高效毛細(xì)管電泳—二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定微生物代謝產(chǎn)物中的植物激素含量

馬曉穎+楊鎮(zhèn)++宋艷雨++祝永剛+楊濤

摘要：建立同時(shí)分離測(cè)定微生物代謝產(chǎn)物中吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫離酸的毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測(cè)器新方法。研究檢測(cè)波長、緩沖體系、緩沖體系的pH值及濃度、分離電壓、進(jìn)樣時(shí)間等因素。結(jié)果表明，在運(yùn)行緩沖液75 mmol/L硼砂緩沖液（pH值為9.0）、75 mmol/L硼酸緩沖液、檢測(cè)波長218 nm、分離電壓20 kV、溫度 25 ℃的條件下，吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫離酸在0.1～5.0 mg/mL內(nèi)呈較好的線性關(guān)系。測(cè)得微生物代謝產(chǎn)物中含有細(xì)胞分裂素和脫離酸，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得回歸方程測(cè)得含量為60.93、22.62 μg/mL。細(xì)胞分裂素和脫落酸遷移時(shí)間的相對(duì)偏差RSD分別為0.13%、0.126%；遷移峰面積RSD（%）分別為1.01%、1.92%，回收率分別為 90.1%～948%、95.8%～96.2%。因此，該方法適用于微生物代謝產(chǎn)物中植物激素的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：高效毛細(xì)管電泳；二極管陣列檢測(cè)；植物激素；微生物代謝產(chǎn)物

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0169-03

為了實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)部在扎實(shí)推進(jìn)的“到2020年化肥使用量零增長行動(dòng)”和“到2020年農(nóng)藥使用量零增長行動(dòng)”，重點(diǎn)研發(fā)高效緩釋肥料、高效低毒低殘留農(nóng)藥、生物肥料農(nóng)藥等新型產(chǎn)品是十分必要的，而植物激素是被公認(rèn)的用量少、效果好的植物生長調(diào)節(jié)劑。微生物天然代謝產(chǎn)物擁有來源安全、對(duì)土地環(huán)境友好等特點(diǎn)，在未來具有極大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

傳統(tǒng)的生物鑒定法對(duì)植物激素的測(cè)定難以滿足準(zhǔn)確定量分析的要求，文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜法等雖可獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果，但存在操作繁瑣、靈敏度差、費(fèi)用較高的缺點(diǎn)。毛細(xì)管電泳技術(shù)（HPCE）源自傳統(tǒng)電泳技術(shù)，具有微量、準(zhǔn)確、成本低、污染少、分析時(shí)間快、自動(dòng)化程度高的優(yōu)點(diǎn)[1]。二極管陣列檢測(cè)器可以同時(shí)檢測(cè)在190～300 nm波長下樣品的出峰情況，并帶有3D效果的檢測(cè)峰形，可以更加直觀地判斷樣品的真實(shí)情況，判斷出是否為非正常樣品的出峰情況。本研究以微生物代謝產(chǎn)物為測(cè)定目標(biāo)，利用高效毛細(xì)管-二極管陣列同時(shí)測(cè)定其中的4種植物激素，并建立了高效快速的植物激素含量測(cè)定方法。該方法簡單可靠、重復(fù)性好，不僅可用于微生物代謝產(chǎn)物中植物激素含量的測(cè)定，對(duì)其他樣品中的植物激素的定性、定量檢測(cè)都有一定的參考價(jià)值。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：P/ACE MDQ 毛細(xì)管電泳儀 （美國貝克曼公司）；未涂層石英毛細(xì)管 （75 μm×57 cm，有效檢測(cè)長度48 cm）（美國貝克曼公司）；精密pH計(jì)（北京泰亞賽福科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；高速臺(tái)式冷凍型離心機(jī)（德國Sigma公司）；超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；紫外分光光度計(jì)[尤尼柯（上海）儀器有限公司]；HZQ-QX 全溫振蕩器（黑龍江省哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；干熱消毒箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DOA-P504-BN 真空泵（IDEX公司）；ETS-D5 磁力攪拌器、A11 高速粉碎機(jī)（德國IKA集團(tuán)）。CascadaTM實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)（Pall corporation）。

試劑：微生物菌種來源于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心；吲哚乙酸（IAA）標(biāo)樣，赤霉素（GA），細(xì)胞分裂素（6BA），脫落酸（ABA）（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；試驗(yàn)過程用的試劑均為分析純和色譜純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2試驗(yàn)方法

新毛細(xì)管用甲醇沖洗3 min，1 mol/L的HCl沖洗2 min，0.1 mol/LNaOH沖洗1 min，去離子水沖洗0.5 min?；罨玫拿?xì)管使用前用0.1 mol/L的NaOH、水、電泳緩沖液分別沖洗1、2、3min；每次進(jìn)樣之間，用緩沖液沖洗2 min，沖洗壓力為20 psi。所有溶液在進(jìn)入毛細(xì)管前，均用0.22 μm的水系微孔濾膜過濾。

樣品處理：將發(fā)酵后的微生物用雙層紗布過濾，用蒸餾水沖洗3次后60 ℃下烘干，稱質(zhì)量。然后采用高速粉碎機(jī)粉碎，用10倍體積乙醇浸提24 h，用磁力攪拌器將其混勻，超聲波振蕩1 h，真空抽濾，用以上方法再提取2次，收集3次濾液備用。將處理好的微生物代謝產(chǎn)物1 mg/mL用0.22 μm孔徑的有機(jī)濾膜過濾，收集續(xù)濾液加同體積的運(yùn)行緩沖液作為樣品溶液。

對(duì)照品的配制：將吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸分別配成1 mg/mL的母液，用甲醇溶解。上述溶液均用 0.22 μm 孔徑的有機(jī)濾膜過濾，超聲除氣，置于冰箱4 ℃保存。

1.3電泳條件

未涂層石英毛細(xì)管（75 μm×57 cm，有效檢測(cè)長度 48 cm）；運(yùn)行緩沖液為75 mmol/L硼砂緩沖液（pH值為90）；75 mmol/L硼酸緩沖液；檢測(cè)波長218 nm；分離電壓 20 kV；溫度 25 ℃；壓力0.5 psi進(jìn)樣10 s，樣品運(yùn)行時(shí)間為 20 min，4種植物激素運(yùn)行時(shí)間為15 min。

2結(jié)果與分析

2.1高效毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測(cè)法條件的優(yōu)化

選用pH值為9.0的75 mmol/L硼砂沖液、75 mmol/L硼酸緩沖液作為運(yùn)行緩沖及分離緩沖。壓力0.5 psi進(jìn)樣10 s，并在此條件下進(jìn)行波長優(yōu)化及電壓優(yōu)化。為選取適當(dāng)?shù)臋z測(cè)波長，采用PDA檢測(cè)器對(duì)4種激素標(biāo)準(zhǔn)品溶液在波長為 190～300 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)4種植物激素具有不同的最適分離波長，但在218 nm處能夠達(dá)到同時(shí)出峰且分離效果較好，故選取此波長作為檢測(cè)波長。

在確定進(jìn)樣時(shí)間方面，進(jìn)行5、10、20 s進(jìn)樣時(shí)間的測(cè)定，結(jié)果表明，進(jìn)樣5 s峰形不完整，20 s濃度太高，連峰情況增多，故選用10 s為樣品的進(jìn)樣時(shí)間。

在優(yōu)化分離電壓時(shí)，比較分析15、20、30 kV 3個(gè)不同電壓下4種植物激素遷移與分離情況。發(fā)現(xiàn)在15 kV時(shí)，基線不好；30 kV時(shí)出峰延遲，峰形拖尾，故最終選擇20 kV作為電泳測(cè)定的運(yùn)行電壓。

試驗(yàn)常用磷酸鹽、硼砂等緩沖體系對(duì)4種植物激素的分離進(jìn)行考察，以選取合適的緩沖體系。通過磷酸鹽緩沖液不同的pH值，確定分離樣品的最適分離pH值，通過試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，用pH值為9.0的磷鹽溶液分離時(shí)，樣品的分離效果較好，故選擇堿性緩沖液硼砂溶液進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。

選擇10、20、50、75 mmol/mL硼砂緩沖液對(duì)4種植物激素進(jìn)行分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硼砂緩沖液濃度達(dá)到75 mmol/mL時(shí)，樣品和對(duì)照品的分離效果最佳，分離度和峰形都達(dá)到了相對(duì)最好的情況，故選擇75 mmol/mL及pH值為9.0的硼砂，75 mmol/L硼酸緩沖液緩沖體系作為最終運(yùn)行緩沖液。

2.2高效毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測(cè)法對(duì)微生物代謝產(chǎn)物中4種激素的測(cè)定

2.2.1定性測(cè)定根據(jù)圖1、圖2可知，微生物代謝產(chǎn)物指紋圖譜中含有與細(xì)胞分裂素（6-BA）和脫落酸（ABA）保留時(shí)間相同的物質(zhì)，與赤霉素（GA）和吲哚乙酸（IAA）的圖譜沒有重合峰，說明微生物代謝產(chǎn)物中含有細(xì)胞分裂素和脫落酸，不含有吲哚乙酸和赤霉素。

2.2.2定量測(cè)定根據(jù)定性試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)細(xì)胞分裂素和脫落酸在微生物代謝產(chǎn)物中的含量進(jìn)行定量計(jì)算。

2.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸分別配成10 mg/mL的母液，用甲醇溶解。根據(jù)毛細(xì)管電泳中的定量計(jì)算方法，將植物激素標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為01、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL，分別進(jìn)行進(jìn)樣，見圖3（由于5.0 mg/mL濃度進(jìn)樣時(shí)第2、3個(gè)峰濃度較大出現(xiàn)連峰，因此圖譜未放到圖中）。

根據(jù)毛細(xì)管電泳中的定量計(jì)算方法，將植物激素標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為0.1、1.0、2.0、5.0 mg/mL，分別進(jìn)行進(jìn)樣，以濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（圖 4、圖5）。

毛細(xì)管電泳儀最佳條件下，細(xì)胞分裂素電泳峰面積與濃度在0.1～5.0 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=715 236.440 4x-22 680，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 23，最低檢測(cè)限（LOD）為0.14 μg/mL。脫落酸回歸方程為y=391 391.409 4x+21 489，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 02，最低檢測(cè)限（LOD）為0.28 μg/mL。將目的峰的峰面積帶入方程，得細(xì)胞分裂素的含量為60.93 μg/mL，脫落酸含量為 22.62 μg/mL。

2.2.2.2重復(fù)性和精密性試驗(yàn)取同一濃度的細(xì)胞分裂素標(biāo)準(zhǔn)樣品和脫落酸標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣5次。測(cè)細(xì)胞分裂素遷移時(shí)間的相對(duì)偏差RSD為0.13%，遷移峰面積RSD為1.01%。脫落酸遷移時(shí)間的相對(duì)偏差RSD為0.126%，遷移峰面積RSD為1.92%。準(zhǔn)確度驗(yàn)證采用回收率法進(jìn)行試驗(yàn)。量取3份樣品，分別加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，實(shí)測(cè)添加量與標(biāo)準(zhǔn)添加量之比為回收率。通過試驗(yàn)，測(cè)得細(xì)胞分裂素的回收率在90.1%～94.8%（表1），脫落酸的回收率為95.8%～96.2%。

3討論

測(cè)定植物激素前該微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)行過玉米種子的催芽，稀釋10 000倍的效果顯著，而500倍的提取物對(duì)玉米生長起到了抑制作用，這與植物激素的作用相一致，利用高效毛細(xì)管電泳對(duì)其中的植物激素進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得其含有細(xì)胞分裂素和脫落酸。但細(xì)胞分裂素和脫落酸在植物體內(nèi)的作用機(jī)理尚不明確，產(chǎn)生的植物促生長是聯(lián)合作用還是有某一單獨(dú)成分起作用還有待深入研究。

傳統(tǒng)的生物鑒定法對(duì)植物激素的測(cè)定難以滿足準(zhǔn)確定量分析的要求，文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜法等雖可獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果，但存在操作繁瑣、靈敏度差、費(fèi)用較高的缺點(diǎn)。毛細(xì)管電泳技術(shù)（HPCE）源自傳統(tǒng)電泳技術(shù)，具有微量、準(zhǔn)確、成本低、污染少、分析時(shí)間快、自動(dòng)化程度高的優(yōu)點(diǎn)。本研究以人參內(nèi)生真菌菌絲為測(cè)定目標(biāo)，利用高效毛細(xì)管法來測(cè)定其中的植物激素，通過不同種、不同pH值緩沖液、不同分離電壓及不同進(jìn)樣時(shí)間等條件優(yōu)化后，確定了本試驗(yàn)的電泳條件，在建立分離效果較好的真菌代謝產(chǎn)物的指紋圖譜的同時(shí)，也將各種激素的出峰時(shí)間控制在15 min以內(nèi)，節(jié)省了工作時(shí)間和成本，可以實(shí)現(xiàn)替代高效液相法測(cè)定植物激素，避免有機(jī)溶劑對(duì)人和環(huán)境的傷害，為植物激素的測(cè)定方法提供了一定的參考價(jià)值。

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