植物激素和光暗培養(yǎng)條件對卷丹百合再生體系的影響

劉彥珍 郜新強(qiáng) 張?jiān)? 陳思 郝靜 呂有軍

摘要：【目的】探究植物激素和光暗培養(yǎng)條件對卷丹百合（Lilium lancifolium Thunb）再生體系的影響，為卷丹百合種質(zhì)資源開發(fā)和大面積推廣種植打下基礎(chǔ)。【方法】以卷丹百合鱗片為外植體，分析培養(yǎng)基中不同植物激素[NAA、6-BA、2，4-D、噻苯隆（TDZ）和毒莠定（PIC）]配比及光（光照時(shí)間14 h/d）、暗（全天黑暗）培養(yǎng)條件對卷丹百合鱗片愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及不定芽再生的影響，建立卷丹百合組培高效再生體系。【結(jié)果】與不添加任何激素的對照（CK）相比，添加激素的培養(yǎng)基均能顯著提高卷丹百合鱗片愈傷組織的誘導(dǎo)率（P<0.05），其中TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L組合的效果最佳，暗培養(yǎng)條件下其愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)65.57%;在TDZ 0.4 mg/L+2，4-D 0.05 mg/L的培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)20 d后，再轉(zhuǎn)入TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基中繼續(xù)暗培養(yǎng)40 d，愈傷組織增殖倍數(shù)最高，可達(dá)2.45倍。6-BA與NAA組合比6-BA與PIC組合更利于誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生，芽再生倍數(shù)最高的培養(yǎng)基為6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L，暗培養(yǎng)條件下其再生倍數(shù)最高可達(dá)6.08倍。與光培養(yǎng)相比，暗培養(yǎng)更利于愈傷組織誘導(dǎo)和增殖，但在愈傷組織誘導(dǎo)不定芽階段，長時(shí)間暗培養(yǎng)不利于芽的生長，暗培養(yǎng)20 d后轉(zhuǎn)移至光培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)40 d，生成的不定芽色澤鮮綠，葉片伸展，長勢旺盛，利于壯苗和生根?！窘Y(jié)論】卷丹百合組織培養(yǎng)的不同階段受不同種類和濃度的植物激素組合影響;暗培養(yǎng)條件更利于愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖，暗培養(yǎng)結(jié)合光培養(yǎng)條件最適合不定芽的再生和分化。

關(guān)鍵詞： 卷丹百合;植物激素;光暗條件;再生體系

中圖分類號(hào)： S682.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）05-1300-10

Abstract：【Objective】In order to lay a foundation for germplasm resources development and large area popularization of Lilium lancifolium Thunb， investigated the effects of plant hormones and light and dark culture conditions on the regeneration system of lily. 【Method】Using lily scales as explants， analyzing the effects on callus induction， proliferation and adventitious bud regeneration in lily scales affected by the ratio of different plant hormones[NAA， 6-BA， 2，4-D， thidiazuron（TDZ） and 4-amino-3，5，6-trichloropicolinic acid（PIC）] in the medium and light（illumination time：14 h/d） and dark（dark all day） culture conditions， to establish an efficient regeneration system for lily tissue culture. 【Result】Compared with the control that adding no hormones（CK）， mediea with different hormone combinations could significantly improve the callus induction rate of L. lancifolium（P<0.05）. The combination of TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L showed the best induction effectiveness， and the callus induction rate reached 65.57% under dark culture conditions. The scales of L. lancifolium was firstly cultured in TDZ 0.4 mg/L+2，4-D 0.05 mg/L for 20 d in the dark ， and then cultured in TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L for 40 d in dark condition. In this case， the proliferation rate of callus was the highest， up to 2.45 times. The combination of 6-BA and NAA was more favorable to the induction of adventitious buds than the combination of 6-BA and PIC. The medium with the highest regeneration multiple was 6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L， and its regene-ration multiple was up to 6.08 times in dark condition. Compared with light culture， the dark culture was more conducive to callus induction and proliferation， but in the adventitious bud stage of the callus， the long-time dark culture was adverse to the growth of the bud. After incubating for 20 d in dark condition， the scales of L. lancifolium were transferred to the light condition and continue to cultivating for 40 d， the generated adventitious buds were bright green in colour， and its leaves were spreading and growing vigorously. Such adventitious buds were helpful to strong seedling and rooting. 【Conclusion】Different stages of tissue culture of L. lancifolium are affected by plant. Combination of different kinds and concentrations. Dark culture is more favorable to callus induction and proliferation， the combination of dark culture and light culture is the most suitable for the regeneration and differentiation of adventitious buds.

Key words： Lilium lancifolium Thunb; plant hormone; light and dark conditions; regeneration system

Foundation item： Henan Science and Technology Project（182102110209）; Anyang Science and Technology Project（2018-124）

0 引言

【研究意義】卷丹百合（Lilium lancifolium Thunb）學(xué)名斑百合，為百合科百合屬（Lilium spp.）多年生草本球根植物，具有較強(qiáng)的耐寒性和耐強(qiáng)日照性，種植適應(yīng)性較廣（洪波，2000;段祖安等，2009）。卷丹百合觀賞價(jià)值高，食用價(jià)值和藥用價(jià)值也極高，市場應(yīng)用前景廣闊，但由于其常規(guī)繁育方法繁殖周期較長，繁殖系數(shù)低（胥京宜，1999），制約了其產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。因此，縮短卷丹百合繁殖周期，提高其繁殖系數(shù)，是當(dāng)前卷丹百合產(chǎn)業(yè)化發(fā)展面臨的主要問題，而建立卷丹百合的組培快繁技術(shù)體系是提高其繁殖效率和質(zhì)量的有效途徑，尤其是通過誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織，進(jìn)而由愈傷組織分化出無菌苗，可極大提高卷丹百合的繁殖效率，對其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，以百合鱗片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織從而建立再生體系的研究較多。影響百合愈傷組織形成及再生體系建立的因素較多，包括百合種類的基因型、外植體生理狀態(tài)、培養(yǎng)基類型及培養(yǎng)條件等。培養(yǎng)基中的植物激素種類及配比研究目前已有較多報(bào)道。邱嵐等（2015）對梵凈山野百合（L. brownii）鱗片進(jìn)行愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)，結(jié)果表明，最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L，最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L。梁芳等（2017）以百合西伯利亞（Lilium×siberia）和索邦（Lilium×sorbonne）的鱗片為外植體，添加不同濃度的NAA、6-BA、噻苯?。═DZ）、呋喃氨基嘌呤（KT）和吲哚丁酸（IBA），篩選出鱗片愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、分化及再生苗生根的最佳培養(yǎng)基。張旭紅等（2018）以歐洲百合（L. martagon）無菌苗鱗片為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，探討了NAA、6-BA、TDZ和毒莠定（PIC）不同濃度組合對愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及再生不定芽的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)愈傷組織形成的最佳組合為0.2 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA，促進(jìn)愈傷組織增殖及不定芽再生的最佳激素組合為0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。張文婷等（2019）以金黃花滇百合（L. bakerianum var. aureum）的鱗片為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)愈傷組織形成的最適植物激素組合為1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，誘導(dǎo)不定芽增殖的最適植物激素組合為0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。符勇耀等（2020）研究得出誘導(dǎo)卷丹愈傷組織形成的最佳材料為無菌小鱗片，愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.00 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA+0.20 mg/L KT+0.05 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖，愈傷組織繼代增殖最佳培養(yǎng)基為MS+1.00 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA+0.20 mg/L KT+0.10 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖?？铝x強(qiáng)等（2020）對蘭州百合[L. davidii var. unicolor（Hoog） Cotton]新鮮鱗莖進(jìn)行誘導(dǎo)，得出在MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織形成和不定芽產(chǎn)生的最佳植物激素組合均為0.3 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA。李婷婷等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥葉大百合（Cardiocrinum cathayanum）鱗片愈傷組織誘導(dǎo)的最適激素組合為1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，最利于愈傷組織分化不定芽的激素組合為2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。田山君等（2020）研究了不同激素配比對卷丹百合擴(kuò)繁的影響，發(fā)現(xiàn)6-BA與NAA組合對誘導(dǎo)卷丹百合莖尖不定芽的產(chǎn)生和增殖效果明顯。再生體系的建立除受植物激素種類及配比的影響外，還受到光暗因子的影響。任建宏等（2017）以平陸百合（L. brownie var. virridulum）的鱗片為外植體，研究光照和黑暗培養(yǎng)條件對其愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光照培養(yǎng)更利于愈傷組織的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率超過57%，而黑暗培養(yǎng)誘導(dǎo)率僅為50%。張旭紅等（2018）認(rèn)為暗培養(yǎng)條件下歐洲百合鱗片愈傷組織的誘導(dǎo)率、增殖指數(shù)和芽再生系數(shù)均最高，分別可達(dá)77.14%、2.93和5.43，且愈傷組織生長狀態(tài)較好，不定芽生根正常。王玉英等（2019）發(fā)現(xiàn)不同LED光源對百合組培苗小子球增殖效果存在顯著影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以卷丹百合無菌鱗片為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織形成及增殖的研究目前雖有報(bào)道，但以愈傷組織為基礎(chǔ)誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生的激素因子以及影響整個(gè)快繁體系的光暗因子的系統(tǒng)研究尚無文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以卷丹百合鱗片為外植體，以激素配比和光暗因子為主要切入點(diǎn)，探索愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及不定芽再生的最適激素組合和光暗因子對各生長階段的影響，建立組培高效再生體系，為卷丹百合種質(zhì)資源開發(fā)和大面積推廣種植打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年3—10月在河南安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院細(xì)胞工程試驗(yàn)室進(jìn)行。卷丹百合鱗莖球直徑8～10 cm，購自河南省安陽市寶蓮寺鎮(zhèn)盛蕊花木基地;植物激素NAA、6-BA和2，4-D購自北京康倍斯科技有限公司，TDZ和PIC購自鄭州奧里吉生物科技有限公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 外植體材料處理 剪去鱗莖球根系，去掉外層老化鱗片，用溫洗衣粉水漂洗20 min，然后自來水沖洗30 min以上。在超凈工作臺(tái)上，將鱗莖球先用75%酒精溶液浸泡30 s，無菌水沖洗2～3次，再用0.1%氯化汞溶液消毒10～12 min，無菌水沖洗3～5次，備用。

1. 2. 2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 以MS為基本培養(yǎng)基（生根培養(yǎng)為1/2MS），添加2.5%蔗糖和0.7%瓊脂，調(diào)節(jié)pH 5.8～6.0。各培養(yǎng)基中添加的不同激素種類和濃度，在參閱資料的基礎(chǔ)上確定濃度范圍，然后通過預(yù)試驗(yàn)確定最終添加的濃度組合。培養(yǎng)溫度23～25 ℃，環(huán)境濕度70%～80%，光培養(yǎng)時(shí)光照強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)間14 h/d;暗培養(yǎng)時(shí)全天黑暗（錫箔紙包裹）。

1. 2. 3 愈傷組織誘導(dǎo) 在超凈工作臺(tái)上，從無菌培養(yǎng)皿中用鑷子將經(jīng)過滅菌處理的鱗片剝離鱗莖球，將鱗片切成1 cm×1 cm大小的塊狀，接種于表1的培養(yǎng)基上，置于黑暗條件下對鱗片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，篩選誘導(dǎo)效果較好的培養(yǎng)基組合;使用黑暗條件下誘導(dǎo)效果較好的組合培養(yǎng)基對鱗片進(jìn)行光培養(yǎng)誘導(dǎo)，并與暗培養(yǎng)條件下的誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行比較。每瓶培養(yǎng)基接種5塊鱗片小塊，每處理6次重復(fù)，50 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)結(jié)果。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生愈傷組織的鱗片數(shù)/接種的鱗片總數(shù)×100

1. 2. 4 愈傷組織增殖 選擇愈傷組織誘導(dǎo)率最高的2種培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，同時(shí)將該2種培養(yǎng)基重新設(shè)置植物激素的添加方式，以探求更利于愈傷組織增殖的培養(yǎng)基。將初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)出的長勢良好的愈傷組織分割成1 cm×1 cm小塊，接種在增殖培養(yǎng)基上，分別在暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，60 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織增殖系數(shù)及鱗芽再生倍數(shù)。每瓶接種愈傷組織5塊，每處理6次重復(fù)。

愈傷組織增殖系數(shù)=愈傷組織分割塊數(shù)/接種的愈傷組織總塊數(shù)

鱗芽再生倍數(shù)=產(chǎn)生的不定芽總數(shù)/接種的愈傷組織總塊數(shù)

鱗芽誘導(dǎo)倍數(shù)=產(chǎn)生的不定芽總數(shù)/接種的鱗片總數(shù)

1. 2. 5 愈傷組織分化 將初代培養(yǎng)中增殖的愈傷組織接種于表2的培養(yǎng)基中，分別置于暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)條件下進(jìn)行愈傷組織分化。每瓶接種愈傷組織5塊，每處理6次重復(fù)，60 d后統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)基不定芽再生情況，篩選最佳植物激素配比。對比不同光暗條件下不定芽發(fā)生的生理狀態(tài)，確定促進(jìn)不定芽再生的最適宜光暗條件。

1. 2. 6 生根誘導(dǎo)及煉苗移栽 將生長健壯的組培芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA 0.2 mg/L，光照培養(yǎng)60 d后觀察其生根情況。將生根苗轉(zhuǎn)移到溫室內(nèi)煉苗7 d，之后取出試管苗，清水洗去培養(yǎng)基，用0.1% KMnO4溶液浸泡10 s，種植于草炭基質(zhì)中，于溫室內(nèi)種植管護(hù)，60 d后觀察植株生長勢并統(tǒng)計(jì)成活率。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同激素配比和光暗培養(yǎng)條件對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2. 1. 1 不同激素配比暗培養(yǎng)條件下對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 鱗片小塊在不同培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)50 d后，愈傷組織和鱗芽誘導(dǎo)結(jié)果見表3。不添加任何激素的對照處理（CK）沒有愈傷組織形成，但可形成白色的鱗芽（圖1-A），不同種類和濃度的激素配比對愈傷組織的形成存在明顯影響。在TDZ與2，4-D組合的培養(yǎng)基中，A1（2，4-D濃度0.05 mg/L、TDZ濃度0.4 mg/L）處理的愈傷組織誘導(dǎo)率為61.38%，顯著高于TDZ濃度為0.8 mg/L的A2處理（P<0.05，下同）;在相同TDZ濃度條件下（0.4或0.8 mg/L），2，4-D濃度為0.05 mg/L時(shí)的誘導(dǎo)率（61.38%和45.37%）分別顯著高于2，4-D濃度為0.20 mg/L時(shí)的誘導(dǎo)率（32.88%和28.14%）。由此可看出，較低濃度的TDZ和2，4-D更利于愈傷組織的誘導(dǎo)。在TDZ與NAA組合的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)率最高的為A5處理（65.57%），其次為A7處理（58.64%），最低的是A8處理（41.66%）。表明低濃度的TDZ和NAA對卷丹百合愈傷組織的誘導(dǎo)更有利。

不同培養(yǎng)基對鱗芽的誘導(dǎo)中，CK有一定的誘導(dǎo)率（1.18），而在添加了一定濃度的2，4-D后，各培養(yǎng)基處理（A1～A4）鱗芽的誘導(dǎo)倍數(shù)均明顯下降，且隨著所添加2，4-D濃度的增加，誘導(dǎo)倍數(shù)相應(yīng)降低，說明培養(yǎng)基中2，4-D的存在抑制了鱗芽的誘導(dǎo)，且濃度越高抑制作用越明顯。而添加不同濃度的NAA（A5～A8處理）不但能增強(qiáng)對愈傷組織的誘導(dǎo)，而且對鱗芽的誘導(dǎo)也有明顯的刺激作用。

由表3可看出，在卷丹百合鱗片愈傷組織誘導(dǎo)中，A1、A5和A7處理的愈傷組織誘導(dǎo)率雖然差異不顯著（P>0.05，下同），但A5的愈傷誘導(dǎo)率最高，超過65.00%，因此，本試驗(yàn)中對卷丹百合鱗片愈傷組織誘導(dǎo)率最適宜的激素組合為TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L。從愈傷組織形成過程看，暗培養(yǎng)下形成的愈傷組織呈乳黃色，且以鱗片邊沿傷口處為主要形成部位（圖1-B）。

2. 1. 2 不同激素配比光培養(yǎng)條件下對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將2.1.1中愈傷組織誘導(dǎo)率超過50.00%的培養(yǎng)基（A1、A5、A6和A7）在光照條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，以CK為對照，結(jié)果見表4。不添加任何激素的CK無愈傷組織形成，但可形成嫩綠色的鱗芽，與暗培養(yǎng)條件下相比，相同時(shí)間光培養(yǎng)下形成的鱗芽較小，鱗片發(fā)育不充分（表4和圖1-D），添加激素的培養(yǎng)基可刺激鱗片一端形成黃綠色的愈傷組織（圖1-E）。在各培養(yǎng)基處理中，A5處理的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為21.36%，顯著高于其他培養(yǎng)基處理;其次為A1（16.67%）和A7（15.48%）處理，二者間愈傷組織誘導(dǎo)率差異不顯著。與暗培養(yǎng)相比，光培養(yǎng)條件下各處理的愈傷組織誘導(dǎo)率普遍較低;與暗培養(yǎng)條件相比，光培養(yǎng)條件下各處理鱗芽誘導(dǎo)倍數(shù)也明顯降低。因此，黑暗條件更利于卷丹百合鱗片愈傷組織的形成。

2. 2 不同激素配比和光暗培養(yǎng)條件對愈傷組織增殖的影響

為探索卷丹百合愈傷組織增殖培養(yǎng)基，將表3和表4中對愈傷組織誘導(dǎo)率較高的2種培養(yǎng)基（A5和A1）的植物激素進(jìn)行組合，編號(hào)為A9，即A9的植物激素組合為：TDZ 0.4 mg/L+2，4-D 0.05 mg/L+NAA 0.2 mg/L。為研究2，4-D和NAA對愈傷組織增殖的階段性影響，在含有TDZ和2，4-D的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后再轉(zhuǎn)入含有TDZ和NAA的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)40 d，將該培養(yǎng)基編號(hào)為A10，即A10的植物激素組合為：（TDZ 0.4 mg/L+2，4-D 0.05 mg/L）（初始20 d）+（TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L）（后續(xù)40 d）。將愈傷組織接種在A9、A10和A5培養(yǎng)基上分別進(jìn)行光照和暗培養(yǎng)，60 d后愈傷組織增殖情況見表5。

從表5可看出，暗培養(yǎng)條件下，愈傷組織增殖效果最好的是A10處理，其增殖倍數(shù)為2.45，顯著高于A5和A9處理，而A9與A5處理的愈傷組織增殖倍數(shù)差異不顯著;光培養(yǎng)條件下，同種培養(yǎng)基處理的愈傷組織增殖倍數(shù)均低于暗培養(yǎng)條件，3種處理的愈傷組織增殖倍數(shù)差異性與暗培養(yǎng)條件下一致。對于芽再生倍數(shù)，在相同培養(yǎng)條件下3種處理的差異性及同種培養(yǎng)基不同培養(yǎng)條件下的差異性與愈傷組織增殖倍數(shù)的規(guī)律一致。說明無論愈傷組織增殖還是芽再生，A10處理的誘導(dǎo)效果均最好，且在暗培養(yǎng)條件下更利于愈傷組織和芽的增殖。因此，在誘導(dǎo)愈傷組織增殖過程中，較低濃度的2，4-D（0.05 mg/L）較短時(shí)間內(nèi)（20 d）對愈傷組織的增殖誘導(dǎo)有良好的促進(jìn)作用。培養(yǎng)基中2，4-D和NAA的添加方式不同，誘導(dǎo)率差異明顯，調(diào)控二者對愈傷組織誘導(dǎo)的時(shí)間和順序有利于提高增殖率。

另外，從愈傷組織的顏色和狀態(tài)看，暗培養(yǎng)下形成的愈傷組織體積較大，結(jié)構(gòu)致密，呈乳黃色（圖1-C）;光培養(yǎng)下形成的愈傷組織體積較小，結(jié)構(gòu)相對疏松，呈黃綠色（圖1-F）。

2. 3 不同激素配比和光暗培養(yǎng)條件對愈傷組織再生不定芽的影響

2. 3. 1 不同激素配比和光暗培養(yǎng)條件對愈傷組織再生不定芽的誘導(dǎo) 由表6可知，無論光、暗培養(yǎng)條件，不添加任何激素的CK對愈傷組織再生的誘導(dǎo)倍數(shù)均顯著低于其他培養(yǎng)基處理，說明培養(yǎng)基中不添加激素不利于芽的再生。暗培養(yǎng)條件下，在不同濃度的6-BA與NAA配比的培養(yǎng)基中，當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，芽誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基為B2，誘導(dǎo)倍數(shù)為6.08，其次為B3，誘導(dǎo)倍數(shù)為5.96，最低的是B1，誘導(dǎo)倍數(shù)僅為3.28，表明在NAA一定濃度下，較低濃度（0.2 mg/L）的6-BA不利于不定芽的誘導(dǎo)，但濃度過高（1.0 mg/L）對芽的誘導(dǎo)也有一定的抑制作用。將生長素NAA換成PIC，濃度保持0.1 mg/L不變，6-BA相同的濃度變化梯度，發(fā)現(xiàn)對不定芽的誘導(dǎo)情況與6-BA+NAA組合的誘導(dǎo)規(guī)律類似，誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基組合為6-BA 0.6 mg/L+PIC 0.1 mg/L（B5），芽再生倍數(shù)為4.87，但顯著低于培養(yǎng)基為6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L（B2）的芽再生倍數(shù)，說明對卷丹百合不定芽的誘導(dǎo)效果上，PIC遠(yuǎn)不如NAA。因此，對愈傷組織進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，選擇適宜濃度的6-BA與NAA組合更利于芽的再生。

光培養(yǎng)條件下，統(tǒng)計(jì)不同濃度的6-BA與NAA組合及不同濃度的6-BA與PIC組合對芽再生情況的影響，發(fā)現(xiàn)二者對不定芽再生誘導(dǎo)的變化規(guī)律與在暗培養(yǎng)條件下對不定芽誘導(dǎo)的規(guī)律基本一致，芽再生倍數(shù)最高的培養(yǎng)基為B2處理，但該培養(yǎng)基在光照條件下的芽再生倍數(shù)明顯低于黑暗條件下的芽再生倍數(shù)。

為探求光暗培養(yǎng)條件對愈傷組織再生不定芽的動(dòng)態(tài)變化，對培養(yǎng)基B2處理在光、暗條件下不定芽發(fā)生數(shù)量分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每隔10 d統(tǒng)計(jì)芽的再生倍數(shù)，至60 d止。由圖2可知，接種后20 d，暗培養(yǎng)下不定芽的增殖速率明顯高于光培養(yǎng)處理;20 d后光培養(yǎng)處理的不定芽增殖速率加快，與暗培養(yǎng)的增殖速率接近;50 d后，二者不定芽的增殖速率明顯放緩，芽再生倍數(shù)趨于穩(wěn)定。由圖2可看出，在不定芽整個(gè)再生階段，暗培養(yǎng)條件下不定芽的再生倍數(shù)始終高于光培養(yǎng)處理，且前60 d是促進(jìn)不定芽增殖的關(guān)鍵時(shí)期。

2. 3. 2 光暗培養(yǎng)條件對不定芽生理狀態(tài)的影響 對不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基（B2）處理產(chǎn)生的不定芽在光暗培養(yǎng)條件下的生理狀態(tài)進(jìn)行對比，結(jié)果（圖3）顯示，不定芽生理狀態(tài)在光暗條件下差異明顯。暗培養(yǎng)下（圖3-A～圖3-C），不定芽迅速增殖，芽排列緊湊，整個(gè)生長期均呈乳白色，20 d后每塊愈傷組織增生的不定芽中有1～2個(gè)不定芽中間的生長點(diǎn)增長速度明顯較快，至40 d時(shí)芽長度可達(dá)30 cm以上，可能是愈傷組織的增殖分化中心。其他部位的再生芽形成后生長速度較緩，至60 d時(shí)無論是鱗片葉還是生長點(diǎn)均在5 cm以下，部分鱗芽鈍化不長或出現(xiàn)畸形，說明長時(shí)間的暗培養(yǎng)不宜于不定芽的繼續(xù)生長發(fā)育。

光培養(yǎng)下（圖3-D～圖3-F），不定芽在整個(gè)生長發(fā)育過程均呈翠綠色，且20 d后愈傷組織增生的不定芽中有多處生長點(diǎn)凸起伸長，40 d后新生葉片生長加速并逐漸展開，至60 d時(shí)多個(gè)鱗芽的鱗葉長度在15 cm以上。光照條件有利于芽合成生長素促進(jìn)芽的生長和葉片的發(fā)育，從而進(jìn)一步促進(jìn)形成的不定芽光合自養(yǎng)。但相對于暗培養(yǎng)，光照培養(yǎng)條件下不定芽增生的總體數(shù)量較少。將愈傷組織暗培養(yǎng)20 d后轉(zhuǎn)到光培養(yǎng)條件下繼續(xù)對不定芽進(jìn)行增生誘導(dǎo)，光培養(yǎng)10 d后鱗芽明顯轉(zhuǎn)綠，邊緣呈深綠色（圖3-G）;培養(yǎng)20 d后多處鱗芽生長點(diǎn)及鱗片葉伸長并加速生長（圖3-H）;至光照培養(yǎng)40 d時(shí)，每個(gè)鱗芽的大多數(shù)鱗片葉已伸長至10 cm以上，色澤鮮綠，且有部分鱗芽長出0.5 cm左右的根系（圖3-I）。說明前期的暗培養(yǎng)誘導(dǎo)了較多的不定芽，轉(zhuǎn)到光培養(yǎng)后，在光的誘導(dǎo)下基數(shù)較大的不定芽迅速生長，形成較多長勢旺盛的不定芽。

綜上可知，先黑暗條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)20 d左右，然后轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)，不僅可促進(jìn)卷丹百合鱗片愈傷組織上不定芽的增殖和發(fā)育，還可促使不定芽更健壯。

2. 4 生根誘導(dǎo)及煉苗培養(yǎng)

生根培養(yǎng)基培養(yǎng)不定芽60 d后，瓶苗長勢旺盛，所有不定芽均已萌發(fā)新根（圖4-A），最先萌發(fā)的新根長度超過5 cm，鱗莖超過2 cm（圖4-B）。煉苗移栽后60 d，成活率為94.5%，大部分苗萌發(fā)6片以上新葉，葉色濃綠，長勢旺盛（圖4-C）。

3 討論

建立卷丹百合離體再生體系進(jìn)而高效繁育無菌組培苗對加快卷丹百合的商業(yè)化種植具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，百合的組培快繁多以鱗片為外植體，影響組培快繁效率的因子較多，包括外植體鱗片的取材部位（馬怡迪，2015;方中明等，2016;祁宏英等，2018）、外植體消毒過程（柯義強(qiáng)等，2020;李婷婷等，2020）、基本培養(yǎng)基選擇（方中明等，2016;馬生軍等，2018）、外源激素配比及濃度（段祖安等，2009;馬怡迪，2015;張旭紅等，2018;段四喜等，2019;張文婷等，2019）和培養(yǎng)條件等（Kedra and Bach，2005;Tang et al.，2010;任建宏等，2017;張旭紅等，2018）。其中，不同種類及濃度的植物激素是影響百合組培快繁的關(guān)鍵因子（Bakhshaie et al.，2010;李鶯等，2013），研究較多的激素因子中，生長素以NAA、IBA和2，4-D為主，分裂素以6-BA為主。

TDZ是一種人工合成的具有高效活性的生物調(diào)節(jié)劑，可促進(jìn)外植體愈傷組織生長及提高形態(tài)發(fā)生能力，因此廣泛應(yīng)用于百合的組織培養(yǎng)（Lian et al.，2003;Mizuguchi et al.，2008;張旭紅等，2018）。PIC是一種外源生長素類調(diào)控物質(zhì)，對百合愈傷組織的胚性啟動(dòng)有良好的誘導(dǎo)及調(diào)控作用（Suzuki et al.，2001。張旭紅等（2018）對歐洲百合鱗片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)率最高的TDZ與NAA組合（TDZ 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L）優(yōu)于誘導(dǎo)率最高的TDZ與PIC組合（TDZ 0.6 mg/L+PIC 0.01 mg/L）。2，4-D在初代培養(yǎng)階段添加，可促進(jìn)愈傷組織增殖和不定芽分化，但要求濃度范圍較窄（Panizza et al.，1990）。本研究中，在卷丹百合愈傷組織誘導(dǎo)階段，TDZ與NAA組合更有利，但在愈傷組織增殖階段，在含TDZ的培養(yǎng)基中，2，4-D和NAA分別在不同時(shí)間段單獨(dú)添加更有利于愈傷組織的增殖。

從愈傷組織高效誘導(dǎo)不定芽是百合組培繁育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在植物激素的選擇上，6-BA與NAA的組合對百合不定芽和小鱗莖的誘導(dǎo)效果較好，但二者最佳濃度配比，不同研究者間差異較大（Xu et al.，2009;Jin et al.，2014;Qi et al.，2014;張旭紅等，2018;呂翠竹等，2020），可能與植物基因型、植株的生長發(fā)育狀態(tài)或培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。PIC在愈傷組織的誘導(dǎo)上應(yīng)用較多（Mori et al.，2005;Khosravi et al.，2007;孫紅梅等，2015;張旭紅等，2018），但對增殖培養(yǎng)中不定芽的誘導(dǎo)是否有促進(jìn)作用未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，6-BA與PIC組合對愈傷組織誘導(dǎo)不定芽有一定的促進(jìn)作用，但芽再生倍數(shù)遠(yuǎn)低于6-BA與NAA組合對不定芽誘導(dǎo)的再生倍數(shù)，說明在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加PIC不是最佳選擇。

影響百合鱗片愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及不定芽再生的各因素中，光暗培養(yǎng)條件至關(guān)重要。有研究認(rèn)為光培養(yǎng)對百合愈傷組織的誘導(dǎo)系數(shù)及組培芽增殖系數(shù)高于暗培養(yǎng)（王杰等，2008;呂翠竹等，2020），但馬怡迪（2015）認(rèn)為暗培養(yǎng)有利于巨球百合胚性愈傷組織的生長。張旭紅等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，歐洲百合在光培養(yǎng)下形成的愈傷組織不但增殖緩慢，且極易褐化，而暗培養(yǎng)條件更利于愈傷組織的增殖及不定芽的再生。本研究結(jié)果也表明，卷丹百合鱗片愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖及不定芽再生倍數(shù)，暗培養(yǎng)條件明顯優(yōu)于光培養(yǎng)，但為了促進(jìn)新生鱗芽更好地生長和發(fā)育，在暗培養(yǎng)一定時(shí)間后（20 d）需及時(shí)轉(zhuǎn)移到光培養(yǎng)條件才能更好地完成鱗芽葉片及根的生長發(fā)育。

4 結(jié)論

卷丹百合組織培養(yǎng)的不同階段受不同種類和濃度的植物激素組合影響;暗培養(yǎng)條件更利于愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖，暗培養(yǎng)結(jié)合光培養(yǎng)條件最適合不定芽的再生和分化。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）