厚殼貽貝腸道細(xì)菌的生物被膜對(duì)其幼蟲(chóng)和稚貝附著的影響

徐嘉康，王勁松，方怡涵，楊金龍,3，梁簫*

( 1.上海海洋大學(xué) 國(guó)家海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（廣州），廣東 廣州 511458)

1 引言

厚殼貽貝（Mytilus coruscus）和大多數(shù)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物一樣，幼蟲(chóng)在發(fā)育到一定階段后會(huì)經(jīng)歷“附著變態(tài)”而發(fā)育成稚貝、長(zhǎng)成成貝[1-2]。同時(shí)，厚殼貽貝的稚貝或成貝在周?chē)瞽h(huán)境發(fā)生變化時(shí)會(huì)自動(dòng)切斷足絲，爬到其他生態(tài)位尋找到新的附著基質(zhì)后，經(jīng)過(guò)“二次附著”后在新的環(huán)境中生長(zhǎng)[1-5]。厚殼貽貝作為我國(guó)重要的海水經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)之一，附著變態(tài)的成功與否直接影響育苗過(guò)程中的苗種產(chǎn)量和質(zhì)量，稚貝的二次附著則影響貽貝的包苗和中間培育，因此在厚殼貽貝的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中，幼蟲(chóng)附著變態(tài)和稚貝二次附著是決定其經(jīng)濟(jì)效益與發(fā)展前景的重要技術(shù)環(huán)節(jié)。

海洋細(xì)菌所形成的生物被膜在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的角色[6-8]。研究表明 ，Shewanella[9]、Vibrio[10-11]、Pseudoalteromona[12-13]、Bacillus[13]等屬的海洋細(xì)菌都能調(diào)控厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著變態(tài)和稚貝的二次附著。海洋細(xì)菌種類(lèi)多種多樣且分布廣泛，在海水、海洋沉積物和海洋生物體內(nèi)均能發(fā)現(xiàn)并分離[13-15]。然而，并非所有海洋細(xì)菌都適合于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用，例如弧菌在一定條件下會(huì)具有一定的致病性[16-19]，這一特性使得在養(yǎng)殖過(guò)程中對(duì)貽貝健康和產(chǎn)品的品質(zhì)管控存在一定的風(fēng)險(xiǎn)[20-22]，所以在實(shí)際的貽貝生產(chǎn)應(yīng)用中，選取一種有效且安全的細(xì)菌至關(guān)重要。

腸道細(xì)菌在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中均能發(fā)現(xiàn)其蹤跡，并在一定的相互作用下形成較穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)[23]。腸道細(xì)菌種類(lèi)豐富而且數(shù)量龐大，具有提高宿主的免疫力、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育、提高腸的屏障功能等[24-25]特殊的生理功能。研究表明[13]，一些腸道細(xì)菌可以促進(jìn)厚殼貽貝稚貝進(jìn)行二次附著，但腸道細(xì)菌能否誘導(dǎo)其幼蟲(chóng)的附著變態(tài)以及腸道細(xì)菌、生物被膜、貝類(lèi)的附著行為三者之間的關(guān)系等問(wèn)題報(bào)道較少。

本研究從厚殼貽貝的腸道中分離出10株細(xì)菌分別形成生物被膜，檢測(cè)其對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)和稚貝二次附著的影響，篩選出在誘導(dǎo)厚殼貽貝附著過(guò)程中有高、低誘導(dǎo)活性的腸道細(xì)菌，對(duì)其所形成生物被膜的胞外產(chǎn)物的分布和量進(jìn)行分析，旨在通過(guò)本研究闡明厚殼貽貝的附著與不同種類(lèi)的腸道細(xì)菌之間的關(guān)系，為腸道細(xì)菌在貝類(lèi)人工育苗和海區(qū)養(yǎng)殖過(guò)程中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

從浙江省嵊泗縣枸杞島附近海域（30.72°N，122.76°E）取回實(shí)驗(yàn)所需的成體厚殼貽貝。取回時(shí)殼長(zhǎng)為（9.5±0.5）cm，殼高為（4.7±0.5）cm。

本實(shí)驗(yàn)所使用的厚殼貽貝眼點(diǎn)幼蟲(chóng)和稚貝源于東海貽貝科技創(chuàng)新服務(wù)有限公司。眼點(diǎn)幼蟲(chóng)殼長(zhǎng)為（279.5±21.5）μm，殼高為（247.0±17.5）μm，稚貝殼長(zhǎng)為（0.85±0.15）mm，殼高為（0.56±0.11）mm。

2.2 腸道細(xì)菌的相關(guān)分析

2.2.1 腸道細(xì)菌的分離

將腸道細(xì)菌從成體厚殼貽貝腸道中分離的方法參照Li等[26]的方法，使用滅菌的解剖剪將腸道從成體厚殼貽貝中分離并置于離心管中，刮取腸道內(nèi)壁物質(zhì)于滅菌過(guò)濾海水（Autoclaved Filtered Sea Water, AFSW）中，將所得到的細(xì)菌懸浮液進(jìn)行梯度稀釋10 000倍后用于分離細(xì)菌，所分離的菌株都儲(chǔ)存在含有30%甘油的0.9%NaCl的溶液中，并置于實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱中低溫保存。

2.2.2 腸道細(xì)菌16S rRNA基因測(cè)序

細(xì)菌16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增及序列比對(duì)參照Li等[26]的實(shí)驗(yàn)方法，使用細(xì)菌基因組DNA試劑盒（上海博彩生物科技有限公司）提取細(xì)菌DNA，將提取的DNA序列PCR擴(kuò)增后送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，將所得到的基因序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得 Accession No.等信息。

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育分析參照楊金龍等[2]的方法，使用MEGA 6.06程序進(jìn)行測(cè)序，序列與其近源物種的16S rRNA基因序列比對(duì)。系統(tǒng)發(fā)育分析使用最大簡(jiǎn)約法、最小進(jìn)化法和鄰接法3種方法進(jìn)行構(gòu)建，物種間遺傳距離使用Jukes-Cantor法。選取大腸桿菌（Escherichia coli）（序列號(hào)為 AONF01000005.1）作為外群序列來(lái)進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.3 生物被膜的相關(guān)分析

2.3.1 生物被膜的制備

參照楊金龍等[2]的方法來(lái)制備實(shí)驗(yàn)所需的單一細(xì)菌生物被膜，分離純化得到的單株腸道細(xì)菌使用ZoBell 2216E培養(yǎng)基在25℃的黑暗條件下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后在3 500 r/min 的條件下離心15 min，倒掉培養(yǎng)液用AFSW清洗3次，用50 mL AFSW懸浮所得到的細(xì)菌，按照實(shí)驗(yàn)所需的 1×106cells/mL、1×107cells/mL、 1×108cells/mL、 3×108cells/mL、 5×108cells/mL和1×109cells/mL這6個(gè)初始細(xì)菌密度計(jì)算加入滅菌培養(yǎng)皿中的細(xì)菌懸浮液體積，在18℃的黑暗條件下培養(yǎng)48 h得到實(shí)驗(yàn)所需的生物被膜。

2.3.2 生物被膜的細(xì)菌密度計(jì)數(shù)

參考Yang等[27]的方法來(lái)對(duì)生物被膜上的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，使用5%甲醛溶液將生物被膜固定24 h，固定后使用0.1%吖啶橙染液避光染色5 min，染色后去除多余染液，避光晾干后置于熒光顯微鏡（奧林巴斯BX51）×1 000放大倍率下進(jìn)行觀察，每株細(xì)菌的每個(gè)初始細(xì)菌密度設(shè)置3個(gè)平行組，每個(gè)平行組隨機(jī)取10個(gè)視野計(jì)算細(xì)菌密度。其計(jì)算公式為

2.3.3 生物被膜形態(tài)及厚度分析

生物被膜形態(tài)及厚度分析按照Yang等[27]的方法，選取在 5×108cells/mL濃度下對(duì)Bacillussp.4和Phaeobactersp.1的生物被膜進(jìn)行分析。使用5%甲醛溶液將生物被膜固定24 h，用5 mg/L的碘化丙啶（PI）溶液避光染色15 min，避光晾干后在徠卡激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica TCS SP8）×630放大倍率下拍攝，使用FV10-ASW 3.0軟件獲取激光掃描聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM）圖像，分析生物被膜細(xì)菌胞外產(chǎn)物含量。

2.4 厚殼貽貝附著實(shí)驗(yàn)

2.4.1 厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)實(shí)驗(yàn)

厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)實(shí)驗(yàn)參考Yang等[27]的方法，在高溫滅菌的玻璃培養(yǎng)皿中放入附有生物被膜的載玻片，加入20 mL AFSW和20個(gè)幼蟲(chóng)，在18℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后記錄幼蟲(chóng)的附著變態(tài)率，每株實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的各個(gè)初始細(xì)菌密度均設(shè)9個(gè)平行組，以高溫滅菌的沒(méi)有生物被膜黏附的潔凈載玻片作為對(duì)照組。

2.4.2 厚殼貽貝稚貝附著實(shí)驗(yàn)

厚殼貽貝稚貝附著實(shí)驗(yàn)參考楊金龍等[2]的方法，在高溫滅菌的玻璃培養(yǎng)皿中放入附有生物被膜的載玻片，加入20 mL AFSW和10個(gè)稚貝，在18℃黑暗條件下培養(yǎng)6 h、12 h、24 h和48 h 后記錄稚貝的附著率，每株實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的各個(gè)初始細(xì)菌密度均設(shè)9個(gè)平行組，以高溫滅菌的沒(méi)有生物被膜黏附的潔凈載玻片作為對(duì)照組。

2.5 胞外產(chǎn)物分析

2.5.1 生物被膜的熒光染色

參考Peng等[12]的方法對(duì)生物被膜進(jìn)行染色，在5×108cells/mL濃度下對(duì)Bacillussp.4和Phaeobactersp.1的生物被膜進(jìn)行分析。生物被膜分別使用DiD’oil、FITC、ConA-TMR和CFW染液對(duì)胞外脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、α-多糖和β-多糖進(jìn)行避光染色25 min，其中進(jìn)行胞外蛋白質(zhì)染色的生物被膜需提前使用5%甲醛溶液固定24 h，染色后去除多余染液，避光晾干后在徠卡激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica TCS SP8）×630放大倍率下拍攝，使用FV10-ASW 3.0 軟件獲取CLSM圖像，分析生物被膜細(xì)菌胞外產(chǎn)物含量。

2.5.2 CLSM 圖像分析

CLSM 圖像分析方法按照Peng等[12]的分析方法。使用Image J軟件（美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院）計(jì)算生物被膜的生物體積，生物體積表示生物被膜胞外產(chǎn)物的單個(gè)成分的量。其計(jì)算公式為

2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理按照楊金龍等[2]的方法，使用JMP軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和相關(guān)性檢驗(yàn)。相關(guān)性分析方法使用Spearman'多元分析方法分析，其中p為檢驗(yàn)值，p小于0.05時(shí)說(shuō)明具有顯著性的差異。

3 結(jié)果

3.1 腸道細(xì)菌的測(cè)序與表型

本實(shí)驗(yàn)所分離純化的10株腸道細(xì)菌的信息見(jiàn)表1。本實(shí)驗(yàn)所分離的細(xì)菌均為不同的菌屬，其中Bacillussp.4屬于厚壁菌門(mén)，F(xiàn)lavobacteriumsp.1、Arenibactersp.1、Mesoflavibactersp.1和Tenacibaculumsp.3屬于擬桿菌門(mén)，而另外5株細(xì)菌Paracoccussp.2、Pseudoalteromonassp.30、Ruegeriasp.2、Ahrensiasp.1和Phaeobactersp.1 屬于變形菌門(mén)。不同腸道細(xì)菌的表型如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)所用貽貝腸道細(xì)菌的表型Fig.1 Phenotypes of the different bacterial strains from mussel intestinal in tested

表1 腸道細(xì)菌16S rRNA基因序列分析Table 1 16S rRNA gene sequence analysis of the intestinal bacterial strains

3.2 腸道細(xì)菌的生物被膜誘導(dǎo)活性

本實(shí)驗(yàn)中的10株腸道細(xì)菌在測(cè)試時(shí)間內(nèi)對(duì)厚殼貽貝附著的誘導(dǎo)活性趨勢(shì)基本相同，因此幼蟲(chóng)僅展示48 h、稚貝僅展示24 h的誘導(dǎo)活性結(jié)果。如圖2A所示，所用腸道細(xì)菌均具有誘導(dǎo)活性，幼蟲(chóng)的稚貝率為10%～50%。Bacillussp.4具有最高的誘導(dǎo)活性（p＜0.05），誘導(dǎo)活性為（42.78±1.21）%，Phaeobactersp.1具有最低的誘導(dǎo)活性，誘導(dǎo)活性為（10.50±1.30）%。

如圖2B所示，所用腸道細(xì)菌均具有誘導(dǎo)活性，稚貝的附著率為20%～95%。Phaeobactersp.1具有最高的誘導(dǎo)活性（p＜0.05），誘導(dǎo)活性為（92.22±2.35）%，F(xiàn)lavobacteriumsp.1具有最低的誘導(dǎo)活性，誘導(dǎo)活性為（20.00±1.75）%。

圖2 不同腸道細(xì)菌對(duì)厚殼貽貝的誘導(dǎo)作用Fig.2 Induction of settlement of Mytilus coruscus on the different intestinal bacterial biofilms

3.3 生物被膜細(xì)菌密度

在本實(shí)驗(yàn)中，所測(cè)試的10株腸道細(xì)菌的最終細(xì)菌密度會(huì)因?yàn)槌跏技?xì)菌密度的變化呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)所用腸道細(xì)菌大部分在5×108cells/mL時(shí)成膜效果最好，因此這里選取在5×108cells/mL時(shí)形成生物被膜的細(xì)菌密度進(jìn)行展示。10株腸道細(xì)菌中Flavobacteriumsp.1的細(xì)菌密度最高，和除Phaeobactersp.1以外的 8株細(xì)菌均有顯著性差異（p＜0.05），Arenibactersp.1的細(xì)菌密度最低（圖3）。

圖3 不同腸道細(xì)菌生物被膜的細(xì)菌密度Fig.3 The bacterial density of different intestinal bacterial biofilms

3.4 生物被膜細(xì)菌密度與其誘導(dǎo)活性之間的相關(guān)性

10株細(xì)菌生物被膜的細(xì)菌密度與其對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)和稚貝誘導(dǎo)活性的相關(guān)性關(guān)系見(jiàn)表2。10株腸道細(xì)菌中Paracoccussp.2、Pseudoalteromonassp.30和Ruegeriasp.2對(duì)幼蟲(chóng)和稚貝誘導(dǎo)活性均顯著相關(guān)（p＜0.05）。Bacillussp.4 和Ahrensiasp.1 對(duì)幼蟲(chóng)的誘導(dǎo)性顯著相關(guān)（p＜0.05）。Flavobacteriumsp.1、Arenibactersp.1和Phaeobactersp.1對(duì)稚貝的誘導(dǎo)活性顯著相關(guān) （p＜0.05）。Mesoflavibactersp.1和Tenacibaculumsp.3對(duì)幼蟲(chóng)和稚貝的誘導(dǎo)活性均不相關(guān)（p＞0.05）。

表2 細(xì)菌密度與誘導(dǎo)活性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analyses between the bacterial density and inducing activity

3.5 腸道細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)3種分析進(jìn)行腸道細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育發(fā)現(xiàn)，所得到的結(jié)果一致，因此本研究以鄰接法的分析結(jié)果進(jìn)行展示（圖4），表3為本研究所用細(xì)菌的遺傳距離。結(jié)果顯示，Paracoccussp.2與Flavobacteriumsp.1的遺傳距離為0.011，是測(cè)試腸道細(xì)菌中遺傳距離最近的。上述2株細(xì)菌聚為一支后與Ruegeriasp.2及Phaeobactersp.1聚為一支。這一分支再與同屬于變形菌門(mén)的Bacillussp.4、Ahrensiasp.1和屬于厚壁菌門(mén)的Pseudoalteromonassp.30這3株細(xì)菌聚為另一分支，最后再和Arenibactersp.1、Mesoflavibactersp.1和Tenacibaculumsp.3這3株細(xì)菌聚類(lèi)。

表3 本實(shí)驗(yàn)中腸道細(xì)菌的遺傳距離Table 3 Genetic distances of intestinal bacterial in tested

圖4 本實(shí)驗(yàn)中腸道細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of intestinal bacterial in tested

3.6 腸道細(xì)菌的生物被膜形態(tài)和厚度

通過(guò)CLSM圖片明顯發(fā)現(xiàn)，Bacillussp.4和Phaeobactersp.1生物被膜的狀態(tài)明顯不同（圖5A）。Phaeobactersp.1的膜厚為（8.86±0.25）μm，且Phaeobactersp.1比Bacillussp.4的細(xì)菌分布更加的聚集。

圖5 Bacillus sp.4和Phaeobacter sp.1的生物被膜圖像（A）及膜厚（B）Fig.5 Biofilm images (A) and biofilm thickness (B) of Bacillus sp.4 and Phaeobacter sp.1

通過(guò)分析膜厚和誘導(dǎo)活性的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)（表4），Bacillussp.4的膜厚與幼蟲(chóng)和稚貝的誘導(dǎo)活性均不相關(guān)（p＞0.05）；Phaeobactersp.1 的膜厚與稚貝的誘導(dǎo)活性顯著相關(guān)（p＜0.05）而對(duì)幼蟲(chóng)的誘導(dǎo)活性不相關(guān)（p＞0.05）。

表4 膜厚與誘導(dǎo)活性的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analyses between the biofilm thickness and inducing activity

3.7 CLSM圖像和胞外產(chǎn)物含量

如圖6所示，2株細(xì)菌胞外產(chǎn)物中蛋白質(zhì)、α-多糖和β-多糖的分布和含量具有顯著性差異（p＜0.05）。Bacillussp.4的胞外蛋白質(zhì)、α-多糖和β-多糖含量顯著高于Phaeobactersp.1（p＜0.05），Bacillussp.4 分泌胞外產(chǎn)物的能力高于Phaeobactersp.1。

圖6 生物被膜的CLSM圖像分析Fig.6 The analysis of CLSM images of biofilms

通過(guò)分析胞外產(chǎn)物與其誘導(dǎo)活性的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)（表5，表6），Bacillussp.4 的胞外產(chǎn)物中，胞外蛋白、α-多糖和β-多糖與幼蟲(chóng)的誘導(dǎo)活性顯著相關(guān)（p＜0.05），而胞外脂類(lèi)與幼蟲(chóng)的誘導(dǎo)活性不相關(guān)（p＞0.05）。α-多糖與稚貝的誘導(dǎo)活性顯著相關(guān)且呈負(fù)相關(guān)性（p＜0.05），而脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和β-多糖與對(duì)稚貝的誘導(dǎo)活性不相關(guān)（p＞0.05）。

表5 胞外產(chǎn)物與幼蟲(chóng)誘導(dǎo)活性的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analyses between extracellular product and inducing activity of larvae

表6 胞外產(chǎn)物與稚貝誘導(dǎo)活性的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analyses between the extracellular product and inducing activity of plantigrade

Phaeobactersp.1形成的生物被膜胞外產(chǎn)物中，蛋白質(zhì)與幼蟲(chóng)的誘導(dǎo)活性顯著相關(guān)且呈負(fù)相關(guān)性（p＜0.05），而脂類(lèi)、α-多糖和 β-多糖與幼蟲(chóng)的誘導(dǎo)活性不相關(guān)（p＞0.05）。α-多糖與稚貝的誘導(dǎo)活性顯著相關(guān)（p＜0.05），而脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和 β-多糖與稚貝的誘導(dǎo)活性不相關(guān)（p＞0.05）。

4 討論

本研究所測(cè)試的10株厚殼貽貝腸道細(xì)菌均為不同的菌屬，經(jīng)培養(yǎng)都能夠形成生物被膜，并且最終形成生物被膜的細(xì)菌密度會(huì)根據(jù)初始細(xì)菌密度變化而變化，具體變化趨勢(shì)根據(jù)菌種的不同具有不同的趨勢(shì)。10株腸道細(xì)菌形成的生物被膜對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)和稚貝均具有誘導(dǎo)活性，并且因菌種不同表現(xiàn)出不同的誘導(dǎo)活性，這表明，細(xì)菌菌種與誘導(dǎo)活性之間沒(méi)有必然聯(lián)系，這與以往的研究結(jié)果一致[2,4,13,26-27]。

以往研究表明，在厚殼貽貝腸道及東海近海海區(qū)的自然生物被膜中均分離出相同的菌屬。與本研究相比較，在2017年研究中[13]，從厚殼貽貝腸道分離出與本研究相同的Tenacibaculum、Bacillus、Ruegeria和Paracoccus菌屬；從自然生物被膜中也曾分離出Tenacibaculum[4,26-27]、Bacillus[4,28]和Pseudoalteromonas[4,26-28]3個(gè)與本研究相同菌屬的細(xì)菌。以往研究已證明了宿主生存的環(huán)境會(huì)影響腸道細(xì)菌的群落[29-30]，腸道作為厚殼貽貝主要的消化器官，可能會(huì)因?yàn)V食作用將環(huán)境中的細(xì)菌攝入到腸道內(nèi)，因此推測(cè)，本研究的10株細(xì)菌可能來(lái)源于厚殼貽貝生存的外界環(huán)境。

4.1 腸道細(xì)菌的生物被膜對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)的誘導(dǎo)活性

在以往的研究中，單一菌株形成生物被膜后的細(xì)菌密度、膜厚、胞外產(chǎn)物等生物學(xué)特性與海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲(chóng)附著變態(tài)具有一定的相關(guān)性。Peng等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，7株P(guān)seudoalteromonas中有3株的生物被膜細(xì)菌密度與M.coruscus幼蟲(chóng)誘導(dǎo)活性呈顯著相關(guān)性，與另外4株細(xì)菌無(wú)相關(guān)性。Bao等[31]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5株細(xì)菌中僅有Alteromonassp.1這1株的細(xì)菌密度與Mytilus galloprovincialis幼蟲(chóng)的誘導(dǎo)活性呈顯著相關(guān)性。Tran和Hadfield[32]的研究中，僅有Pseudoalteromonas luteoviolacea細(xì)菌生物被膜的細(xì)菌密度與Pocillopora damicornis幼蟲(chóng)的誘導(dǎo)活性呈顯著相關(guān)性，其余細(xì)菌與誘導(dǎo)活性均沒(méi)有相關(guān)性。在本研究所測(cè)試的10株腸道細(xì)菌被膜的細(xì)菌密度與誘導(dǎo)活性中，有5株細(xì)菌呈相關(guān)性，另外5株無(wú)相關(guān)性，表明細(xì)菌呈現(xiàn)出相關(guān)性不具有普遍性，因而生物被膜的細(xì)菌密度并不是影響厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)的主要因素。

根據(jù)Yang等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)活性無(wú)顯著差異的Tenacibaculumsp.1和Pseudoalteromonassp.1的膜厚和其他測(cè)試的細(xì)菌相比有顯著差異。本研究中，Phaeobactersp.1形成的生物被膜的膜厚顯著高于Bacillussp.4，但Bacillussp.4的誘導(dǎo)活性顯著高于Phaeobactersp.1，因此生物被膜的膜厚不是影響厚殼貽貝幼蟲(chóng)附著變態(tài)的主要因素。本研究針對(duì)細(xì)菌的遺傳進(jìn)化對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著變態(tài)誘導(dǎo)活性相關(guān)性分析，結(jié)果表明具有較遠(yuǎn)遺傳距離的Bacillussp.4和Arenibactersp.1的誘導(dǎo)活性無(wú)差異，遺傳距離較近的Ruegeriasp.2和Flavobacteriumsp.1有顯著性差異。這一結(jié)果證明了細(xì)菌遺傳距離與誘導(dǎo)活性之間沒(méi)有必然聯(lián)系，與以往研究結(jié)果一致[27]。

Peng等[12]的研究表明，胞外產(chǎn)物中的表面活性物質(zhì)可以促進(jìn)厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著行為和附著變態(tài)率。Liang等[33]的研究表明，ΔfilP菌株分泌的鞭毛蛋白可以促進(jìn)厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著變態(tài)，Peng等[34]的研究表明，Δ01912菌株的胞外產(chǎn)物可拉酸過(guò)量分泌同樣可以促進(jìn)厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著變態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，具有高誘導(dǎo)活性的Bacillussp.4生物被膜胞外產(chǎn)物中胞外蛋白、α-多糖和β-多糖的含量顯著高于Phaeobactersp.1。通過(guò)對(duì)胞外產(chǎn)物和誘導(dǎo)活性相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，2株腸道細(xì)菌的胞外蛋白與厚殼貽貝幼蟲(chóng)的誘導(dǎo)活性均具有顯著相關(guān)性，但與Phaeobactersp.1呈現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。因而，α-多糖和β-多糖在誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲(chóng)中起重要作用，胞外蛋白會(huì)因菌屬的不同而影響厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著。

4.2 腸道細(xì)菌的生物被膜對(duì)厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)活性

在以往單一菌株形成生物被膜對(duì)厚殼貽貝稚貝的研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌中，大部分細(xì)菌生物被膜的細(xì)菌密度與誘導(dǎo)活性呈顯著相關(guān)性。本研究中，10株細(xì)菌中有6株的細(xì)菌密度與誘導(dǎo)活性呈相關(guān)性。梁簫等[9]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，厚殼貽貝稚貝的附著率會(huì)根據(jù)弧菌形成生物被膜的膜厚變化而變化，且變化趨勢(shì)相同。本研究中，同一初始細(xì)菌密度下形成的生物被膜，高誘導(dǎo)活性的Phaeobactersp.1的膜厚顯著高于Bacillussp.4。相關(guān)性分析表明，Phaeobactersp.1的膜厚和誘導(dǎo)活性之間是顯著相關(guān)的。由此可見(jiàn)，生物被膜的細(xì)菌密度、膜厚可以影響厚殼貽貝稚貝的附著。而細(xì)菌的遺傳進(jìn)化與厚殼貽貝稚貝的附著沒(méi)有相關(guān)性[2,4,13]。本研究中，遺傳距離最近的Paracoccussp.2和Flavobacteriumsp.1的誘導(dǎo)活性具有顯著性差異，遺傳距離最遠(yuǎn)的Bacillussp.4和Tenacibaculumsp.3的誘導(dǎo)活性沒(méi)有顯著性差異。這一結(jié)果和細(xì)菌遺傳進(jìn)化與誘導(dǎo)活性之間無(wú)必然聯(lián)系的結(jié)論相一致。

生物被膜胞外產(chǎn)物對(duì)厚殼貽貝稚貝的附著起重要作用。梁簫等[10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3株弧菌生物被膜胞外多糖含量與形成時(shí)間有關(guān)，隨時(shí)間增加，胞外多糖含量先增多再減少，胞外多糖含量變化與3株弧菌生物被膜對(duì)厚殼貽貝稚貝的誘導(dǎo)活性結(jié)果相似。本研究中，2株腸道細(xì)菌的生物被膜胞外產(chǎn)物中，α-多糖與誘導(dǎo)活性均呈顯著相關(guān)，但Bacillussp.4呈現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。因而，α-多糖可能在誘導(dǎo)厚殼貽貝稚貝中發(fā)揮了重要作用，存在會(huì)因菌屬的不同而影響厚殼貽貝稚貝的附著。

4.3 同株腸道細(xì)菌的生物被膜對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)和稚貝附著的影響

以往研究中，單一細(xì)菌生物被膜對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)和稚貝呈現(xiàn)出相同或相似的誘導(dǎo)活性。高偉等[35]和梁簫等[9]的研究中，Shewanella loihica對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)和稚貝均具有中等誘導(dǎo)活性；周軒等[28]和 Peng 等[12]的研究中，Pseudoalteromonas marina對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)和稚貝均具有中等誘導(dǎo)活性。在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)Paracoccussp.2和Pseudoalteromonassp.30對(duì)幼蟲(chóng)和稚貝均具有中等誘導(dǎo)活性；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了比較有趣的現(xiàn)象，Phaeobactersp.1和Bacillussp.4的誘導(dǎo)活性結(jié)果呈現(xiàn)出截然相反的結(jié)果，Bacillussp.4對(duì)幼蟲(chóng)具有高誘導(dǎo)活性而對(duì)稚貝具有低誘導(dǎo)活性，而Phaeobactersp.1對(duì)幼蟲(chóng)具有低誘導(dǎo)活性，對(duì)稚貝具有高誘導(dǎo)活性，推測(cè)可能由于腸道細(xì)菌對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)和稚貝的誘導(dǎo)機(jī)制不同。以往研究中，當(dāng)細(xì)菌對(duì)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物具有較高誘導(dǎo)活性時(shí)，其生物被膜分泌胞外產(chǎn)物的能力也相對(duì)較強(qiáng)[33-34]。然而Phaeobactersp.1的胞外產(chǎn)物顯著低于Bacillussp.4，但對(duì)稚貝的誘導(dǎo)活性反而顯著高于后者，推測(cè)可能是Phaeobactersp.1中具有特殊的成膜機(jī)制，使其對(duì)稚貝具有高誘導(dǎo)活性，這一推測(cè)有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究中的腸道細(xì)菌都能夠誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲(chóng)和稚貝的附著，但誘導(dǎo)能力根據(jù)菌種的不同有所差異。通過(guò)對(duì)Bacillussp.4和Phaeobactersp.1這2株腸道細(xì)菌的生物被膜生物量和胞外產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，腸道細(xì)菌被膜的細(xì)胞密度、膜厚和胞外產(chǎn)物中的脂類(lèi)對(duì)厚殼貽貝幼蟲(chóng)的附著變態(tài)無(wú)影響，而胞外蛋白和胞外多糖可以影響幼蟲(chóng)的附著變態(tài)；對(duì)于厚殼貽貝稚貝的附著，腸道細(xì)菌被膜的細(xì)胞密度、膜厚和胞外α-多糖均能影響其誘導(dǎo)活性，而胞外脂類(lèi)和胞外蛋白無(wú)影響。本研究成果為今后深入探討腸道細(xì)菌與厚殼貽貝之間的相互作用提供了理論基礎(chǔ)，對(duì)腸道細(xì)菌在貝類(lèi)人工育苗和海區(qū)生態(tài)健康養(yǎng)殖具有潛在應(yīng)用價(jià)值。