健脾化濁飲對(duì)代謝相關(guān)脂肪性肝病大鼠腸肝軸體系影響的研究

楊洪超，徐龍進(jìn)，孫建光

(1.青島市中醫(yī)醫(yī)院(青島市海慈醫(yī)院)，山東 青島 266000；2. 山東省疾病預(yù)防控制中心，山東 濟(jì)南 250000；3. 山東省中醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000)

代謝相關(guān)脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease, MAFLD)在2020年初發(fā)布的MAFLD新定義的國(guó)際專家共識(shí)聲明中正式提出(該聲明由22個(gè)國(guó)家的30位專家共同參與)，自此MAFLD取代了沿用40年的非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)一名，新的病名強(qiáng)調(diào)了該病是代謝功能障礙性疾病，代謝功能紊亂是其發(fā)生的前提和基礎(chǔ)，亦是核心發(fā)病機(jī)制[1-3]。腸道是人體重要的消化吸收代謝器官之一，近10年隨著對(duì)“腸肝軸”病理生理認(rèn)識(shí)的不斷加深，腸道微生態(tài)環(huán)境紊亂、腸源性內(nèi)毒素血癥、膽汁酸代謝紊亂等機(jī)制一直備受矚目，極有可能成為治療MAFLD的重要突破點(diǎn)。目前中醫(yī)學(xué)對(duì)MAFLD的病因病機(jī)、辨證論治已經(jīng)有較為深入的認(rèn)識(shí)，認(rèn)為該病屬于氣血津液病變范疇，臟腑功能失調(diào)、氣血津液代謝障礙，痰濕濁瘀內(nèi)生蘊(yùn)于肝而發(fā)[4]，這與目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)該病的認(rèn)識(shí)不謀而合。健脾化濁飲是在中醫(yī)氣血津液代謝理論指導(dǎo)下，結(jié)合臨床實(shí)踐，以健脾化濁、祛濕化痰為主要治法組方而成，前期臨床研究證實(shí)健脾化濁飲可明顯改善MAFLD患者胰島素抵抗[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在圍繞腸肝軸體系探討健脾化濁飲作用機(jī)制，希望為MAFLD的治療及中藥復(fù)方作用機(jī)制研究提供一定的參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物與飼料 SPF級(jí)6周齡雄性SD大鼠44只，體重(200±20)g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)：SCXK(魯)20140007。普通飼料：大小鼠維持飼料，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司；高脂飼料，由北京華阜康生物科技股份有限公司制作，4 ℃冷藏。高脂飼料配方：維持飼料52.9 %，蔗糖20%，豬油15%，膽固醇1.5%，膽酸鈉0.5%，酪蛋白9.1%，磷酸氫鈣0.6%，石粉0.4%。所有飼料均進(jìn)行鈷-60輻射消毒。

1.2藥物及試劑 健脾化濁飲組方：麩炒蒼術(shù)(18050031)15 g、麩炒白術(shù)(18050137)15 g、炒薏苡仁(18030739)30 g、云茯苓(18062077)15 g、陳皮(18040836)9 g、澤瀉(18051200)12 g、決明子(18041796)15 g、荷葉(18060269)15 g、炒冬瓜仁(18041578)30 g、莪術(shù)(18050366)9 g、生山楂(18041326)15 g、敗醬草(18054624)20 g、茵陳(18041042)30 g、白豆蔻(18051384)9 g，以上中藥均為中藥配方顆粒，購(gòu)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診，由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。每劑藥濃縮至50 mL，約含生藥2 g/mL。糞便基因組DNA提取試劑盒(貨號(hào)：DP328)，天根生化科技(北京)有限公司；Occludin抗體(貨號(hào)：GB11049)，武漢賽維爾生物科技有限公司；大鼠D-乳酸(D-Lac)ELISA試劑盒(批號(hào)：20190228)，南京建成生物工程研究所。TLR4抗體(貨號(hào)：BA1717)，武漢博士德生物工程有限公司；NF-κB抗體(貨號(hào)：GB11142)，武漢賽維爾生物科技有限公司；大鼠脂多糖/內(nèi)毒素(LPS)ELISA試劑盒(批號(hào)：Y19017504)，武漢華美生物工程有限公司。

1.3儀器 DxC800 型全自動(dòng)生化儀 (美國(guó)Beckman Coulter 公司)；離心機(jī)(型號(hào)：H1650R)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)：JY04S-3C)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；熒光定量PCR儀(型號(hào)：PIC-200)，BIO-RAD；冷凍離心機(jī)(型號(hào)：neofuge13R)，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；轉(zhuǎn)印電泳儀(型號(hào)：DYCZ-40D)，北京六一儀器廠。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 44只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，自由進(jìn)食飲水。5 d后隨機(jī)取8只大鼠作為正常組，給予普通飼料喂養(yǎng)；其余36只大鼠采用高脂飲食誘導(dǎo)的方法建立MAFLD模型，均自由進(jìn)食飲水。飼養(yǎng)12周后，隨機(jī)選取1只正常大鼠和1只造模大鼠行肝組織HE染色判斷模型完成情況。判斷造模成功后，將35只MAFLD模型大鼠隨機(jī)分為模型組8只、健脾化濁飲低劑量組8只、健脾化濁飲中劑量組9只、健脾化濁飲高劑量組10只。正常組大鼠繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，給予生理鹽水灌胃；各造模組繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，其中模型組給予生理鹽水灌胃，健脾化濁飲低、中、高劑量組分別給予含生藥10，15，20 g/kg的健脾化濁飲灌胃。各組均每天灌胃1次，共灌胃8周。

1.5標(biāo)本采集 灌胃結(jié)束后，以10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，心臟直接穿刺取血，血樣靜置30 min后離心，保存于-80 ℃冰箱備用。打開腹腔，摘取大鼠肝臟，觀察外觀并稱重，一部分置于組織固定液中固定，剩余肝臟置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；取大鼠回腸2 cm置于組織固定液中固定，取大鼠結(jié)腸糞便3～4粒置于-80 ℃冰箱保存。上述過程嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行，避免標(biāo)本污染。

1.6觀察指標(biāo)及方法

1.6.1大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中觀察各組大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)、大便、皮毛等情況。

1.6.2血清指標(biāo)測(cè)定 取血樣，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸基轉(zhuǎn)移酶(AST)、空腹血糖(FPG)水平；采用ELISA法測(cè)定LPS、D-Lac水平，按照試劑盒說明操作。

1.6.3肝組織病理觀察

1.6.3.1蘇木素-伊紅(HE)染色 取組織固定液固定后的大鼠肝組織，脫水后石蠟包埋，切片機(jī)石蠟切片，依次將切片脫蠟至水，蘇木素染色、伊紅染色，脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，采集圖像分析。

1.6.3.2油紅O染色 將固定后的肝組織恒冷箱切片附貼于載片上，60%異丙醇稍洗切片，在密閉容器內(nèi)油紅O液染5～15 min，60%異丙醇洗去多余染液，自來水洗，蘇木素染細(xì)胞核2 min，水洗至細(xì)胞核藍(lán)化，甘油明膠封固。鏡下觀察，脂類物質(zhì)顯示紅色，細(xì)胞核顯示藍(lán)色。將切片置于40倍物鏡下觀察并采集圖像分析。

1.6.4回腸組織病理觀察

1.6.4.1HE染色 取4%多聚甲醛固定液固定后的大鼠回腸組織，脫水后石蠟包埋，切片機(jī)石蠟切片，HE染色，脫水后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，采集圖像分析。

1.6.4.2腸道緊密連接蛋白Occludin免疫組化 石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，切片放入3%雙氧水溶液，血清封閉，加一抗、二抗，DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片。蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出的陽性表達(dá)為棕黃色。運(yùn)用Image-pro plus 6.0軟件計(jì)算平均光密度值(AO值)以進(jìn)行定量分析。

1.6.5肝組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè) 取大鼠肝組織100 mg，液氮研磨后加入蛋白裂解液1 mL及相關(guān)抑制劑，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清，即為總蛋白溶液。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度；SDS-PAGE電泳后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)(300 mA恒流轉(zhuǎn)膜30 min，或者200 mA轉(zhuǎn)膜1 h)，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別稀釋TLR4抗體(1∶300)、NF-κB抗體(1∶600)，4 ℃孵育過夜，室溫下TBST洗膜，加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗鼠IgG，1∶3 000) ，搖床孵育1 h，洗膜后ECL試劑盒發(fā)光顯影，Alpha Ease FC軟件定量分析條帶灰度值，結(jié)果采用Graph Prism7軟件繪圖。

1.6.6糞便中大腸桿菌、乳酸桿菌相對(duì)含量RT-PCR檢測(cè) 取180～220 mg糞便樣本進(jìn)行糞便基因組提取，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。根據(jù)16Sr DNA V3可變區(qū)基因序列，通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)資源比較并篩選出特異性和代表性強(qiáng)的引物，引物由Servicebio公司合成，內(nèi)參16S rRNA由濟(jì)南研達(dá)生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)，青島派森諾合成。大腸桿菌引物序列：F為5’-CGAGAAACTGGCGATCCTTA-3’，R為5’-CTTCATCAAGCGGTTTCACA-3’；乳酸桿菌引物序列：F為5’-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3’，R為5’-CACCGCTACACATGGAG-3’；16S rRNA：338F為5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，806R為5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。建立RT- PCR反應(yīng)體系：溶解2×SuperReal PreMix Plus、模板、引物和RNase-Free ddH2O，將所有試劑在室溫下平衡并徹底混勻，采用三步法PCR反應(yīng)程序進(jìn)行 PCR反應(yīng)。蓋上反應(yīng)管，輕柔混勻，確保所有組分均在管底。將反應(yīng)體系置于熒光定量PCR儀中，開始反應(yīng)?？瞻捉M設(shè)為“1”，計(jì)算各組相對(duì)含量，結(jié)果采用Graph Prism7軟件繪圖。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 造模4周時(shí)，各造模大鼠體重較正常大鼠增長(zhǎng)迅速，而且造模大鼠開始出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍、嗜睡、大便稀溏、皮毛枯黃表現(xiàn)，隨造模時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重；實(shí)驗(yàn)過程中正常組大鼠體重均勻增長(zhǎng)，行動(dòng)敏捷，反應(yīng)迅速，大便正常，皮毛潤(rùn)澤；灌胃結(jié)束時(shí)健脾化濁飲各組大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)、大便、皮毛等均有不同程度好轉(zhuǎn)。

2.2各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較 模型組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、FPG、LPS、D-Lac水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；健脾化濁飲中、高劑量組血清ALT、AST、TC、TG、FPG、LPS、D-Lac水平及健脾化濁飲低劑量組ALT、AST水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和代謝相關(guān)脂肪性肝病各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較

2.3各組大鼠肝臟病理學(xué)表現(xiàn)

2.3.1HE染色表現(xiàn) 正常組大鼠肝小葉清晰完整，結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝細(xì)胞胞漿致密均勻，細(xì)胞核位于中央，肝細(xì)胞無變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹，排列紊亂，邊界不清，肝細(xì)胞內(nèi)充滿大小不等脂肪空泡，呈局灶分布，伴見空泡融合，細(xì)胞核被擠到細(xì)胞的一邊，細(xì)胞核變形、深染，并出現(xiàn)氣球樣變，肝小葉內(nèi)可見不同程度的局灶性炎性灶，有匯管區(qū)炎癥、壞死；健脾化濁飲各組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡不同程度減少，散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中健脾化濁飲高劑量組病理改變更輕。見圖1。

圖1 正常組和代謝相關(guān)脂肪性肝病各組大鼠肝組織HE染色表現(xiàn)(×40)

2.3.2油紅O染色表現(xiàn) 正常組大鼠肝細(xì)胞散在點(diǎn)狀紅色脂肪滴；模型組大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)大量紅色脂滴，融合成片，核居于細(xì)胞邊緣；健脾化濁飲各組大鼠肝細(xì)胞紅色脂滴大小和范圍均有不同程度的減少，其中健脾化濁飲高劑量組減少更明顯。見圖2。

圖2 正常組和代謝相關(guān)脂肪性肝病各組大鼠肝組織油紅O染色表現(xiàn)(×40)

2.4各組大鼠回腸組織病理學(xué)表現(xiàn)

2.4.1HE染色表現(xiàn) 正常組大鼠小腸黏膜絨毛細(xì)長(zhǎng)，排列整齊緊密，表面結(jié)構(gòu)完整，無充血、水腫，上皮細(xì)胞無水腫、脫落，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠小腸黏膜絨毛排列紊亂，出現(xiàn)斷裂、缺失，間隙增寬，上皮細(xì)胞脫落，可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；健脾化濁飲各組大鼠小腸黏膜絨毛排列較模型組整齊，缺失斷裂減少，其中健脾化濁飲高劑量組更接近正常。見圖3。

圖3 正常組和代謝相關(guān)脂肪性肝病各組大鼠回腸組織HE染色(×40)

2.4.2Occludin蛋白免疫組化表現(xiàn)及定量 正常組大鼠小腸黏膜Occludin蛋白染色表現(xiàn)為棕黃色顆粒，沿小腸黏膜上皮細(xì)胞頂端呈線狀連續(xù)性分布，染色均勻，定量為0.021±0.002。模型組大鼠小腸黏膜Occludin蛋白陽性染色顆粒減少明顯，分布紊亂、不連續(xù)，染色分布不均勻，定量為0.006±0.001，明顯低于正常組(P<0.05)。健脾化濁飲各組小腸黏膜Occludin蛋白陽性顆粒較模型組增多，分布較均勻，其中健脾化濁飲高劑量組改善更明顯，低、中、高劑量組定量分別為0.006±0.001,0.016±0.003,0.018±0.002,中、高劑量組均明顯高于模型組(P均<0.05)。見圖4。

圖4 正常組和代謝相關(guān)脂肪性肝病各組大鼠回腸組織Occludin蛋白免疫組化染色表現(xiàn)(×40)

2.5各組大鼠肝組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)情況 模型組大鼠肝組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05)；健脾化濁飲中、高劑量組大鼠肝組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，健脾化濁飲高劑量組均明顯低于健脾化濁飲中劑量組(P均<0.05),健脾化濁飲低劑量組與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖5。

圖5 正常組和代謝相關(guān)脂肪性肝病各組大鼠肝組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)情況

2.6各組大鼠糞便中大腸桿菌和乳酸桿菌相對(duì)含量比較 模型組大鼠糞便中大腸桿菌相對(duì)含量明顯高于正常組(P<0.05)，乳酸桿菌相對(duì)含量明顯低于正常組(P<0.05)；健脾化濁飲中、高劑量組大鼠糞便中大腸桿菌相對(duì)含量明顯低于模型組(P均<0.05)，乳酸桿菌相對(duì)含量明顯高于模型組(P均<0.05)，健脾化濁飲中劑量組與健脾化濁飲高劑量組比較、健脾化濁飲低劑量組與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖6。

圖6 正常組和代謝相關(guān)脂肪性肝病各組大鼠糞便中大腸桿菌和乳酸桿菌相對(duì)定量比

3 討 論

1998年，Marshall正式提出“腸肝軸”概念，指出腸道與肝臟兩大器官在解剖結(jié)構(gòu)、生理病理和免疫防御等方面存在密切聯(lián)系[6]。腸道與肝臟共同起源于內(nèi)胚層的前腸，腸道通過門脈系統(tǒng)與肝臟相通，門靜脈收集的腸道靜脈血占肝臟血供的70%。腸道屏障參與構(gòu)成了人體同外源性物質(zhì)接觸的第一道防線，肝臟提供第二道防線。腸道靜脈血中富含各種細(xì)菌產(chǎn)物和毒素，經(jīng)門靜脈系統(tǒng)入肝后，肝臟固有免疫系統(tǒng)激活發(fā)揮防御和清除作用。當(dāng)腸道屏障受損時(shí)，腸黏膜通透性增加，大量細(xì)菌和內(nèi)毒素等通過門脈系統(tǒng)入肝，激活肝臟Kupffer細(xì)胞和肝細(xì)胞，釋放一系列炎癥因子，引發(fā)肝臟甚至全身性炎癥反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)一步加重腸黏膜損傷。腸道與肝臟之間存在的這種生理病理上的關(guān)系即表述為“腸肝軸”。

最新國(guó)際專家共識(shí)指出，對(duì)于肝活檢組織學(xué)顯示肝細(xì)胞脂肪變或者影像學(xué)彌漫性脂肪肝或者脂肪肝指數(shù)等判別模型提示脂肪肝的患者，只要合并超重/肥胖、2型糖尿病、代謝功能障礙(腹型肥胖、高血壓、血TC水平升高、高密度脂蛋白水平下降、血糖升高但無糖尿病、胰島素抵抗指數(shù)升高、超敏C反應(yīng)蛋白升高等指標(biāo)中2項(xiàng)及以上)中任一條件即可診斷為 MAFLD。這一診斷標(biāo)準(zhǔn)肯定了代謝紊亂是MAFLD的重要發(fā)病基礎(chǔ)，而既往研究已證實(shí)腸肝軸是發(fā)生肥胖和MAFLD發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制，腸道細(xì)菌也是胰島素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵性因子[7]，腸道細(xì)菌在MAFLD發(fā)生發(fā)展中是一個(gè)驅(qū)動(dòng)因素，腸道細(xì)菌引起MAFLD 是一個(gè)多因素復(fù)雜作用的結(jié)果，包括小腸細(xì)菌過度生長(zhǎng)[8]、代謝內(nèi)毒素血癥、低度炎癥、能量調(diào)節(jié)平衡失調(diào)、內(nèi)源性大麻素樣系統(tǒng)調(diào)節(jié)[9]、內(nèi)源性乙醇產(chǎn)生增加[10]、膽堿代謝調(diào)節(jié)、膽汁酸平衡的調(diào)節(jié)[11]、腸道細(xì)菌通過刺激肝細(xì)胞Toll樣受體( TLR) -9-依存性前纖維化途徑導(dǎo)致肝纖維化[12]等。

腸道細(xì)菌可引起腸道炎癥和腸黏膜屏障功能障礙。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，進(jìn)食高脂飼料的小鼠伴有明顯腸道炎癥，高脂飲食和腸道細(xì)菌之間相互作用促進(jìn)炎癥發(fā)生[13]。機(jī)械屏障在腸黏膜屏障中占據(jù)最重要的地位，完整的腸黏膜上皮細(xì)胞以及上皮細(xì)胞間的緊密連接是構(gòu)成機(jī)械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Occludin蛋白是緊密連接蛋白最為重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，亦是發(fā)現(xiàn)最早的參與腸道通透性調(diào)節(jié)的緊密連接蛋白[14]。腸黏膜機(jī)械屏障受損、菌群失調(diào)可導(dǎo)致腸黏膜通透性增高，使得腸道革蘭陰性菌釋放的內(nèi)毒素大量入血，形成腸源性內(nèi)毒素血癥。菌群結(jié)構(gòu)失衡，小腸細(xì)菌過度生長(zhǎng)，又增加了內(nèi)毒素等細(xì)菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重腸黏膜的損傷并增加腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在MAFLD患者中，血清內(nèi)毒素水平與D-Lac的濃度呈正相關(guān)，D-Lac可以反映腸道黏膜通透性的變化[15]。由于腸道屏障功能障礙，致使血清內(nèi)毒素水平顯著增高引發(fā)肝損傷，其機(jī)制為L(zhǎng)PS或內(nèi)毒素驅(qū)動(dòng)腸道細(xì)菌易位，通過功能障礙的腸道屏障到達(dá)門靜脈和肝，在肝激活炎癥細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)[16]。LPS是Kupffer細(xì)胞的強(qiáng)效激活劑，LPS可與TLR4、CD14、LBP、分泌蛋白MD-2組成受體復(fù)合物，活化Iκ-B激酶釋放NF-κB，后者進(jìn)入細(xì)胞核后，與啟動(dòng)子或增強(qiáng)子結(jié)合，增強(qiáng)TNF-α、IL-1和IL-6等前炎癥細(xì)胞因子基因的表達(dá)，從而促進(jìn)TNF-α、IL-1和IL-6等炎癥因子的合成和釋放，放大內(nèi)毒素效應(yīng)，誘發(fā)肝臟炎癥和損傷。大量研究已經(jīng)證實(shí)TLR4/NF-κB信號(hào)通路參與MAFLD的發(fā)生發(fā)展，正常情況下，TLR4等在肝內(nèi)表達(dá)較低，當(dāng)處于MAFLD狀態(tài)下，該通路相關(guān)蛋白如TLR4、NF-κB等出現(xiàn)高表達(dá)，而且其表達(dá)與肝組織的炎癥反應(yīng)和脂肪變性呈正相關(guān)[17-18]。

中醫(yī)認(rèn)為脾為后天之本，氣血生化之源，脾的運(yùn)化功能在氣血津液的運(yùn)行過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。臨床中飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞逸失度、稟賦不足和久病體虛是導(dǎo)致MAFLD的主要病因，這些因素均可損傷脾胃，導(dǎo)致脾胃虛弱、脾失健運(yùn)。脾主運(yùn)化功能受損，水谷精微輸布失常，則導(dǎo)致痰濕濁邪內(nèi)生而發(fā)為MAFLD，可見脾失健運(yùn)、痰濕濁邪內(nèi)生是該病的主要病機(jī)。健脾化濁飲方中蒼術(shù)、白術(shù)健脾益氣、燥濕化痰為君藥；薏苡仁、茯苓健脾滲濕共為臣藥；澤瀉、荷葉、決明子利水滲濕、升清降濁，冬瓜子祛濕化痰，莪術(shù)破血行氣、消積化瘀，山楂消食化積兼祛瘀濁共為佐藥；茵陳、敗醬草清熱利濕、活血解毒，白蔻、陳皮行氣化濕和中，共為使藥。諸藥配伍，共奏健脾化濁、祛濕化痰、消積化瘀之功?，F(xiàn)代藥理研究顯示，蒼術(shù)具有改善胃腸功能，調(diào)節(jié)腸道菌群以及保護(hù)肝臟的功能[19]。白術(shù)具有調(diào)節(jié)腸道功能、保護(hù)腸黏膜屏障等作用[20]，并且白術(shù)精提物可調(diào)節(jié)高脂大鼠血脂水平，促進(jìn)脂質(zhì)代謝轉(zhuǎn)運(yùn)[21]。茯苓可降低腸道的pH值，對(duì)菌群失調(diào)小鼠的腸道菌群具有扶植作用，可提高雙歧桿菌的黏附性[22]。薏苡仁能夠影響腸道菌群多樣性，薏苡仁的提取物能促進(jìn)益生菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌等)的生長(zhǎng)，抑制病原菌(埃希菌、葡萄球菌及沙門菌等)的生長(zhǎng)，改善結(jié)腸炎癥狀[23-24]。郭雨雅[25]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加味澤瀉湯(澤瀉、白術(shù)、大黃)治療NAFLD患者療效確切，而且對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NAFLD模型TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白具有抑制作用。荷葉、山楂、決明子具有降血脂、保肝等作用。茵陳、敗醬草具有保肝及抗氧化等作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、FPG水平明顯升高，健脾化濁飲各組大鼠上述指標(biāo)明顯降低，肝組織脂肪變性和炎癥程度亦明顯減輕，說明健脾化濁飲可明顯改善MAFLD；模型組大鼠血清LPS、D-Lac水平及肝組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯增高，腸黏膜Occludin蛋白表達(dá)減少，糞便中大腸桿菌增加，乳酸桿菌減少，健脾化濁飲各組大鼠上述指標(biāo)均不同程度改善，而且健脾化濁飲高劑量組改善更為顯著。表明健脾化濁飲具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，降低腸黏膜通透性，保護(hù)腸黏膜屏障的作用，進(jìn)而抑制LPS/TLR4/NF-κB信號(hào)通路，阻斷腸肝損傷的惡性循環(huán)，從而達(dá)到治療MAFLD的作用。

綜上所述，MAFLD是一個(gè)慢性的、多系統(tǒng)的、代謝障礙性的復(fù)雜疾病，目前尚無有效而安全的治療藥物，新藥的研發(fā)迫在眉睫。中醫(yī)藥在整體觀念、辨證論治的指導(dǎo)下，具有多途徑、多靶點(diǎn)、個(gè)體化的治療特點(diǎn)，在MAFLD治療方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。腸道作為參與人體代謝的重要器官之一，也是中醫(yī)藥發(fā)揮作用的重要靶點(diǎn)。本研究顯示健脾化濁飲對(duì)腸肝軸體系具有調(diào)節(jié)作用，腸道細(xì)菌可能是其調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，值得后期進(jìn)一步研究和挖掘，希望為MAFLD的治療做出積極的貢獻(xiàn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。