重組別藻藍蛋白的超快能量傳遞過程

甄張赫，朱銳丹，秦松，陳海龍，蒲洋，翁羽翔2,*，李文軍*

( 1.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003；2.中國科學院大學，北京 100049；3.中國科學院物理研究所 北京凝聚態(tài)物理國家研究中心/軟物質物理重點實驗室，北京 100190；4.中國科學院海洋大科學研究中心，山東 青島 266071；5.魯東大學 農(nóng)學院，山東 煙臺 264025)

1 引言

藻類進行光合作用的第1步是捕捉光能并將光能傳遞至光合反應中心，該過程是由藻類捕光蛋白完成的[1]。藻膽體是藍藻和紅藻中非常重要的捕光復合體，主要由桿結構和核結構兩部分組成[2-3]。藻膽體的桿結構可以幫助藻類在水下的弱光環(huán)境高效地捕捉光能，而藻膽體的核結構可以將桿結構捕捉的光能以95%以上的效率傳遞至光合反應中心[4-5]。

別藻藍蛋白（allophycocyanin，APC）三聚體是紅、藍藻藻膽體核結構的主要組成成分之一[6]。晶體結構揭示（圖1），APC三聚體是由3個單體組成的厚約為3 nm，直徑約為13 nm的圓盤狀結構，中央存在1個直徑約為3.5 nm的可插入連接蛋白的空腔[7-8]。APC三聚體每個單體包含1個α亞基和1個β亞基，每個α亞基和β亞基的Cys84位點都結合有1個藻藍膽素（phycocyanobilin，PCB），這些 PCB 可以與氨基酸共同構成發(fā)色團，發(fā)色團參與了APC的捕光和能量傳遞[9]。

圖1 別藻藍蛋白三聚體晶體結構圖Fig.1 Allophycocyanin trimer crystal structure

雖然APC三聚體只結合有6個PCB，但APC三聚體內部的能量傳遞卻非常快速[10]。APC三聚體Cys84位點上的兩個發(fā)色團結構與藍藻的藻藍蛋白（Cyanobacteria-phycocyanin，C-PC）三聚體 Cys84位點上的兩個發(fā)色團的結構相似，但是APC三聚體電子弛豫的速度是C-PC的10倍[7,11]。APC三聚體的能量吸收光譜從620 nm傳遞到650 nm的時間約為200～600 fs[12-13]。這種快速的能量傳遞方式被認為與APC相鄰單體之間的兩個發(fā)色團（β84PCB，α84PCB）的強耦合相關。由于強耦合作用產(chǎn)生了電子態(tài)的能級分裂，導致激發(fā)態(tài)波函數(shù)在兩個色素分子間離域，并加速了能量傳遞進程[9]。在其他文獻報道的超快時間分辨光譜的動力學分析中，均擬合有10～30 fs的超短時間常數(shù)。通常認為，這可能反映了激子態(tài)上的弛豫時間[9]。并且，有研究發(fā)現(xiàn)[14]，APC的初始各向異性明顯大于0.4，這證明APC三聚體中存在著相干激發(fā)態(tài)的色素分子對。目前，有觀點認為，在隱藻藻膽蛋白PE545以及PC645中存在的強耦合色素分子對導致了量子相干節(jié)拍的產(chǎn)生，且部分離域振動可使能量傳遞速率增強[15-16]。因此，別藻藍蛋白中存在的強激子耦合可能也會引發(fā)相干能量轉移，以加速并輔助APC的定向能量轉移，這可能是藻膽體核心結構高效并快速轉移能量的主要原因[14]。但是3種機制是如何相互配合的，一直以來是APC高效傳能的研究熱點和難點。

研究APC的高效光能傳遞規(guī)律，需要具備高純度的APC亞基、單體和三聚體等，如果從藍藻中制備，需要引入SDS、尿素或者極端pH作為蛋白質變性條件，這個過程雖然能獲得部分單體或者亞基，但是獲得的亞基、單體和三聚體等往往出現(xiàn)降解，產(chǎn)生混合物，如果加大變性條件，又會損傷APC的發(fā)色團空間結構，造成測試結果的不準確甚至錯誤。此外，目前一些報道所用的APC樣品為商品化的凍干蛋白粉末，凍干、復溶等步驟都有可能對蛋白構象造成不易覺察的傷害，從而導致色基微環(huán)境發(fā)生變化。所以，APC自組裝過程中，藻膽素分子的構象變化是否影響色素耦合狀態(tài)，進一步改變藻膽素分子的能量狀態(tài)一直是研究APC高效傳能的瓶頸。

針對APC高效傳能機制以及對APC自組裝過程中藻膽素及傳能關系的研究，本文以重組異源表達[17-18]的具有和天然APC一樣結構特性和穩(wěn)態(tài)光譜特性的重組別藻藍蛋白（recombinant allophycocyanin，rAPC）單體和三聚體為實驗材料[17,19-20]，通過各種穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)光譜技術對rAPC三聚體不同時間尺度的能量傳遞過程進行了檢測，探究rAPC自組裝過程中，藻膽素分子的構象變化，其產(chǎn)生的色素耦合狀態(tài)是否會改變藻膽素分子的能量狀態(tài)；探究重組rAPC自組裝過程中，伴隨結構和構象的變化，長距離的福斯特共振能量轉移機制（f?ster resonance energy transfer，F(xiàn)RET)、短距離的激子耦合理論（dexter mechanism）以及空間離域的“相干態(tài)傳能”3種機制是如何相互配合以實現(xiàn)APC的高效能量傳遞。這將為繼續(xù)深入研究rAPC激發(fā)態(tài)的能量傳遞過程，揭示藻膽體核心高效快速的能量轉移機制提供了數(shù)據(jù)基礎。

2 材料與方法

2.1 樣品準備及鑒定

將本實驗室自構建的含有rAPC質粒的生物工程大腸桿菌接種于含卡那霉素（索萊寶，北京）（濃度：50 μg/mL）及壯觀霉素（麥克林，上海）（濃度：50 μg/mL）的 LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基（索萊寶，北京）中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日以1%接種量重新接種至LB培養(yǎng)基中（含抗性），37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期（OD600nm約為0.7）（OD為光吸收密度），然后加入IPTG（索萊寶，北京）（濃度：0.5 mmol/L），28℃ 過夜誘導表達。18 h后離心（12 000×g，2 min）收集菌體。此時，對誘導前后的菌體以熒光顯微鏡（Olympus BX51，日本）進行藍光和綠光激發(fā)，并采集熒光發(fā)射圖。其中質粒構建、蛋白表達及誘導的方法參考Liu等[17]的方法。

將菌體用20 mmol/L的緩沖鹽緩沖液（pH：6.0）重懸（濃度：0.1 g/mL），以細胞超聲破碎儀（功率：300 W）（新芝，寧波）破碎（破碎3 s，停止5 s）至重懸液均一。破碎后離心（10 000×g，30 min，4℃）并收集上清液。上清液用孔徑為0.22 μm濾膜過濾后，通過重力法過Ni-IDA瓊脂糖凝膠柱（康為世紀，中國北京）進行純化。對純化收集得到的rAPC通過30 kD超濾管（Millipore，美國）濃縮去咪唑，然后通過不連續(xù)蔗糖梯度密度（蔗糖密度依次為：0.3 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L）繼續(xù)進行純化，離心力為 200 000×g，溫度為 4℃，時間為 21 h。rAPC純化方法參考Liu等[17]、李文軍等[20]的方法。對收集的藍色rAPC三聚體蛋白進行各種光譜檢測，同時對蛋白進行SDS-PAGE蛋白膠鑒定。部分rAPC三聚體用于制備rAPC單體，參考Liu等[17]的方法，設置rAPC單體為寬帶泵浦探測的對照組。

2.2 光譜特性測定

用Agilent Cary 60 紫外吸收光譜儀對rAPC進行250～800 nm的全波長掃描，用Agilent Cary Eclipse熒光光譜儀測定rAPC的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長為620 nm。用Chirascan plus的圓二色光譜儀對rAPC三聚體進行180～260 nm的紫外區(qū)掃描以及250～750 nm的可見光區(qū)掃描，光徑均為1 mm。

2.3 時間分辨光譜探測

為了探測rAPC的超快時間分辨?zhèn)髂苓^程，自行研制的非共線光參量放大器（NOPA）被用于進行寬帶泵浦探測，NOPA裝置具體參數(shù)參考Zhu等[21]，王云鵬等[22]的方法。NOPA寬帶脈沖覆蓋范圍為550～760 nm，該范圍覆蓋了rAPC的吸收范圍。NOPA的脈沖寬度為11 fs，可用于檢測大于11 fs的傳能過程。其泵浦源是光譜中心為800 nm的35 fs摻鈦藍寶石脈沖激光放大器（Spitfire Ace; Spectra-Physics），重復頻率為1 kHz。rAPC樣品的最大吸光度OD值控制在0.3～0.4之間，樣品厚度為1 mm。

3 結果和討論

3.1 rAPC三聚體蛋白表達、純化及成分鑒定

當rAPC在大腸桿菌中被誘導表達后，如圖2a和圖2b所示，菌體呈現(xiàn)綠色，這是rAPC的藍色和大腸桿菌的黃色疊加色。收集誘導前和誘導后的菌體，發(fā)現(xiàn)誘導后的菌體受表達的rAPC的顏色影響呈天藍色，誘導前的菌體依然是大腸桿菌原本的淡黃色。通過藍光和綠光對菌體進行激發(fā)，結果如圖2a所示，誘導前的菌體對藍光和綠光均無反應。而誘導后的菌體在藍光下無反應，但是在綠光下被激發(fā)出紅色的熒光，紅光的光譜區(qū)間位于625～740 nm[23]，這符合APC三聚體可于660 nm處產(chǎn)生熒光發(fā)射的光譜特性[24]，說明rAPC誘導表達成功。

圖2 誘導后菌體的穩(wěn)態(tài)光譜及熒光性質變化Fig.2 Steady-state spectra and fluorescence properties of induced bacteria

以誘導前的菌體為基線，對誘導后的大腸桿菌進行全波段穩(wěn)態(tài)吸收光譜掃描，如圖2b所示，在652 nm處有明顯的吸收峰，以600 nm為激發(fā)波長測量菌體的熒光發(fā)射光譜，最大熒光發(fā)射峰位于660 nm處。該結果符合rAPC三聚體的光譜特征[25]，證明了rAPC在大腸桿菌中被成功的誘導表達且其表達的α亞基和β亞基已經(jīng)成功組裝成為三聚體。

通過不連續(xù)蔗糖密度梯度離心對rAPC進行純化的結果如圖3a所示。少量rAPC單體位于0.6 mol/L蔗糖分層處，多數(shù)的rAPC三聚體位于0.8 mol/L蔗糖分層處。rAPC三聚體呈天藍色（圖3b）。蔗糖密度分離結果說明，異源表達的rAPC多數(shù)可組裝成為三聚體，但是可能由于其兩個亞基的表達比例不平衡，或部分亞基組裝有誤導致部分單體不能成功組裝成三聚體。吸取rAPC三聚體進行SDS-PAGE蛋白膠鑒定，結果證實rAPC三聚體α亞基和β亞基的分子量分別約為 21 kD 和 19 kD（圖3c）[7,26]。

圖3 rAPC三聚體純化及亞基鑒定Fig.3 Purification and composition identification of rAPC trimer

3.2 rAPC三聚體穩(wěn)態(tài)光譜特性

rAPC三聚體的穩(wěn)態(tài)吸收光譜（圖4a）顯示，在可見光區(qū)650 nm處存在1個特征吸收峰，620 nm及590 nm處存在吸收肩峰，這與二階導數(shù)顯示的吸收峰趨勢一致。而rAPC單體僅在620 nm處存在一個吸收峰。二階導數(shù)吸收光譜確認吸收峰趨勢與穩(wěn)態(tài)吸收光譜一致（圖4a）。其中，rAPC三聚體650 nm處的特征吸收峰與天然APC三聚體的吸收光譜一致[14,24,27]。有研究人員認為，APC三聚體中的β84PCB通過與周圍氨基酸的相互作用而導致的吸收光譜紅移至650 nm，而α84PCB則保留原有構象，吸收峰依舊為620 nm[28-31]。但也有少數(shù)觀點認為，光譜紅移是由于α84PCB的構象發(fā)生了變化[25]。但是考慮到β亞基進化上更為保守，關于β亞基構象變化的晶體學數(shù)據(jù)也更加充分，目前多數(shù)觀點支持前者的結論，且認為在rAPC三聚體中能量遵循FRET，可以從α84PCB傳遞至β84PCB。除了FRET能量轉移機制，也有觀點認為，吸收峰紅移至650 nm是由于激子耦合理論導致，也就是說是由于相鄰單體之間的兩個發(fā)色團之間的距離小于20 ?而發(fā)生的強耦合導致[32-33]。目前公認的觀點是，在APC三聚體的能量傳遞過程中，F(xiàn)RET和激子耦合能量轉移共同存在。值得注意的是，rAPC三聚體620 nm處的吸收肩峰，對比天然APC三聚體，該峰更明顯一些。我們認為，這是由于在蛋白溶液中存在少量未組裝成三聚體的單體或由三聚體解聚的游離單體導致。rAPC三聚體在590 nm處的吸收肩峰，雖在其他的數(shù)據(jù)中均也有被觀測到，但對于它的解釋較少。結合本實驗及其他文章報道的圓二色（Circular Dichroism, CD）光譜數(shù)據(jù)（詳見3.3節(jié)），我們認為，該處可能存在弱耦合的能量傳遞過程[12-13,20,34]。此外，在近紫外區(qū)340～370 nm附近還存在藻膽素的特征吸收峰[35-36]。

圖4 rAPC單體和三聚體的穩(wěn)態(tài)吸收光譜及熒光發(fā)射光譜Fig.4 Steady-state absorption spectra and fluorescence spectra of rAPC trimer

rAPC單體和三聚體的穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)射光譜顯示（圖4b），以600 nm激發(fā)rAPC單體，rAPC單體的最大熒光發(fā)射峰位于640 nm處，而rAPC三聚體的最大熒光發(fā)射峰位于663 nm（圖4），這是APC三聚體的特征熒光發(fā)射峰，證明了rAPC三聚體組裝成功，該結果與其他報道一致。在720 nm左右存在一個熒光發(fā)射肩峰，這被認為可能對應1 200 cm-1附近的電子振動耦合躍遷[13-14,16]。

3.3 rAPC三聚體圓二色光譜特性

對rAPC三聚體進行CD紫外區(qū)和可見光區(qū)的光譜探測，設定rAPC單體為對照組。紫外區(qū)可反映rAPC的二級結構的組裝情況，可見光區(qū)則可反映rAPC色基微環(huán)境的變化[37]。

分析rAPC單體及三聚體CD的紫外區(qū)光譜（圖5a），發(fā)現(xiàn)兩者具有一樣的光譜特性，均在209 nm和222 nm處表現(xiàn)出吸收特征，這說明rAPC單體組裝成三聚體的過程不影響蛋白質的二級結構。在CD光譜中，209 nm和222 nm反映的是α螺旋結構，β折疊則反映在216 nm處[38-39]。因此，本實驗結果揭示了rAPC主要以α螺旋結構為主，不存在β折疊結構。

圖5 rAPC單體和三聚體的CD光譜Fig.5 CD spectra of rAPC monomer and trimer

對rAPC單體和三聚體CD的可見光區(qū)光譜進行探測發(fā)現(xiàn)（圖5b），rAPC單體CD可見光區(qū)的光譜僅顯示了619 nm處的正峰以及344 nm處的負峰。相比而言，rAPC三聚體的CD可見光區(qū)光譜則顯示出了更多的峰：659 nm和612～616 nm處存在兩個正峰，643 nm和343 nm處存在兩個負峰，正負峰交匯，出現(xiàn)了3個零點：648 nm、635 nm以及530 nm。此外，特別發(fā)現(xiàn)在584～589 nm和625 nm處存在波動的小肩峰。這證實了rAPC從單體組裝成三聚體后色基微環(huán)境變得復雜。

在天然APC三聚體的CD光譜中，也存在659 nm處的正峰以及643 nm處的負峰，本實驗結果與之相符，且其他報道已通過解疊法證明它們組成了一對正負峰[34,40-41]。多數(shù)觀點認為，這兩個峰的存在支持了650 nm處的生色團對由于偶極-偶極相互作用而導致激子分裂的觀點，能量因此躍遷至659 nm以及643 nm波長處[41]。此外，343 nm處出現(xiàn)的負峰也較為明顯，該峰對應于穩(wěn)態(tài)吸收光譜340 nm范圍內PCB的吸收峰。

需要特別分析的是，本實驗中584～589 nm處和625 nm處為波動的小肩峰。而在其他APC三聚體CD光譜的報道中，589 nm處為負峰，625 nm處為正峰，且將CD光譜解疊后，這兩個峰組成了正負峰對，有部分觀點認為，這個正負峰對是APC三聚體中存在弱耦合色素對的證據(jù)[34,41]。然而，在本實驗的結果中，625 nm處的正峰似乎藍移至612～616 nm處，而589 nm處的負峰僅表現(xiàn)為一個小肩峰（圖5b）?？紤]到其他多種研究證明的APC三聚體CD光譜的復雜性[42-43]，我們推測，這可能是由于不同實驗中生色團所處的微環(huán)境的異質性導致的CD光譜存在差異，例如本實驗溶液中存在的部分的游離單體（導致620 nm處的吸收肩峰更明顯），可能導致弱耦合信號更加減弱。此外，結合吸收光譜，我們認為，589 nm處的CD光譜負峰可能與吸收光譜中590 nm處的吸收峰相對應，因此，590 nm處很可能有弱耦合發(fā)色團對相關的能量傳遞過程。綜上，rAPC三聚體的CD光譜基本與天然APC三聚體的CD光譜結果一致。證明了rAPC三聚體中存在著強耦合的發(fā)色團對，且強耦合導致了激子分裂，該結果同時也是rAPC三聚體結構完整性及能量傳遞高效性的一個輔助證據(jù)。

3.4 rAPC三聚體能量傳遞的寬帶泵浦探測分析

為了能夠測量rAPC三聚體在百飛秒內的能量傳遞過程，本實驗對rAPC三聚體進行了寬帶泵浦探測實驗，同時設定rAPC單體為對照組，脈沖覆蓋范圍及樣品吸收光譜如圖6所示。為了避免由于多光子吸收所引起的額外的超快非線性過程[44]，在進行寬帶泵浦探測之前，先對rAPC單體和三聚體分別進行激發(fā)能量依賴的寬帶泵浦探測實驗（圖7）。分析動力學早期T等于100 fs時ΔOD值的變化，可以看到，無論是rAPC單體或三聚體，在激發(fā)能量密度小于40 μJ/cm2的激發(fā)條件下都隨著激發(fā)能量密度呈線性變化。但特別的，當三聚體的能量密度超過70 μJ/cm2時，ΔOD不再是線性變化，有可能是出現(xiàn)了多光子吸收的過程[44]，這將影響后續(xù)的光譜分析，因此實驗所采用的激發(fā)能量密度均小于 40 μJ/cm2。

圖6 NOPA脈沖覆蓋范圍及rAPC單體和三聚體穩(wěn)態(tài)吸收光譜Fig.6 Coverage of NOPA pulse and steady-state absorption spectra of rAPC trimer

圖7 rAPC單體及三聚體的激發(fā)能量依賴Fig.7 Excitation energy dependence of rAPC monomer and trimer

對寬帶泵浦探測結果進行動力學擬合。在rAPC單體在620 nm處擬合出3個時間壽命常數(shù)，分別為(57±10) fs、(7.4±4.8) ps以及 400 ps；rAPC 三聚體在 620 nm處擬合出3個時間壽命常數(shù)，分別為(19±7) fs、(630±100) fs以及400 ps；在656 nm處擬合出兩個時間壽命常數(shù)，分別為 (470±100) fs以及 400 ps（表1）。rAPC單體(57±10) fs和(7.4±4.8) ps兩個壽命常數(shù)被認為對應于單體的快速溶劑化過程，這與8a圖中單體由于溶劑化而光譜紅移并伴隨動力學衰減的結果相一致[45-46]。而 rAPC 三聚體 (19±7) fs以及 (630±100) fs兩個時間常數(shù)被認為對應于三聚體的能量傳遞過程，將在后面做細致的討論。其中最后一個壽命（400 ps）為固定的壽命參數(shù)，因為超出了實驗所采集的時間范圍（100 ps）。

表1 rAPC單體和三聚體瞬態(tài)吸收動力學擬合常數(shù)Table 1 The fitting constants of rAPC trimer transient absorption dynamics

19 fs的超短時間常數(shù)與其他文獻中報道的10～60 fs的時間常數(shù)相一致，這樣短的傳能時間通常被認為與相干過程有關，該時間常數(shù)在其他報道中被指認為是兩個PCB分子組成的激子對的電子退相干時間[12-14,27]?？紤]到本次實驗的脈沖寬度為11 fs，檢測到19 fs的電子退相干時間是有可能的[47]。但是該時間常數(shù)所代表的具體相干過程目前還沒有研究進行細致的報道，關于相干傳能過程的具體研究還需要后續(xù)借助于高分辨率的二維時間分辨光譜技術來完成[48]。470～630 fs的時間常數(shù)我們認為是能量在620 nm和656 nm這兩個吸收峰代表的色素之間無輻射衰減的過程。這與寬帶泵浦探測的其他動力學分析結果相一致。如圖8b所示，對比rAPC單體（圖8a），600 fs內rAPC三聚體在656 nm處表現(xiàn)了顯著的能量增長，而在620 nm處表現(xiàn)出能量弛豫（圖8b），這證實了三聚體中能量從620 nm向650 nm傳遞的過程。

圖8 rAPC三聚體及單體的瞬態(tài)探測Fig.8 Transients detected of rAPC trimer and monomer

截取不同時間分辨率下的寬帶泵浦探測光譜進行動力學分析（圖9b），其中光譜中的負峰表示基態(tài)漂白和受激發(fā)射的信號貢獻，而正峰表示激發(fā)態(tài)吸收過程。在T等于104 fs時的光譜中明顯的干涉信號是由于樣品對激發(fā)光的散射造成的。結果顯示，rAPC三聚體在0～600 fs的過程中，618～625 nm范圍內的負峰逐漸減弱，這反映了能量從620 nm傳遞至650 nm的過程幾乎在600 fs以內完成。但與其他報道不同的是，在本實驗中655～658 nm處的信號基本保持不變，而不是信號顯著增長。這是因為在其他報道中泵浦探測用的是窄帶激發(fā)脈沖，因此650 nm處的信號僅反映了由620 nm傳遞過去的能量[27]。而本實驗采用的寬帶脈沖可以直接激發(fā)650 nm。對比rAPC單體的瞬態(tài)光譜變化（圖9a），發(fā)現(xiàn)rAPC單體625.5 nm處的負峰紅移至633 nm，該紅移過程被認為是由于溶劑化過程導致[49]。但紅移現(xiàn)象在三聚體中并不明顯（僅紅移3 nm），這可能是由于三聚體中色基之間存在強耦合使溶劑化過程減弱。

rAPC三聚體不同時間下瞬態(tài)光譜結果顯示了三聚體的整體傳能過程（圖9b），激發(fā)0 fs后的瞬態(tài)光譜形狀對比穩(wěn)態(tài)光譜基本沒有改變：在650 nm左右處有銳利的特征吸收峰，并伴隨著較弱的590 nm和較強的620 nm的肩峰信號（圖9b）以及680 nm處的正峰信號。655～658 nm處銳利的峰形符合強激子耦合的光譜特征。在590～600 nm范圍內，始終存在的負吸收信號與吸收光譜結果一致。結合吸收光譜的結果分析，我們認為，此處可能存在弱耦合的色素對。但由于寬帶泵浦探測光譜的動力學分析并沒有與此相關的動力學過程，且600 fs內，600 nm左右的泵浦探測光譜波動較大，因此無法確定傳能過程。但考慮到該峰并不存在于rAPC單體中（圖9a），590～600 nm范圍內的負峰被認為可能與三聚體的能量傳遞有關。此外，rAPC三聚體的泵浦探測光譜顯示，穩(wěn)定存在著一個680 nm的正信號，該信號在rAPC單體的寬帶泵浦探測光譜中也一直存在。已有其他文獻報道[27]，該信號對應于第一激發(fā)態(tài)往更高的電子激發(fā)態(tài)躍遷所產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)吸收過程。另外，在三聚體中還可能包含了激子耦合所產(chǎn)生的雙激子態(tài)所造成的激發(fā)態(tài)吸收過程。

圖9 rAPC單體及三聚體不同時間下的瞬態(tài)光譜變化Fig.9 Energy transfer dynamics of rAPC monomer and trimer at several delay times

4 結論

本實驗對rAPC三聚體在室溫下進行了多種光譜探測，并設立rAPC單體為對照組，這些光譜在不同的光譜分辨率下反映了rAPC三聚體的傳能過程。

其中，穩(wěn)態(tài)光譜結果證明，rAPC三聚體具有和天然APC一樣的光譜特性，這些特性由三聚體獨特的蛋白結構導致的獨特的生色團微環(huán)境決定，因此，光譜特性一定程度上反映了rAPC三聚體的蛋白結構。而CD光譜證明了rAPC單體組裝成rAPC三聚體時，并不改變蛋白質的二級結構，但是會影響發(fā)色團的微環(huán)境。同時CD光譜證實了650 nm處激發(fā)態(tài)的激子分裂情況，這是證明rAPC三聚體發(fā)色團及蛋白結構特性的另一有力證據(jù)。但是由于環(huán)境異質性，在CD光譜中我們并沒有看到弱耦合對的存在。

寬帶泵浦探測光譜的動力學結果證實了rAPC三聚體中存在300～600 fs時間尺度的620～650 nm的傳能過程，且該過程不存在于rAPC單體中。這證明了rAPC三聚體的結構完整性，且傳能過程與天然APC一致。此外，我們還測到了19 fs的超短壽命常數(shù)，這和其他研究報道的可能的激子態(tài)的電子退相干時間基本一致。值得注意的是，590 nm處的激發(fā)態(tài)在傳能動力學過程中也一直存在。然而，該激發(fā)態(tài)的來源和去向我們并不能清晰的判斷，但在后續(xù)的實驗中，我們將利用二維電子光譜等技術，繼續(xù)深入研究該激發(fā)態(tài)與弱耦合色素對相關的能量傳遞之間的關系。

本實驗通過結合多種光譜學手段，對rAPC的能量傳遞過程進行了探測，這為闡明APC傳能的本質，揭示藻膽體的高效能量傳遞機制提供了數(shù)據(jù)基礎。