乳腺癌類器官共培養(yǎng)技術(shù)的建立和優(yōu)化

周天浩，辛肇晨，杜少倩，曹 源，許靜軒，勞曾紅，王紅霞#

1.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院腫瘤中心，上海 201600；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科，上海 200030；3.浙江省德清縣人民醫(yī)院腫瘤科，德清 313216

乳腺癌是女性惡性腫瘤死亡的主要原因，發(fā)病率高居女性惡性腫瘤之首，死亡率居第五位。乳腺癌在中國(guó)的新發(fā)病例占全世界的12.2%，死亡病例占全世界的9.6%，嚴(yán)重危害女性生命健康［1］。乳腺癌是一種具有高度異質(zhì)性的疾病，具有不同組織類型、分化程度和分子亞型等；同一腫瘤內(nèi)部又由異質(zhì)性細(xì)胞亞群組成，導(dǎo)致臨床預(yù)后及治療反應(yīng)性差異顯著［2］。目前對(duì)于乳腺癌的研究主要依賴已建立的可無(wú)限傳代細(xì)胞系，但其難以反映乳腺癌原發(fā)灶的真實(shí)生物學(xué)特征、異質(zhì)性狀態(tài)以及腫瘤微環(huán)境［3］。人源性腫瘤異體移植模型對(duì)解決乳腺癌的生物學(xué)復(fù)雜性具有一定意義，但其成功率低、成本高、動(dòng)物飼養(yǎng)周期長(zhǎng)，限制了其廣泛臨床應(yīng)用［4］。近年來(lái)，患者來(lái)源類器官（patient-derived organoids，PDO）模型的建立為腫瘤生物學(xué)研究提供了方便、可靠的途徑［5］。PDO可以維持原發(fā)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性及組織異質(zhì)性，在驗(yàn)證藥物敏感性、鑒定原代細(xì)胞基因及染色體突變、構(gòu)建異種移植動(dòng)物模型等方面發(fā)揮重要作用［6］。但包括乳腺癌在內(nèi)的實(shí)體腫瘤PDO培養(yǎng)還存在培養(yǎng)成功率不高、傳代效率低、培養(yǎng)基和培養(yǎng)體系尚需優(yōu)化等問(wèn)題。既往研究［7］報(bào)道的乳腺癌PDO培養(yǎng)成功率約為60%。Sachs等［8］成功建立了包含100余例乳腺癌的PDO庫(kù)，培養(yǎng)成功率可達(dá)80%，且可傳代20代，但其培養(yǎng)和傳代方法煩瑣，培養(yǎng)成本高，限制了其推廣和應(yīng)用。乳腺癌纖維組織含量高，難以徹底消化，細(xì)胞回收率低，消化過(guò)久又會(huì)損傷細(xì)胞活性。既往研究［9-10］報(bào)道，乳腺癌組織消化大多采用Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原酶，究竟哪種消化效果更優(yōu)目前尚無(wú)定論。如何進(jìn)一步改進(jìn)培養(yǎng)方法、提高培養(yǎng)效率和降低培養(yǎng)成本是目前乳腺癌PDO培養(yǎng)亟需解決的問(wèn)題。

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和耐藥中發(fā)揮重要調(diào)控作用［11］。腫瘤上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型的探索也備受重視。Truong等［12］使用微流體培養(yǎng)系統(tǒng)共培養(yǎng)患者來(lái)源CAFs和乳腺癌細(xì)胞系，研究CAFs對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響；Nayak等［13］利用生物可降解多聚內(nèi)酯的3D支架培養(yǎng)CAFs，并研究原代培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞與CAFs釋放的細(xì)胞外基質(zhì)的交互作用。然而以上模型培養(yǎng)體系復(fù)雜，日常操作不易實(shí)現(xiàn)，且均未見PDO和患者來(lái)源CAFs的直接共同培養(yǎng)。既往報(bào)道的乳腺癌PDO的培養(yǎng)模型幾乎不含成纖維細(xì)胞，也無(wú)法真實(shí)反映腫瘤內(nèi)微環(huán)境的復(fù)雜狀態(tài)及相互調(diào)控［14］。因此在PDO培養(yǎng)中引入CAFs，可以更好地還原真實(shí)腫瘤內(nèi)環(huán)境，為研究腫瘤和間質(zhì)細(xì)胞的相互作用提供便利。

基于此，本研究根據(jù)乳腺癌組織的纖維化特征，選用不同種類膠原酶消化處理組織標(biāo)本，改進(jìn)組織處理方法；優(yōu)化PDO培養(yǎng)基成分和傳代方法，建立CAFs和PDO共培養(yǎng)體系，以期為乳腺癌基礎(chǔ)及轉(zhuǎn)化研究提供良好的體外模型。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本、主要試劑及儀器

1.1.1 組織標(biāo)本 58例乳腺癌患者組織標(biāo)本均來(lái)自上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院?；颊呔炇鹬橥鈺Ｑ芯揩@得上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（#2018KY153）。

1.1.2 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)添加劑B27、p38抑制劑SB-202190、Ⅰ型膠原酶、Ⅲ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Sigma，4%多聚甲醛、DNA酶Ⅰ、CCK8試劑購(gòu)自碧云天，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自巴西Gibco，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、改進(jìn)型DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、胰蛋白酶、TrypLE消化酶、谷氨酰胺、細(xì)胞恢復(fù)液、青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）購(gòu)自美國(guó)Gibco，rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（rho-associated coiled-coil forming kinase，ROCK）抑制劑Y-27632購(gòu)自美國(guó)Abmole，R-脊椎蛋白1（R-spondin-1）重組蛋白、noggin重組蛋白由本實(shí)驗(yàn)室自制，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuregulin 1，NRG1）重組蛋白、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7（fibroblast growth factor 7，F(xiàn)GF7）、FGF10、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）購(gòu)自美國(guó)Peprotech，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）抑制劑A83-01購(gòu)自英國(guó)Tocris，N-乙酰半胱氨酸、煙酰胺、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩沖液、原代細(xì)胞抗生素購(gòu)自美國(guó)Invitrogen，免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自中杉金橋，多色免疫熒光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Akoya，基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)R&D。鈣黏蛋白1（cadherin 1，CDH1）抗體、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體、角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）抗體、成纖維細(xì)胞活化蛋白α（fibroblast activating proteinα，F(xiàn)AP-α）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam（貨號(hào)ab76055、ab52218、ab133263、ab207178），腫瘤相關(guān)鈣信號(hào)換能分子2（tumor associated calcium signal transducer 2，TROP2）抗體購(gòu)自美國(guó)EMZO（貨號(hào)ENZO-ABS-380），雌激素受體（estrogen receptor，ER）抗體、孕激素受體（progesterone receptor，PR）抗體、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）抗體、上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM/TROP1）抗體購(gòu)自中國(guó)Proteintech（貨 號(hào)21244-1-AP、25871-1-AP、18299-1-AP、21050-1-AP）。

1.1.3 主要儀器 光學(xué)顯微鏡（Nikon，日本），熒光顯微鏡（ZEISS，德國(guó)），低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），CytoFLEX流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國(guó)），石蠟切片機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)（Thermo Scientific，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PDO的處理和培養(yǎng) 將手術(shù)切除的乳腺癌組織剪碎至直徑小于1 mm；加入PDO消化液（改進(jìn)型DMEM/F12+1 mg/mL膠原酶+300μg/mL DNA酶Ⅰ+2μmol/L Y-27632+雙抗），37℃搖床消化，轉(zhuǎn)速50 r/min；20 min后取出振蕩至組織散開，再放回37℃搖床消化20 min；加洗滌液（改進(jìn)型DMEM/F12+2μmol/L Y-27632+0.5%BSA+雙抗）終止消化，用力振蕩，70μm濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，棄膠原殘余，細(xì)胞懸液4℃、400×g離心5 min；洗滌液重懸，4℃、400×g離心5 min，重復(fù)2次，計(jì)數(shù)，每1×104個(gè)細(xì)胞加30μL基質(zhì)膠和30μL PDO培養(yǎng)基。乳腺癌PDO培養(yǎng)基成分如下：谷氨酰胺添加劑glutamax 2 mmol/L，HEPES緩沖液10 mmol/L，雙抗100 U/mL，N-乙酰半胱氨酸1.25 mmol/L，EGF 5 ng/mL；noggin重組蛋白50倍稀釋使用，R-spondin-1重組蛋白20倍稀釋使用，A83-01（0.5 nmol/L）、Y-27632 （5 μmol/L）、SB202190（500 nmol/L）、B27添加劑50倍稀釋使用。

對(duì)同一患者（n=5）來(lái)源的PDO分別采用不同F(xiàn)GF7和FGF10含量的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。首先考察不同F(xiàn)GF7和FGF10的含量對(duì)PDO培養(yǎng)的影響，將細(xì)胞分為3組：高濃度組（5 ng/mL和20 ng/mL）、低濃度組（2.5 ng/mL和10 ng/mL）和未添加組。進(jìn)一步比較EGF含量對(duì)PDO培養(yǎng)的影響，實(shí)驗(yàn)分為高濃度組（5 ng/mL）、低濃度組（2.5 ng/mL）和未添加組。

1.2.2 細(xì)胞活性檢測(cè) 收集不同膠原酶處理的乳腺癌細(xì)胞，計(jì)數(shù)。取5×104個(gè)細(xì)胞，離心，棄上清液，100μL PBS重懸，按1∶1 000加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），4℃避光孵育30 min，離心，棄上清液，加入500μL PBS重懸，離心，重復(fù)2次。200μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀分析DAPI陽(yáng)性率和陰性率。

1.2.3 PDO傳代 選擇2種傳代方法。方法①：4℃、400×g離心5 min；細(xì)胞恢復(fù)液重懸，冰上消化30 min；4℃、400×g離心5 min，棄上清液；加入洗滌液重懸，4℃、400×g離心5 min；加入TrypLE消化酶，反復(fù)吹吸，37℃消化5～10 min，每2～3 min取出搖勻，放回37℃繼續(xù)消化，并在顯微鏡下觀察，細(xì)胞消化成絮狀或者單個(gè)為止，一般不超過(guò)10 min。方法②：4℃，使用較高轉(zhuǎn)速900×g，離心5 min；棄上清液，并吸去上層基質(zhì)膠，加入TrypLE消化酶，反復(fù)吹吸，后續(xù)過(guò)程同方法①。上述2種傳代方法分別完成后，按照以下步驟處理：4℃、400×g離心5 min；加入洗滌液，重懸；4℃、400×g離心5 min；將PDO培養(yǎng)基和基質(zhì)膠1∶1混合，重懸細(xì)胞鋪板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育10～15 min?；|(zhì)膠混合物凝固后加入PDO培養(yǎng)基。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 取500～1 000個(gè)PDO三維球體，500×g離心5 min，棄上清液，加入4%多聚甲醛，室溫固定過(guò)夜。之后梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明1 h，石蠟（溫度<50℃）浸泡2次，每次1 h；包埋后連續(xù)切片，厚度3μm。對(duì)于新鮮標(biāo)本組織，手術(shù)離體后直接取乳腺癌組織塊浸泡于甲醛溶液中，進(jìn)行固定、脫水、包埋和切片。將PDO切片和腫瘤原發(fā)灶切片置于65℃烘箱烤30 min，二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇水化，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液高壓修復(fù)5 min，自然冷卻至室溫。室溫封閉15 min，棄封閉液，一抗4℃孵育過(guò)夜。次日棄一抗，分別室溫孵育3%過(guò)氧化氫、二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素15 min，孵育間隙均用PBS洗滌3次，每次3 min。DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色后，蘇木精染核，隨后梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，封片后顯微鏡下觀察。觀察指標(biāo)主要包括陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)定位、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和陽(yáng)性程度。利用Image pro plus軟件檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，200倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，采用自動(dòng)測(cè)量的方法，選取陽(yáng)性染色像素信息，系統(tǒng)自動(dòng)識(shí)別陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，再選取細(xì)胞核染色像素信息，系統(tǒng)自動(dòng)識(shí)別細(xì)胞總數(shù)。陽(yáng)性率=（陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.5 多色免疫組織化學(xué)鑒定 將PDO切片和腫瘤原發(fā)灶切片置于65℃烘箱烤30 min，二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇水化，用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液高壓修復(fù)5 min，自然冷卻至室溫。室溫封閉15 min，棄封閉液，CK18抗體室溫孵育15 min，棄一抗，分別孵育二抗和綠色熒光染料，孵育間隙洗滌2次，每次5 min。微波爐抗原修復(fù)15 min，自然冷卻到室溫，封閉，分別孵育α-SMA一抗、二抗、紅色熒光染料和DAPI，封片觀察。

1.2.6 CAFs的分離和培養(yǎng) 將新鮮乳腺癌組織用剪刀分成體積1～3 mm3的組織塊，用CAFs消化液（DMEM+0.1 mg/mL膠原酶Ⅳ+2%雙抗）37℃消化過(guò)夜，次日加入含有10%FBS的DMEM終止消化，離心，用含有20%FBS的DMEM重懸，鋪板。3 d后CAFs可從組織中爬出并貼壁。細(xì)胞充分爬出后，用胰酶消化細(xì)胞1∶2進(jìn)行傳代。傳至第3代，細(xì)胞長(zhǎng)成形態(tài)均一的CAFs。

1.2.7 CAFs的免疫熒光鑒定 將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的CAFs鋪在裝有細(xì)胞爬片的24孔板中。待細(xì)胞貼壁后12 h，棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定30 min；PBS浸洗2次，每次5 min，室溫封閉10 min，加入α-SMA、FAP-α一抗，4℃過(guò)夜孵育；棄一抗，PBS浸洗3次，每次5 min，加入熒光二抗，室溫避光孵育30 min；棄二抗，PBS洗滌2次，每次5 min，擦干玻片后滴加封片劑，倒置于干凈的載玻片上。

1.2.8 PDO與CAFs共培養(yǎng) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAFs用胰酶消化，用含有10%FBS的DMEM終止消化，離心，棄上清液，用PDO培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)；將PDO消化成單細(xì)胞后，再次細(xì)胞計(jì)數(shù)，取CAFs和PDO細(xì)胞，1∶1混合，離心，用1∶1制備的基質(zhì)膠和PDO培養(yǎng)基混合液重懸，37℃培養(yǎng)箱放置10 min后，加入乳腺癌PDO培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.9 CCK8實(shí)驗(yàn) 分別設(shè)置PDO單獨(dú)培養(yǎng)組和PDO+CAFs共培養(yǎng)組，每孔種植5 000個(gè)CAFs和PDO細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)1、2、4、6和8 d。每次小心吸取3D培養(yǎng)的PDO，離心，棄上清液和基質(zhì)膠，用450μL新鮮PDO培養(yǎng)基和50μL CCK8重懸，37℃培養(yǎng)2 h后用分光光度計(jì)測(cè)量450 nm處的吸光度值［D（450 nm）］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料用±s表示，2組間差異比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織單細(xì)胞處理體系的改進(jìn)

根據(jù)既往研究［15-17］報(bào)道以及乳腺癌自身膠原蛋白的性質(zhì)，分別選用3種不同膠原酶比較細(xì)胞回收效率與細(xì)胞活性。收集5例乳腺癌新鮮腫瘤組織，分別以100μLⅠ型、Ⅲ型和Ⅳ膠原酶處理。結(jié)果顯示，Ⅳ膠原酶在消化40 min后可將乳腺癌組織消化成絮狀，而Ⅰ型、Ⅲ型膠原酶處理組均有明顯組織剩余。過(guò)濾離心后細(xì)胞計(jì)數(shù)，Ⅳ型膠原酶消化得到的細(xì)胞數(shù)明顯多于Ⅰ型和Ⅲ型膠原酶處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.045，P=0.017；圖1A）。過(guò)濾收集單細(xì)胞懸液，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活性，Ⅳ型膠原酶處理組的細(xì)胞存活率明顯高于Ⅰ型、Ⅲ型膠原酶處理組（圖1B、C），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005，P=0.048）。綜上，在同等條件下Ⅳ型膠原酶對(duì)乳腺癌組織的消化效率最高，對(duì)細(xì)胞活性保護(hù)最好。

圖1 不同種類的膠原酶對(duì)乳腺癌組織的消化效率和對(duì)細(xì)胞損傷的對(duì)比Fig 1 Comparison of digestion efficiency and cell damageof different types of collagenase in breast cancer tissues

2.2 PDO培養(yǎng)基和傳代方式的優(yōu)化

對(duì)同一患者（n=5）來(lái)源的PDO，采用不同F(xiàn)GF7和FGF10含量的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每日觀察3組PDO形成數(shù)量和直徑大小，并在培養(yǎng)的第5日和第10日拍照（圖2A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第10日FGF7和FGF10添加與否對(duì)PDO生成數(shù)量（P=0.556，P=0.842）以及三維球體大?。≒=0.842，P=0.800）均無(wú)顯著影響（圖2A）。進(jìn)一步比較不同EGF含量對(duì)PDO培養(yǎng)的影響，結(jié)果（圖2B）發(fā)現(xiàn)EGF高濃度組和低濃度組中PDO形成數(shù)量和球體直徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.225，P=0.719）；而與EGF高濃度組和低濃度組相比，EGF未添加組PDO培養(yǎng)成功率明顯降低，三維球體生成數(shù)量明顯減少（P=0.000），且球體直徑明顯減小（P=0.000）。

為簡(jiǎn)化PDO細(xì)胞傳代步驟，提高傳代效率，我們基于基質(zhì)膠和PDO密度不同的原理，采用梯度離心法分離基質(zhì)膠與PDO的混合物；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)速在900×g時(shí)，基質(zhì)膠和PDO可以完全分層。吸去基質(zhì)膠后再用消化酶消化的方法，相比于傳統(tǒng)用細(xì)胞恢復(fù)液消化基質(zhì)膠和直接用消化酶消化基質(zhì)膠與PDO的混合物的方法，消化時(shí)間縮短，對(duì)PDO保護(hù)作用更好，傳代效率更高。改良傳代方法后，PDO仍保持良好狀態(tài)，且可傳代20代以上（圖2C）。對(duì)58例乳腺癌組織的處理結(jié)果顯示，采用本研究改進(jìn)的PDO培養(yǎng)和傳代體系，培養(yǎng)成功率達(dá)79.3%（46/58）。

圖2 PDO培養(yǎng)和傳代條件的優(yōu)化和改進(jìn)Fig 2 Optimization and improvement of PDO culture and passage conditions

2.3 優(yōu)化培養(yǎng)后的PDO的鑒定與驗(yàn)證

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)乳腺癌PDO和原發(fā)灶中ER、PR和HER2蛋白的表達(dá)情況；結(jié)果顯示，優(yōu)化培養(yǎng)后獲得的乳腺癌PDO中ER、PR和HER2的表達(dá)水平與乳腺癌原發(fā)灶基本一致（圖3A）；定量分析結(jié)果顯示，各分子表達(dá)水平在PDO和原發(fā)灶之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05，圖3B）。進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)法比較上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和乳腺癌干細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)CDH1、TROP1和TROP2在乳腺癌原發(fā)灶及相應(yīng)PDO中的表達(dá)水平；結(jié)果顯示，同一患者來(lái)源PDO和原發(fā)灶的CDH1、TROP1和TROP2蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C、D）。

圖3 PDO的表面分子表達(dá)情況和組織學(xué)特點(diǎn)Fig 3 Molecular expression and histological characteristics of PDO

2.4 CAFs和PDO共培養(yǎng)體系的構(gòu)建

PDO三維球體懸浮生長(zhǎng)，而CAFs貼壁生長(zhǎng)。基于此，本研究將源自同一乳腺癌患者的CAFs和PDO分別培養(yǎng)，待兩者體外穩(wěn)定生長(zhǎng)之后，對(duì)其進(jìn)行鑒定，再進(jìn)行共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，PDO細(xì)胞表達(dá)腺上皮標(biāo)志物CK18而不表達(dá)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA（圖4A），表明其組成成分主要為乳腺癌腫瘤細(xì)胞；而經(jīng)分離并穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的CAFs表達(dá)FAP-α和α-SMA，證實(shí)了CAFs的存在（圖4B）。后續(xù)按照1∶1比例將CAFs與PDO混合，發(fā)現(xiàn)兩者可在同一培養(yǎng)體系中穩(wěn)定生長(zhǎng)，并可傳代培養(yǎng)（圖4C）。在PDO和CAFs穩(wěn)定共培養(yǎng)之后，鏡下觀察PDO的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與CAFs共同培養(yǎng)的PDO形態(tài)更加豐富多樣（圖4D）。高倍鏡下觀察PDO具體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與CAFs共同培養(yǎng)的PDO外形相對(duì)不規(guī)則，內(nèi)部可長(zhǎng)出多個(gè)囊腔（圖4E）。

為了探究CAFs對(duì)PDO生長(zhǎng)狀態(tài)是否產(chǎn)生影響，本研究比較單獨(dú)培養(yǎng)的PDO和與CAFs共同培養(yǎng)的PDO的生長(zhǎng)速度差別。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比較于單獨(dú)培養(yǎng)的PDO，與CAFs共同培養(yǎng)的PDO細(xì)胞生長(zhǎng)速度更快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4F）。

圖4 CAFs和PDO共培養(yǎng)體系構(gòu)建和CAFs對(duì)PDO形態(tài)異質(zhì)性以及生長(zhǎng)速度的影響Fig 4 Construction of CAFs and PDO co-culture system and influence of CAFs on morphological heterogeneity and growth rate of PDO

3 討論

隨著乳腺癌PDO培養(yǎng)體系的建立，發(fā)現(xiàn)其具有細(xì)胞系無(wú)法替代的功能，在新藥研發(fā)［18］、基因編輯［19-20］、指定個(gè)體化學(xué)治療（化療）方案制定［21］等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。大多數(shù)乳腺癌的纖維化程度非常嚴(yán)重，組織質(zhì)硬，難以徹底消化成單個(gè)細(xì)胞，而組織未完全消化導(dǎo)致細(xì)胞損失較多。乳腺癌的膠原纖維主要由Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原蛋白組成［22］，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原酶也已經(jīng)公開用于乳腺癌PDO標(biāo)本的培養(yǎng)處理；但采用何種膠原酶對(duì)組織進(jìn)行處理所得結(jié)果更優(yōu)目前尚未達(dá)成共識(shí)［23-24］。我們通過(guò)對(duì)比不同類型的膠原酶對(duì)乳腺癌組織的消化效率，發(fā)現(xiàn)相同酶濃度下，Ⅳ型膠原酶具有良好的消化效率，并且對(duì)細(xì)胞活性損傷較小。在此優(yōu)化的標(biāo)本處理?xiàng)l件下，體積較小的腫瘤或者穿刺腫瘤樣本PDO培養(yǎng)的成功率有望提高。

PDO的培養(yǎng)基成分復(fù)雜、價(jià)格昂貴，在應(yīng)對(duì)大規(guī)模培養(yǎng)和臨床廣泛推廣時(shí)成本高。因此，在保證獲得較高培養(yǎng)成功率的前提下，培養(yǎng)體系的優(yōu)化顯得尤為重要。現(xiàn)有PDO培養(yǎng)體系中R-spondin-1、noggin的主要作用為維持細(xì)胞干性狀態(tài)；A83-01、Y-27632、SB202190分別為TGF-β、ROCK、p38靶向抑制劑，抑制細(xì)胞分化［25］。FGF7、FGF10和EGF是促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖的因子，三者在上皮細(xì)胞或者間質(zhì)細(xì)胞中均可通過(guò)自分泌或者旁分泌的方式發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在PDO的培養(yǎng)中FGF7和FGF10并非必需添加因子，而EGF劑量減半仍可維持較好PDO體外生長(zhǎng)效率；后續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)后，培養(yǎng)成功率為79.3%（46/58）。此外，在本研究培養(yǎng)體系下，PDO可以穩(wěn)定傳代20代以上。免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，構(gòu)建成功的PDO模型與原發(fā)灶在ER、PR、HER2、CDH1、TROP1、TROP2表達(dá)上基本一致，表明該P(yáng)DO模型在簡(jiǎn)化培養(yǎng)體系、減小培養(yǎng)工作量的同時(shí)很好地保持了原發(fā)灶的特征和分子生物學(xué)特點(diǎn)，能夠滿足后續(xù)藥物篩選、功能驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的需求。

近年來(lái)的研究證明，CAFs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、耐藥和免疫微環(huán)境抑制中的作用越來(lái)越重要。CAFs可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子或者釋放外泌體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成［9］，也可以參與腫瘤化療耐藥的調(diào)節(jié)［26］。此外，CAFs在腫瘤免疫的調(diào)節(jié)過(guò)程中也起重要作用［27］。因此，向待研究的腫瘤體系引入CAFs至關(guān)重要。對(duì)于乳腺癌PDO和同一患者來(lái)源原代CAFs動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)未見相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)乳腺癌CAFs和PDO共培養(yǎng)體系的建立，可以提高PDO細(xì)胞的增殖速度且促使PDO形態(tài)更加多樣，使其呈現(xiàn)更強(qiáng)的異質(zhì)性。

本研究?jī)?yōu)化了類器官標(biāo)本處理、培養(yǎng)、傳代等一系列操作步驟，使得類器官培養(yǎng)成本降低，培養(yǎng)時(shí)間縮短，有助于日后大規(guī)模培養(yǎng)擴(kuò)增PDO。引入同一患者來(lái)源的CAFs和PDO動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)體系，之前在乳腺癌中尚未有相關(guān)報(bào)道。該培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便易行，可用于CAFs和乳腺癌細(xì)胞交互作用的動(dòng)態(tài)研究，并為后續(xù)研究CAFs和PDO共同培養(yǎng)后CAFs和PDO的基因表達(dá)譜變化、培養(yǎng)體系中分泌蛋白變化以及藥物的篩選等打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

參·考·文·獻(xiàn)

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