn)代食品，2020（11）：176-177.

[2]劉云國(guó).食品衛(wèi)生微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)鑒定圖譜[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

[3]中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).能力驗(yàn)證規(guī)則：CNAS-RL02：2018[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018.

[4]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)：GB 4789.10—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[5]范田麗，付曉靜，吳海江.金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果與分析[J].現(xiàn)代食品，2020（3）：196-198.