植物激素理化分析方法研究進(jìn)展

邢露智+王蓓

摘要：指出了植物激素是植物體內(nèi)天然存在的一系列痕量有機(jī)化合物，對于調(diào)節(jié)植物的各種生長發(fā)育過程和環(huán)境應(yīng)答具有非常重要的作用，因此對植物激素進(jìn)行準(zhǔn)確地定性定量分析是一項(xiàng)艱巨而意義重大的任務(wù)。就近年來植物激素的理化分析方法研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：植物激素；理化分析方法；進(jìn)展

中圖分類號：S184

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-9944（2017）17-0092-03

1 引言

植物激素是植物體內(nèi)天然存在的一系列有機(jī)化合物，對植物生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，植物激素的測定技術(shù)對研究其在植物生命活動的調(diào)節(jié)作用中具有非常重要的意義。由于植物激素含量極低，性質(zhì)不穩(wěn)定、易分解，且前處理過程不能完全消除植物組織中復(fù)雜的基質(zhì)干擾，故而獲得一種靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡便的檢測方法一直是國內(nèi)外諸多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

2 高效液相色譜法

高效液相色譜法靈敏度高、專一性強(qiáng)和重復(fù)性好，是較理想的植物內(nèi)源激素分析方法，但對前處理要求較高，目前已被廣泛應(yīng)用于植物內(nèi)源激素的測定。

陳利德等[1]利用HPLC法對黃牛糞中的赤霉素、吲哚乙酸、脫落酸和細(xì)胞分裂素含量進(jìn)行測定，其中赤霉素含量較高，而脫落酸含量較低。黃島平等[2]采用超高效液相色譜，同時測定吲哚乙酸、脫落酸、赤霉素、玉米素等4種激素，分離效果理想，10 min內(nèi)完成了測定，回收率為 98.2%～101.1%。雷蕾等[3]用反相高效液相色譜法分離和測定經(jīng)不同除草劑處理的亞麻植株中兩種生長素吲哚乙酸與赤霉素，5 min可將兩種激素快速分離和定量測定，線性關(guān)系良好，回收率較高。周艷明等[4]建立高效液相色譜法測定果蔬中 7 種植物激素殘留的方法。選擇 10 種果蔬樣品，經(jīng)提取、凈化，外標(biāo)法定量，回收率均在 70.23%～98.10%范圍內(nèi)。楊途熙等[5]用HPLC法同時分離測定了仁用杏花芽中的腺素、玉米素、赤霉素、生長素、6-芐氨基嘌呤、秋水仙素、脫落酸和吲哚-3-丁酸等8種植物激素，各峰的分離效果理想，加標(biāo)回收率為95.41%～103.48%。童建華等[6]用HPLC法同時檢測棉花根中多種植物激素含量，以乙腈和三乙胺溶液為流動相梯度洗脫，在每種物質(zhì)的保留時間附近切換至最大吸收峰（赤霉酸除外）波長作為檢測波長，并與 254 nm 同一波長檢測多種植物激素含量的方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明切換波長法檢測5種植物激素的靈敏度和回收率均較高，檢出限均較低。簡利茹等[7]應(yīng)用C18萃取小柱提取純化培養(yǎng)液中菌根真菌產(chǎn)生的2種植物激素，經(jīng)過純化富集，吲哚-3-乙酸和赤霉素分離效果理想，回收率分別大于96.8%和95.4%。胡西洲等[8]通過固相萃取結(jié)合分子絡(luò)合物-分散液液微萃取與高效液相色譜聯(lián)用，建立了一種測定椰子汁中酸性植物激素的新方法，該方法的富集倍數(shù)可達(dá)319～478倍，線性關(guān)系良好，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，有望用于植物激素的檢測。趙曼麗等[9]采用反相高效液相色譜法，對駱駝刺分株處根狀莖中植物內(nèi)源激素赤霉素、玉米素和生長素吲哚-3-乙酸進(jìn)行了分離和含量測定，結(jié)果其平均回收率分別為98.3%、90.3%和101.3%。

3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法將高效液相色譜法對復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜法的高選擇性、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，成為目前廣泛應(yīng)用的植物激素測定方法。

郭磊等[10]利用LC-MS 法對從土培擬南芥葉片和水培擬南芥根系中分離的原生質(zhì)體進(jìn)行脫落酸含量分析，結(jié)果表明，所測原生質(zhì)體的脫落酸含量與原生質(zhì)體數(shù)目之間具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為 0.9923和0.9931。該研究以原生質(zhì)體為材料，避免了細(xì)胞間隙中的復(fù)雜化學(xué)成分干擾，提高了植物激素測定的靈敏度和精度，完善了經(jīng)典的植物激素測定技術(shù)。劉雪梅等[11]利用HPLC-QqQ MS聯(lián)用分析系統(tǒng)建立幾種大型海藻中植物激素的分析方法，結(jié)果顯示植物激素濃度在 5～500 μg/L范圍內(nèi)線性良好，檢測限為0.0041～0.8622 μg/L，回收率在 61.33%～90.39%之間。曹慧等[12]建立了食品中多種植物激素殘留量檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法。采用電噴霧-正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式，外標(biāo)法定量，7種植物激素的回收率在80.2%～119.3%。龔明霞等[13]建立了同時測定植物組織中玉米素、吲哚乙酸、赤霉素類、脫落酸、茉莉酸等7種植物激素的UHPLC-QqQ-MS/MS法。在多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行定性定量分析，外標(biāo)法定量。7種植物 激 素的檢出 限為0.01～8.77 ng/mL，定量限為0.02～29.23 ng/mL，植物樣本前處理采用C18-SPE小柱進(jìn)行富集和純化，極大地減少了基質(zhì)干擾。易勇等[14]建立了UPLC-MS/MS法同時測定馬尾藻中吲哚乙酸、吲哚丁酸、脫落酸、玉米素等4 種植物激素的含量。采用多反應(yīng)離子監(jiān)測模式分析測定。在 0.01～1.0 μg/mL內(nèi)，各種植物激素的相關(guān)系數(shù)均大于0.9990，回收率為 84.3% ～102.1%。鐘冬蓮等[15]建立了同時檢測毛竹筍中赤霉素、脫落酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸 4 種內(nèi)源性植物激素的HPLC-MS/MS方法。以超純水和甲醇溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，采用多反應(yīng)監(jiān)測離子模式進(jìn)行定性分析，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，線性范圍在 2～200 μg/L之間。在 5，50 和 200μg/kg 添加水平下，4 種內(nèi)源植物激素的回收率為 75.2%～ 105.0%。李艷等[16]采用HPLC-TQMS技術(shù)，建立了同時分析羊棲菜主分枝、側(cè)分枝、初生葉、次生葉、莖等 5 個部位中吲哚乙酸、異戊烯腺苷、異戊烯腺嘌呤、反式玉米素核苷、玉米素、獨(dú)角金內(nèi)酯、脫落酸、水楊酸、赤霉素、茉莉酸等 10 種植物激素含量的方法，以甲醇和水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧電離，正/負(fù)離子掃描選擇反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行定量分析回收率為 72.24%～ 91.31% 之間。夏群等[17]建立了同時檢測水稻中 6 種內(nèi)源性植物激素脫落酸、吲哚-3-乙酸、水楊酸、茉莉酸、吲哚-3-丙酸和吲哚-3-丁酸的全自動在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。植物樣品經(jīng)過甲醇提取，采用 C18固相萃取柱富集凈化，流動相將待測物洗脫至 C18分析色譜柱進(jìn)行分離，最終使用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測，回收率范圍為71.2% ～126%。盧巧梅等[18]建立了高效液相色譜-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜高靈敏、快速測定多種內(nèi)源植物激素的新方法，吲哚乙酸、脫落酸和赤霉酸在 5分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離，最低檢測限為 8.0 ng/mL。endprint

曹進(jìn)等[19]建立了一種在線制備方法，將樣品粉末化后裝填入小柱，利用水、甲酸-水和甲醇-水在線預(yù)洗制備后，切換至分析流路，采用梯度洗脫及ESI源LC-MS/MS檢測植物中褪黑激素、復(fù)合胺及吲哚乙酸等3種神經(jīng)物質(zhì)，每個樣品的檢測時間10 min，較離線方法的分析時間縮短了1/2，且不損失方法的準(zhǔn)確度及精密度，回收率較離線方法提高約4%。賈鵬禹等[20]采用雙三元液相色譜建立了在線固相萃取技術(shù)與電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法，并成功應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測。同時檢測大豆不同部位中的赤霉素、吲哚乙酸、玉米素和脫落酸等4 種酸堿性植物激素。通過考察固相萃取富集柱、分析色譜柱、流動相對植物激素的保留和選擇性的影響，獲得較高的靈敏度、回收率、穩(wěn)定性及精密度。

4 氣相色譜法

氣相色譜法能夠?qū)Ψ治鰳悠愤M(jìn)行準(zhǔn)確、高靈敏度測量，但由于對樣品的特殊要求，使得待測組分需要具有一定的揮發(fā)性，因此，在植物激素樣品的前處理過程中一般需要對樣品進(jìn)行衍生化。

杜黎明等[21]采用大口徑毛細(xì)管氣相色譜法對多種植物生長素進(jìn)行了測定。萘乙酸、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸、脫落酸和赤霉素等組分，不需衍生化處理，直接進(jìn)樣，獲得了良好的分析結(jié)果，回收率為89.7%～98.2%。付磊等[22]建立了一種采用530 μm大口徑毛細(xì)管色譜柱、不經(jīng)衍生化處理而直接測定植物生長素赤、霉素3的氣相色譜方法。用FID檢測，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.0%，平均回收率為85.8%～ 91.2%。杜黎明等[23]應(yīng)用大口徑毛細(xì)管氣相色譜法，以正二十二烷為內(nèi)標(biāo)物，對植物組織中的吲哚乙酸、脫落酸和赤霉素等3種內(nèi)源激素進(jìn)行了測定，平均回收率為88.4%～92.2%。

5 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法用毛細(xì)管柱代替了常規(guī)液相柱，具有微量、準(zhǔn)確、成本低、污染少、分析時間快、自動化程度高的優(yōu)點(diǎn)，因而也是分離檢測植物激素的有效手段。但由于靈敏度和重現(xiàn)性等方面的限制阻礙了其進(jìn)一步的運(yùn)用。

馬曉穎等[24]建立同時分離測定微生物代謝產(chǎn)物中吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸的毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測器新方法。測得微生物代謝產(chǎn)物中含有細(xì)胞分裂素和脫離酸回收率分別為 90.1%～94.8%、95.8%～96.2%。王艷紅等[25]建立了高效毛細(xì)管電泳法分離測定茶葉中赤霉素、吲哚-3-乙酸、脫落酸、吲哚-3-丁酸、細(xì)胞分裂素等5種植物激素的分析方法。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對高效毛細(xì)管電泳方法中的運(yùn)行電壓、緩沖液pH值和添加劑SDS濃度等分離條件進(jìn)行優(yōu)化，可在11 min以內(nèi)實(shí)現(xiàn)茶葉中5種激素的分離檢測。鄧寧等[26]利用膠束電動毛細(xì)管色譜在柱樣品電堆積的預(yù)富集方法，以十二烷基硫酸鈉膠束作準(zhǔn)固定相，對7種植物激素進(jìn)行了富集和分離。研究了各種分離條件的影響，并分別在高電滲流和聚丙烯酰胺涂層抑制電滲流條件下對植物激素進(jìn)行在柱電堆積富集，各種植物激素的檢出限比文獻(xiàn)報道降低1～2個數(shù)量級。張洪香等[27]建立了毛細(xì)管電泳法同時測定葡萄籽中吲哚乙酸、脫落酸和細(xì)胞分裂素的方法，回收率為85.24%～90.80%。陳嚇俤等[28]制備了具有兩親性的聚 （ 甲基丙烯酸芐基酯-甲基丙烯酸） 膠束，成功地將 5 種植物激素分離，建立了一種植物激素痕量檢測的聚合物膠束毛細(xì)管電動色譜方法，高效、快速、重現(xiàn)性好。

6 其他方法

其他方法包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、離子色譜法、紫外分光光度法和電位滴定法等。

楊一等[29]建立了氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定肥料中2，4-二氯苯氧乙酸的分析方法，主要分為樣品的前處理過程和GC-MS分析過程。以酸性乙腈為提取劑用超聲波輔助提取，甲酯化衍生處理后進(jìn)行GC-MS分析，以3種市售有機(jī)肥為樣品，加標(biāo)回收率為63.5%～78.0%。賈麗等[30]采用離子色譜法測定了土壤中植物激素乙烯利，樣品的加標(biāo)回收率為85.6%～87.9%。朱金花等[31]分別采用紫外分光光度法和電位滴定法測定了脫落酸、3-吲哚乙酸、赤霉素、水楊酸等幾種植物激素的電離常數(shù)，對比分析了兩種測試方法的原理、測試步驟和數(shù)據(jù)處理方法。結(jié)果表明，采用兩種方法測定的4種樣品的電離常數(shù)與文獻(xiàn)報道值一致，且測量結(jié)果的重現(xiàn)性較好，表明紫外分光光度法和電位滴定法可方便地用于測定有機(jī)化合物的電離常數(shù)。

7 結(jié)語

植物內(nèi)源激素對植物體的生長發(fā)育具有至關(guān)重要的作用，因此對植物內(nèi)源激素進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析是一項(xiàng)艱巨而意義重大的任務(wù)。然而植物激素具有含量低、性質(zhì)不穩(wěn)定的特征，且在植物體內(nèi)存在多種其他物質(zhì)會對激素的定量產(chǎn)生干擾，使得這項(xiàng)工作極具挑戰(zhàn)性。液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）由于靈敏度高、選擇性強(qiáng)，對復(fù)雜提取物中內(nèi)源激素的定性具有極高的準(zhǔn)確度，且樣品無需衍生化處理，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)省了時間，且可同時測定多種不同激素，是目前激素分析的主流，也必將是今后的發(fā)展趨勢。

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Abstract：Phytohormones are a series of trace organic compounds synthesized in plants.They exert profound and divers effects on plant growth，development and environmental response.The plant hormones determination technology was an important tool to study their regulatory activity in the plant life.Accordingly，the accurate and reliable quantitative analysis of phytohormones has been one of the primary challenges in the plant research field.This article reviewed the physicochemical determination of plant hormones in recent years.

Key words： phytohormones；physicochemical analytical methods；progressendprint