毛百合試管鱗莖形成和膨大的培養(yǎng)優(yōu)化

張彥妮+李兆婷+張艷波+汪海洋

摘要：以毛百合（Lilium dauricum）試管苗為材料，研究不同濃度活性炭、激素種類、水楊酸、蔗糖等對(duì)試管鱗莖形成和膨大的影響，同時(shí)比較鱗莖大小對(duì)移栽成活率的影響。結(jié)果表明，NAA、IBA、多效唑?qū)υ嚬荀[莖形成和膨大都有影響，蔗糖對(duì)鱗莖膨大有影響；1.0 g/L活性炭對(duì)鱗莖的形成及膨大效果最好，所結(jié)鱗莖直徑增大 2.50 倍，鱗莖球形指數(shù)1.40，鱗莖鮮質(zhì)量828.2 mg，結(jié)球率達(dá)100%，平均新增鱗莖4.40個(gè)；水楊酸對(duì)鱗莖膨大效果不明顯；鱗莖越大（≥8 mm），移栽成活率越高（96%），長勢(shì)越好。

關(guān)鍵詞：毛百合；試管鱗莖；植物激素；膨大

中圖分類號(hào)： Q943.1；S682.2+65.04+3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0074-05

毛百合（Lilium dauricum）為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生球根類花卉，產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古和河北等地，朝鮮、日本、蒙古和俄羅斯也有分布，其花色艷麗、姿態(tài)優(yōu)雅，是一種代表和諧美好、吉祥高貴的觀賞花卉[1]；同時(shí)又是一種名貴的中草藥，鱗莖治膿腫、骨折、燒傷及凍傷等，地上部分新鮮時(shí)局部應(yīng)用，可促進(jìn)外傷愈合，有收斂作用，花可治肺病[2]。毛百合是一種珍貴的野生資源，具有極高的觀賞、食用和藥用價(jià)值，花期6—7月，抗寒性極強(qiáng)[3]，是很好的逆境基因資源庫。目前，學(xué)者對(duì)毛百合的種子萌發(fā)[4]、繁殖生物學(xué)[5]、染色體[6]、核型分析[7]、再生體系的建立[8]、切花保鮮[9]、栽培[10]進(jìn)行了研究。東北林業(yè)大學(xué)花卉研究所于1994年利用“940703”科學(xué)衛(wèi)星搭載毛百合的種子后，發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星搭載可以提高毛百合種子的萌發(fā)率，可使毛百合鱗莖大小及質(zhì)量產(chǎn)生一定變異[11]。紀(jì)瑩等利用栽培品種布魯拉諾與毛百合進(jìn)行種間雜交后，通過測(cè)定雜交后代相關(guān)生理生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)雜交后代抗寒性有所提高[12]。鱗莖作為毛百合繁殖和藥用的一個(gè)重要部位，如何短時(shí)間內(nèi)使其鱗莖增大、鱗莖增大受到哪些因素的影響仍值得探討。目前，還未發(fā)現(xiàn)添加不同附加物促進(jìn)毛百合鱗莖膨大的相關(guān)研究。一般在組織培養(yǎng)過程中，試管結(jié)球時(shí)間較長，形成的鱗莖直徑較小，制約了其繁殖及生產(chǎn)。因此，有必要尋找能縮短結(jié)球時(shí)間和促進(jìn)試管鱗莖增大的方法。本試驗(yàn)以毛百合組培苗為試驗(yàn)材料，探討活性炭（activated carbon，AC）、α-萘乙酸（NAA）、3-吲哚丁酸（indole butyric acid，IBA）、蔗糖、水楊酸（salicylic acid，SA）、多效唑（PP333）對(duì)毛百合試管鱗莖形成和膨大的影響，探索添加不同附加物對(duì)試管鱗莖移栽成活率及生長狀況的影響，以期找到最適附加物及其濃度，加速鱗莖的生長和發(fā)育，為毛百合的育種、離體快繁及園林應(yīng)用等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以毛百合（Lilium dauricum）的無菌苗為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 小鱗莖的獲得 將通過增殖培養(yǎng)獲得的毛百合不定芽分割成單芽（高約4 mm），轉(zhuǎn)接到MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA（根據(jù)預(yù)試驗(yàn)獲得的培養(yǎng)基配方）繼代培養(yǎng)基上壯苗，直到每個(gè)單芽基部小鱗莖直徑長至0.3～0.4 cm時(shí)，剪去上部葉片接種于培養(yǎng)基上。

1.2.2 鱗莖膨大培養(yǎng)基設(shè)計(jì)與培養(yǎng)條件 以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基設(shè)計(jì)方案分為2種，一種方案為附加0.5 mg/L 6-BA，設(shè)置NAA濃度為0、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L、IBA濃度為0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L。另一種方案為附加0.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA，設(shè)置添加物活性炭（0、0.2、0.5、1.0、2.0 g/L）、蔗糖（0、15、30、60、90、120 g/L）、水楊酸（0、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mg/L）、多效唑（0、5、10、20、40 mg/L）濃度。每個(gè)處理接種30個(gè)外植體。除特殊說明外，所有培養(yǎng)基均附加7.8 g/L瓊脂、30 g/L蔗糖，pH值5.8～6.0。培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min。組培室溫度為（25±2） ℃，光照度為2 000～3 000 lx，光照時(shí)間 16 h/d。培養(yǎng)45 d后，統(tǒng)計(jì)鱗莖直徑、鱗莖球形指數(shù)、鱗莖鮮質(zhì)量、結(jié)球率等相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 試管鱗莖的移栽 將膨大后的毛百合試管鱗莖按照直徑大小分成3～<5 mm、5～<8 mm、≥8 mm 3個(gè)級(jí)別。每級(jí)取20個(gè)小鱗莖移栽到裝有高溫滅菌蛭石的花盆中。40 d 后統(tǒng)計(jì)小鱗莖的移栽成活率和生長狀況。

1.2.4 相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算方法 鱗莖直徑：用經(jīng)過高壓滅菌的游標(biāo)卡尺測(cè)量試管鱗莖的直徑；鱗莖的球形指數(shù)=鱗莖高度/鱗莖直徑；鱗莖的鮮質(zhì)量：從培養(yǎng)基中取出誘導(dǎo)的小鱗莖，剪去葉片和根，稱其鮮質(zhì)量（用紫外消毒的電子天平稱量）。

直徑增大倍數(shù)=鱗莖直徑/接種時(shí)鱗莖直徑（0.3～0.4 cm）=結(jié)球率：已結(jié)球單芽數(shù)/接種時(shí)總單芽數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAA對(duì)毛百合試管鱗莖膨大的影響

在培養(yǎng)基中適當(dāng)添加NAA，不僅有利于幼苗生根，而且有利于鱗莖的形成及膨大。圖1結(jié)果表明，隨著NAA濃度升高，鱗莖鮮質(zhì)量、結(jié)球率、鱗莖直徑和新增鱗莖數(shù)均呈先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)NAA濃度在0.5～2.0 mg/L時(shí)，結(jié)球率為100%；當(dāng)NAA濃度為1.0 mg/L時(shí)，鱗莖鮮質(zhì)量最大（658.4 mg），根系生長良好，葉多濃綠。當(dāng)NAA的濃度為 2.0 mg/L 時(shí)，鱗莖直徑、增大倍數(shù)、新增鱗莖數(shù)均為最好，但是根系細(xì)弱，葉色淡綠，葉片數(shù)目明顯減少，且移栽后不易成活。綜合考慮，促進(jìn)鱗莖形成和膨大的最適宜NAA濃度為1.0 mg/L。

2.2 IBA對(duì)毛百合試管鱗莖膨大的影響

隨著IBA濃度升高，鱗莖鮮質(zhì)量和平均新增鱗莖數(shù)均呈先增大后減小的趨勢(shì)，而結(jié)球率呈逐漸升高的趨勢(shì)（圖2）。當(dāng)IBA濃度為1.0、2.0、4.0 mg/L時(shí)，結(jié)球率均100%，鱗莖直徑均增大2倍以上，根系均生長良好，葉多濃綠。但當(dāng)IBA濃度為1.0 mg/L時(shí)，新增鱗莖數(shù)最多（2.57個(gè)），鱗莖鮮質(zhì)量（601.3 mg）低于IBA的濃度為2.0 mg/L時(shí)的鮮質(zhì)量（675.8 mg）。但當(dāng)IBA濃度等于4.0 mg/L時(shí)，鱗莖鮮質(zhì)量和葉片數(shù)明顯減少，根系細(xì)弱。整體來說，IBA的濃度為2.0 mg/L適宜用于毛百合鱗莖的膨大。

2.3 多效唑?qū)γ俸显嚬荀[莖膨大的影響

隨著PP333濃度升高，植株明顯矮化，且明顯抑制鱗莖形成，但對(duì)鱗莖膨大有明顯的促進(jìn)作用（圖3）。當(dāng)PP333的濃度為10 mg/L時(shí)，鱗莖增大2.2倍，鱗莖最大質(zhì)量為 625.4 mg，結(jié)球率為100%。當(dāng)PP333的濃度高于10 mg/L時(shí)，鱗莖直徑、鮮質(zhì)量明顯下降，幾乎不長葉片，葉片呈淡黃綠色，苗長勢(shì)弱。當(dāng)PP333的濃度高于5 mg/L時(shí)，新增鱗莖數(shù)明顯下降。說明較低濃度的PP333（10 mg/L）對(duì)鱗莖膨大效果好，有利于誘導(dǎo)生根及試管苗生長，而高濃度的PP333抑制鱗莖膨大和試管苗生長。

2.4 活性炭對(duì)毛百合試管鱗莖膨大的影響

小鱗莖在添加AC的培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 d后，鱗莖變綠稍有膨大，有淡綠色小葉片生長。25 d后鱗莖膨大明顯，鱗片明顯增厚，葉片數(shù)較少，根系生長較好（長0.5～1.0 cm）。45 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，隨著AC濃度升高，鱗莖直徑及鮮質(zhì)量的增加速度均呈現(xiàn)先逐漸增加后降低的趨勢(shì)（圖4）。當(dāng)AC的濃度為1.0 g/L時(shí)，鱗莖直徑9.22 mm，直徑增大倍數(shù)2.50，鱗莖的球形指數(shù)1.40，鱗莖鮮質(zhì)量828.2 mg，結(jié)球率100%，新增鱗莖4.40個(gè)，根系多且健壯，幼苗長勢(shì)良好；當(dāng)AC的濃度大于1.0 g/L，新增鱗莖數(shù)量較多，但鱗莖鮮質(zhì)量均明顯下降。因此，綜合考慮可知，1.0 g/L的AC最有利于鱗莖的形成及膨大。

2.5 蔗糖對(duì)毛百合試管鱗莖膨大的影響

當(dāng)蔗糖的濃度低于30 g/L（對(duì)照組濃度）時(shí)，與對(duì)照組相比鱗莖的形成和膨大效果較差（圖5）。當(dāng)蔗糖的濃度高于30 g/L時(shí)，與對(duì)照組相比鱗莖的形成和膨大效果較好，鱗莖鮮質(zhì)量均呈增大趨勢(shì)。當(dāng)蔗糖的濃度為60 g/L時(shí)，平均新增鱗莖數(shù)最多（1.63個(gè)），幼苗長勢(shì)良好。當(dāng)蔗糖的濃度為 90 g/L 時(shí)，鱗莖的膨大效果較好，鱗莖直徑最大（8.06 mm），直徑增大倍數(shù)多（2.05），結(jié)球率100%，鮮質(zhì)量628.3 mg，但新增鱗莖數(shù)有所下降。當(dāng)蔗糖濃度為120 g/L時(shí)，鱗莖鮮質(zhì)量達(dá)到最大值（713.0 mg），但新增鱗莖數(shù)量明顯下降，基本無葉。說明60 g/L的蔗糖更有利于鱗莖的形成，120 g/L的蔗糖更有利于鱗莖膨大。從鱗莖膨大效果以及經(jīng)濟(jì)成本上考慮，生產(chǎn)上以90 g/L濃度的蔗糖為佳。

2.6 水楊酸對(duì)毛百合試管鱗莖膨大的影響

圖6結(jié)果表明，水楊酸對(duì)鱗莖膨大無明顯效果，但對(duì)小鱗莖的形成有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)水楊酸在0.05～0.50 mg/L 濃度范圍時(shí)，隨著濃度升高，結(jié)球率明顯提高，鱗莖數(shù)量明顯增加。其中水楊酸在0.50 mg/L濃度時(shí)，誘導(dǎo)鱗莖效果最好，結(jié)球率87%，試管內(nèi)新生小鱗莖的數(shù)量最多（4.63個(gè)）。當(dāng)水楊酸濃度高于1.0 mg/L時(shí)，鱗莖數(shù)量減少。說明在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的水楊酸有利于提高毛百合鱗莖的誘導(dǎo)率，但不利于毛百合鱗莖的膨大。

2.7 試管鱗莖的移栽

試管鱗莖的直徑越小，移栽后的成活率越低；試管鱗莖的直徑越大，移栽后的成活率越高（表1）。試管鱗莖直徑在 3～<5 mm的植株長勢(shì)稍弱，直徑在5～<8 mm 范圍內(nèi)的植株長勢(shì)一般；直徑大于等于8 mm 的植株長勢(shì)較好，整齊且健壯；這可能是由于試管鱗莖直徑大，積累的營養(yǎng)物質(zhì)多，移栽后對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，較易成活的原因。

3 討論

適宜的激素濃度會(huì)促進(jìn)毛百合鱗莖的形成和膨大。在培養(yǎng)基中附加NAA和IBA有助于試管鱗莖的生長。張延龍等研究發(fā)現(xiàn)，較低濃度（0.5 mg/L）的NAA不但能促進(jìn)百合鱗莖形成，同時(shí)也能增加百合鱗莖的質(zhì)量[13-14]。王曉麗等研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的PP333有利于垂花百合試管鱗莖膨大，當(dāng)PP333濃度為10 mg/L時(shí)，鱗莖增大2.47倍，鱗莖鮮質(zhì)量達(dá)到最大值333.3 g，但隨著PP333濃度的升高，鱗莖鮮質(zhì)量和增大倍數(shù)呈下降趨勢(shì)[15]?？梢?，植物激素會(huì)影響鱗莖的膨大，這些研究雖與本試驗(yàn)所用的濃度不同，但都表明：NAA、IBA、PP333不僅有利于試管苗生根，更有利于鱗莖形成及膨大，植物種類不同，其適宜的濃度也有差異，這就需要進(jìn)行試驗(yàn)篩選。

不同濃度的添加物也會(huì)對(duì)鱗莖的生長有影響。王家福等發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度對(duì)百合鱗莖的直徑有影響，蔗糖濃度為100 g/L時(shí)，鱗莖直徑最大為4.5 mm，但隨著蔗糖濃度的增加鱗莖增加不明顯[16]。本試驗(yàn)研究表明，蔗糖濃度為90 g/L時(shí)，鱗莖直徑最大（8.06 mm），超過90 g/L，直徑下降。這表明適宜濃度的蔗糖有利于鱗莖直徑的增大。一些研究表明，AC對(duì)小鱗莖的增長有一定的促進(jìn)作用[17-18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AC是所有因素中效果最明顯的，1.0 g/L AC對(duì)試管鱗莖的形成及膨大效果最好，鱗莖直徑增大2.5倍，鱗莖鮮質(zhì)量828 mg，結(jié)球率100%，新增鱗莖4.40個(gè)。這對(duì)以后在組培條件下促進(jìn)鱗莖的增長有重要的參考價(jià)值。

水楊酸廣泛分布于高等植物中，是一種天然抑制劑，對(duì)植物有多種生理作用，被認(rèn)為是一種新型植物激素[19]。張潔等研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸濃度在0.05～0.2 mg/L范圍內(nèi)，有利于東方百合Sorbonne鱗莖的形成，但是水楊酸對(duì)百合鱗莖的膨大作用不明顯[20]。這與本試驗(yàn)得到的結(jié)果一致。而劉芳等采用葉片噴施水楊酸的方法，發(fā)現(xiàn)百合品種“精粹”的鱗莖周徑和鮮質(zhì)量隨濃度的增加而增加[21]，這與本試驗(yàn)得到的結(jié)果不一致。這可能與植物種類和基因型有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

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