貴州蕓薹黃化病毒的分子檢測(cè)及基因型鑒定

王莉爽 李淳 陳小均 何海永 陳文 黃露 劉學(xué)輝

王莉爽（1985-），副研究員，主要從事植物病害防治研究工作。主持國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目“辣椒脈黃病毒P0蛋白調(diào)控寄主超敏反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞死亡分子機(jī)制”、貴州省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“十字花科蔬菜病毒病發(fā)生特點(diǎn)及控制技術(shù)研究與示范”、貴州省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目“辣椒新病毒（PeVYV）致病因子篩選及致病性評(píng)價(jià)”等8項(xiàng)科研項(xiàng)目;作為主要成員參與貴州省重大專項(xiàng)子項(xiàng)目、公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)及貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新科研專項(xiàng)等科研項(xiàng)目。在《Plant Disease》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》《園藝學(xué)報(bào)》等期刊上發(fā)表學(xué)術(shù)論文10余篇;編制2個(gè)貴州省地方標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)作物抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范》第16部分“白菜抗TuMV病毒病”（DB52/T 1501.16─2020）和第17部分“大豆抗病毒病”（DB52/T 1501.17─2020）。

摘要：【目的】對(duì)貴州省白菜、蘿卜和甘藍(lán)感染蕓薹黃化病毒（Brassica yellows virus，BrYV）進(jìn)行分子檢測(cè)及基因型鑒定，為馬鈴薯卷葉病毒屬病毒的防治提供理論參考?！痉椒ā吭谫F州省遵義市、威寧縣、關(guān)嶺縣、平壩縣等縣（市）共采集284份蔬菜（白菜、蘿卜和甘藍(lán)）疑似病毒病樣品，利用馬鈴薯卷葉病毒屬的通用引物進(jìn)行RT-PCR分子檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)出的16個(gè)BrYV分離物進(jìn)行P0和CP基因序列擴(kuò)增，再與已報(bào)道的BrYV基因序列進(jìn)行比對(duì)，從而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，鑒定其基因型?！窘Y(jié)果】284份疑似病毒病樣品中，有43份樣品檢測(cè)出BrYV，檢出率為15.14%，其中，感染BrYV白菜樣品12份，占白菜總樣品數(shù)的12.77%;感染BrYV蘿卜樣品14份，占蘿卜總樣品數(shù)的20.29%;感染BrYV甘藍(lán)樣品17份，占甘藍(lán)總樣品數(shù)的14.05%。貴州16個(gè)BrYV分離物P0基因核苷酸序列的相似性為89.9%～100.0%，CP基因核苷酸序列的相似性為93.5%～100.0%，二者編碼的氨基酸序列相似性均為100.0%?；赑0基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)可知，BrYV-Pingba-BC-2、BrYV-Zunyi-LB-1和BrYV-Zhijing-BC-1均與BrYV-BJS和BrYV-BBJ聚為一類，其余13個(gè)分離物均與BrYV-ABJ和BrYV-AJS聚為一類。基于CP基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)可知，貴州不同地區(qū)不同蔬菜作物的16個(gè)BrYV分離與BrYV-A和BrYV-B基因型無(wú)明顯分界，親緣關(guān)系均較近。BrYV P0基因檢測(cè)到5個(gè)重組事件，BrYV CP基因未檢測(cè)到潛在重組事件。【結(jié)論】BrYV在貴州白菜、蘿卜和甘藍(lán)上普遍發(fā)生，但對(duì)蘿卜的危害最重，主要存在BrYV-A和BrYV-B 2種基因型。

關(guān)鍵詞： 蕓薹黃化病毒（BrYV）;十字花科蔬菜;基因型鑒定;分子檢測(cè);系統(tǒng)進(jìn)化

中圖分類號(hào)： S436.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）05-1149-09

Abstract：【Objective】Molecular detection and genotype identification of Brassica yellows virus （BrYV） infection in Chinese cabbage，radish and cabbage in Guizhou were conducted to provide reference for control of potato leaf curl virus. 【Method】284 samples of vegetable（Chinese cabbage，radish and cabbage） virus diseases were collected in Zunyi，Wei-ning， Guanling， Pingba and other cities（counties） in Guizhou. RT-PCR molecular detection using the common primers of potato leaf curl virus was conducted and P0 and CP gene sequences amplification was conducted with the 16 BrYV isolates detected， then compared to the reported BrYV gene sequences. Phylogenetic tree was constructed and its genotype was identified. 【Result】BrYV was detected in 43 suspected samples out of 284 virus disease samples，and the positive rate was 15.14%. Among them，there were 12 BrYV infected samples in cabbage samples，accounting for 12.77% of the total number of cabbage samples; 14 BrYV infected samples in radish samples，accounting for 20.29% of the total number of radish samples; 17 BrYV infected samples in cabbage samples，accounting for 14.05% of the total number of cabbage samples. The nucleotide similarity of P0 gene and CP gene of 16 BrYV isolates were 89.9%-100.0% and 93.5%-100.0%，respectively. The consistency of amino acids sequence was 100.0%. Phylogenetic tree based on P0 gene showed that，BrYV-Pingba-BC-2，BrYV-Zunyi-LB-1，BrYV-Zhijing-BC-1，BrYV-BJS and BrYV-BBJ were clustered into one branch，and the other 13 isolates were clustered into one branch with BrYV-ABJ and BrYV-AJS. There was no obvious boundary between 16 BrYV isolates and BrYV-A and BrYV-B genotypes from different vegetable crops in different areas of Guizhou according to Phylogenetic tree based on CP gene， and the genetic relationships were all relatively close. Five recombination events were detected in BrYV P0 gene and no potential recombination events were detected in BrYV CP gene. 【Conclusion】 BrYV is prevalent in Chinese cabbage，radish and cabbage in Guizhou，but the damage radish is the most serious， there are two genotypes of BrYV-A and BrYV-B.

Key words：Brassica yellows virus;Cruciferous vegetables;genotype identification; molecular detection; phyletic evolution

Foundation item：Guizhou Science and Technology Support Plan Project（QKHZC〔2017〕2576）; Guizhou Basic Research Plan Project（QKHJC〔2017〕1183）; Youth Science and Technology Project of Guizhou Academy of Agricultural Sciences（〔2020〕01）

0 引言

【研究意義】白菜、蘿卜和甘藍(lán)屬于十字花科蔬菜，是貴州常年廣泛種植的蔬菜作物，種植面積較大。貴州地處云貴高原，具有低緯度、高海拔、強(qiáng)日照、溫差大等多樣化的區(qū)域氣候，但由于近年來(lái)十字花科蔬菜品種的引進(jìn)和栽培管理方式的變更，致使十字花科蔬菜病毒病的發(fā)生危害日益嚴(yán)重。十字花科蔬菜感染病毒后主要表現(xiàn)為黃化，葉片畸形或斑駁癥狀，嚴(yán)重影響蔬菜作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。目前，我國(guó)十字花科蔬菜作物上檢測(cè)出的病毒有蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、蕓薹黃化病毒（Brassica yellows virus，BrYV）等14種病毒（吳斌等，2018;劉勇等，2019）。在我國(guó)34個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）中，有21個(gè)地區(qū)種植的十字花科蔬菜作物上均檢測(cè)出BrYV，表明該病毒在我國(guó)的發(fā)生分布十分廣泛（彭艷梅等，2015）。BrYV屬于黃癥病毒科（Luteoviridea）馬鈴薯卷葉病毒屬（Polerovirus）的一種新發(fā)現(xiàn)病毒，在中國(guó)、韓國(guó)和日本均有報(bào)道，主要侵染十字花科植物，包括卷心菜、芥菜、大白菜、花椰菜、蘿卜、油菜、蕪菁甘藍(lán)、煙草等作物，其在自然條件下由蚜蟲(chóng)以持久循回非增殖的方式傳播，僅限于感染韌皮部（Xiang et al.，2011;Lim et al.，2015;Wang et al.，2015，2019）。因此，開(kāi)展BrYV分子檢測(cè)及基因型鑒定對(duì)了解該病毒病的發(fā)生危害情況和遺傳變異特點(diǎn)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】BrYV最早在我國(guó)北京地區(qū)具有黃化癥狀的白菜和甘藍(lán)上檢測(cè)鑒定出（Xiang et al.，2011）。據(jù)研究報(bào)道，BrYV基因組包含6個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），分別編碼P0、P1、P1-P2、P3、P4和P5等6個(gè)蛋白（Zhang et al.，2014），其中，P0蛋白是病毒的致病因子和沉默抑制子（Pfeffer et al.，2002），ORF1和ORF2通過(guò)移碼產(chǎn)生P1-P2融合蛋白，攜帶病毒RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA-polymerase，RdRp）結(jié)構(gòu)域;P3是外殼蛋白（Coat protein，CP）;P4是運(yùn)動(dòng)蛋白（Movement protein，MP）;P5蛋白與病毒載體傳播和韌皮部限制有關(guān)（Peter et al.，2009）。通過(guò)構(gòu)建BrYV和其他馬鈴薯卷葉病毒屬病毒的各基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，BrYV的P0和P1-P2基因與TuYV的P0和P1-P2基因聚為一類，BrYV的P3和P5基因與馬鈴薯卷葉病毒屬其他所有病毒的P3和P5基因聚為一大類，但與TuYV分支較近。因此，BrYV與TuYV的親緣關(guān)系較近，但也存在明顯差異（Xiang et al.，2011）。BrYV和馬鈴薯卷葉病毒屬其他病毒的外殼蛋白氨基酸序列差異為7.9%～9.4%，與P0、P1、P1-P2、P4和P5的氨基酸序列差異均大于10.0%，且根據(jù)BrYV基因組長(zhǎng)度和序列差異，該病毒為一個(gè)獨(dú)特的物種，含有2種基因型（BrYV-A和BrYV-B），尤其是基因組的5'末端有差異（Xiang et al.，2011）。隨后在甘藍(lán)和蘿卜上又鑒定獲得一種新的基因型BrYV-C，2個(gè)BrYV-C分離物的基因組全長(zhǎng)序列與BrYV-A和BrYV-B的同源性為93.4%～94.8%，其系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，BrYV-C分離物中除P5蛋白以外的其他蛋白形成了一個(gè)不同于BrYV-A和BrYV-B分離物的新亞群（Zhang et al.，2014）。為快速鑒定出BrYV 3種基因型，建立了能同時(shí)檢測(cè)和鑒別BrYV 3種基因型的方法——多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（mRT-PCR）（Zhang et al.，2016）。前人除鑒定BrYV基因型外，還利用侵染性cDNA克隆侵染植物進(jìn)行反向遺傳研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子的控制下，構(gòu)建了BrYV-A、BrYV5B3A和BrYV-C的全長(zhǎng)cDNA的侵染性克隆，并利用這些cDNA侵染性克隆建立煙草農(nóng)桿菌接種體系（Zhang et al.，2015）。病毒基因組的重組現(xiàn)象較常見(jiàn)，從韓國(guó)大白菜上鑒定獲得重組BrYV基因組序列（BrYV-Cheongsong），其編碼的氨基酸序列與中國(guó)BrYV-A（HQ388350）基因組編碼的氨基酸同源性為94%（Lim et al.，2015）。為了解BrYV的致病性及其與寄主之間的相互作用，將BrYV的基因組序列轉(zhuǎn)入擬南芥中，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進(jìn)行全基因轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BrYV可誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生紫葉癥狀，該癥狀的產(chǎn)生與花青素生物合成激活密切相關(guān)（Chen et al.，2018）。本氏煙中Rubisco組裝因子2（NbRAF2）對(duì)BrYV-A感染具有抗病毒活性，BrYV-A P0BrA與NbRAF2相互作用，改變其定位模式，促進(jìn)病毒感染（Sun et al.，2018）。BrYV的P0是抑制局部和系統(tǒng)RNA沉默的強(qiáng)病毒沉默抑制子，P0通過(guò)與植物的SKP1相互作用抵抗蛋白酶體和自噬途徑的降解，從而促進(jìn)植物體內(nèi)P0的穩(wěn)定性（劉勇等，2019）。【本研究切入點(diǎn)】BrYV已成為危害十字花科蔬菜的主要病毒之一，雖然BrYV在病毒基因型分類和基因功能等方面有研究報(bào)道，但對(duì)不同地區(qū)不同作物上BrYV遺傳變異分析的相關(guān)研究較少。本研究前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)BrYV已成為侵染危害貴州白菜、蘿卜和甘藍(lán)的主要病毒之一，但目前對(duì)貴州BrYV的分子檢測(cè)及基因型鑒定的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用RT-PCR方法對(duì)疑似病毒病的十字花科樣品進(jìn)行分子鑒定，明確BrYV在貴州的發(fā)生，并對(duì)白菜、蘿卜和甘藍(lán)BrYV分離物的P0和CP基因序列進(jìn)行分析，探明BrYV的遺傳變異，為抗BrYV的十字花科蔬菜品種選育和制定BrYV防控措施提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

采集貴州省遵義市、威寧縣和關(guān)嶺縣等不同縣（市）的具有病毒病癥狀如花葉、黃化等的蘿卜葉片樣品。用錫箔紙包裹后液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。主要試劑：TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript? II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR試劑盒、EasyPure Quick Gel Extraction Kit和pEASY1-Blunt Simple Cloning Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。PCR產(chǎn)物送至重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。主要儀器設(shè)備：PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)）、iBrightTM 1000系列成像系統(tǒng)（Invitrogen，美國(guó)）、2010 Geno/Grinder高通量動(dòng)植物組研磨機(jī)（SPEX，美國(guó)）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 總RNA提取及cDNA合成 參照TransZol Up Plus RNA Kit說(shuō)明書(shū)提取總RNA，并置于-80 ℃保存。以提取的RNA為模板，用TransScript? II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系20.0 μL：5×TransScript? II All-in-One SuperMix for PCR 4.0 μL，總RNA模板2.0 μL，RNase-free Water 14.0 μL。輕輕混勻，25 ℃孵育10 min后，50 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 s失活。然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50.0 μL：10×EasyTaq? Buffer 5.0 μL，正、反向引物（10 μmol/L）1.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，EasyTaq? DNA聚合酶1.0 μL，Nuclease-free Water 38.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1. 2. 2 十字花科蔬菜病毒病檢測(cè) 利用馬鈴薯卷葉病毒屬的通用引物PoconF和PocoCPR（PoconF：5'-GAYTGYTCYGGTTTTGACTGG-3';PocoCPR：5'-CGTCTACCTATTTSGGRTTN-3'）（Xiang et al.，2011），疑似病毒病樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，有目的條帶樣品測(cè)序，獲得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)分析。

1. 2. 3 基因克隆及分析 利用已檢測(cè)出的陽(yáng)性材料對(duì)BrYV的P0和CP基因全長(zhǎng)進(jìn)行克隆，PCR擴(kuò)增引物為BrYV-P0-F：5'-ATGCAATTTGTAGCTCACG AC-3';BrYV-P0-R：5'-TCATACAAACATTTCGGTG TAGACC-3'。BrYV-CP-F：5'-ATGAATACGGTCGT GGGTAGGAGAAC-3';BrYV-CP-R：5'-CTATTTGG GATTATGGAATTGACAC-3'。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后，切割下目的片段進(jìn)行回收、連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，選取陽(yáng)性克隆送至重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。利用BioEdit 5.0和DNAMAN 6.0對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行親緣關(guān)系比較分析;采用MEGA 7.0以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，以Bootstrap（1000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支置信度;運(yùn)用RDP4進(jìn)行序列重組分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 BrYV感染田間癥狀觀察

白菜、蘿卜和甘藍(lán)感染BrYV后，葉片出現(xiàn)褪綠斑，黃綠相間不均，或外圍葉片沿葉脈逐漸變黃，心葉出現(xiàn)花葉癥狀（圖1）。

2. 2 十字花科蔬菜病毒病的檢測(cè)結(jié)果

利用馬鈴薯卷葉病毒屬的通用引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明284份十字花科蔬菜的疑似病毒病樣品中，有60份樣品擴(kuò)增到約1390 bp特異性條帶，其他樣品則未擴(kuò)增到任何片段（圖2），表明這60份陽(yáng)性樣品為病毒病樣品。對(duì)陽(yáng)性樣品測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與GenBank中的BrYV（KY310572）序列相似性達(dá)99%以上的材料有43份，與甜菜西方黃化病毒（Beet western yellows virus，BWYV）（HM804471）序列相似性達(dá)98%以上的材料有17份，表明擴(kuò)增獲得的片段為馬鈴薯卷葉病毒屬病毒特異基因片段。由此推測(cè)侵染貴州十字花科蔬菜的病毒主要為BrYV和BWYV。

2. 3 BrYV P0和CP基因克隆及樣品檢測(cè)結(jié)果

采用RT-PCR擴(kuò)增BrYV P0和CP基因全長(zhǎng)，經(jīng)回收、連接和轉(zhuǎn)化，測(cè)序結(jié)果顯示P0基因長(zhǎng)度為750 bp，CP基因長(zhǎng)度為609 bp。由圖3和圖4可知，上述鑒定為蔬菜病毒病的樣品均擴(kuò)增出P0和CP基因，未檢測(cè)出病毒的樣品則未擴(kuò)增出任何條帶。284份疑似病毒病樣品（白菜94份、蘿卜69份和甘藍(lán)121份）中，共有43份樣品感染BrYV，占總樣品數(shù)的15.14%，其中感染BrYV的白菜樣品12份，占白菜總樣品數(shù)的12.77%;感染BrYV的蘿卜樣品14份，占蘿卜總樣品數(shù)的20.29%;感染BrYV的甘藍(lán)樣品17份，占甘藍(lán)總樣品數(shù)的14.05%（表1）。按采集蔬菜樣品地區(qū)BrYV的檢出率由高到低分別是遵義市蘿卜病毒病樣品（36.36%）>威寧縣蘿卜樣品（31.82%）>關(guān)嶺縣蘿卜樣品（27.27%）>織金縣白菜樣品（25.00%）>平壩縣白菜樣品（21.74%）>修文縣甘藍(lán)樣品（20.37%）>威寧縣甘藍(lán)樣品（20.00%）>平壩縣甘藍(lán)樣品（16.00%）（表2）。綜上可知，BrYV對(duì)蘿卜的危害最重，其次是白菜，對(duì)甘藍(lán)的危害最輕。

2. 4 BrYV P0和CP基因序列比較結(jié)果

從不同采集地的白菜、蘿卜和甘藍(lán)病毒病樣品中，選取16個(gè)BrYV貴州分離物與已報(bào)道的BrYV的 3個(gè)基因型的P0和CP基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示P0基因核苷酸相似性為89.9%～100.0%，其編碼的氨基酸相似性均為100.0%;CP基因核苷酸相似性為93.5%～100.0%，其編碼的氨基酸相似性均為100.0%。從基因重組分析結(jié)果可知，BrYV P0基因共檢測(cè)出5個(gè)重組事件，貴州BrYV P0基因?qū)儆贐rYV-A和BrYV-B基因型;BrYV CP基因未檢測(cè)到潛在重組事件?？梢?jiàn)，貴州不同地區(qū)不同蔬菜作物BrYV的P0基因發(fā)生明顯重組，CP基因無(wú)明顯重組（表3）。

2. 5 BrYV P0和CP基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

由系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖5）可知，威寧縣、關(guān)嶺縣和遵義縣的6個(gè)BrYV蘿卜分離物P0基因，威寧縣、平壩縣和修文縣的6個(gè)BrYV甘藍(lán)分離物P0基因，以及平壩縣和織金縣的4個(gè)BrYV白菜分離物P0基因，分別與已報(bào)道的BrYV分離物聚為一大類，其中，BrYV-Pingba-BC-2、BrYV-Zunyi-LB-1和BrYV-Zhijing-BC-1均與BrYV-BJS和BrYV-BBJ聚為一類;BrYV-Zhijing-BC-2、BrYV-Xiuwen-GL-1、BrYV-Xiuwen-GL-2，BrYV-Guanling-LB-2、BrYV-Pingba-GL-1、BrYV-Pingba-GL-2、BrYV-Zunyi-LB-2、BrYV-Weining-GL-1、BrYV-Weining-GL-2、BrYV-Weining-LB-1、BrYV-Weining-LB-2、BrYV-Guanling-LB-1和BrYV-Pingba-BC-1等13個(gè)分離物均與BrYV-ABJ和BrYV-AJS聚為一類。綜上所述，貴州不同地區(qū)不同蔬菜作物上BrYV分離物屬于BrYV-A和BrYV-B 2種基因型，侵染甘藍(lán)的BrYV為BrYV-A基因型，侵染白菜和蘿卜的BrYV為BrYV-A和BrYV-B基因型，以BrYV-A為優(yōu)勢(shì)株系。從地理分布來(lái)看，BrYV-A和BrYV-B的地域差異不明顯。

由系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖6）可知，威寧縣、關(guān)嶺縣和遵義市的6個(gè)BrYV蘿卜分離物CP基因，威寧縣、平壩縣和修文縣的6個(gè)BrYV甘藍(lán)分離物CP基因，以及平壩縣和織金縣的4個(gè)BrYV白菜分離物CP基因，分別與已報(bào)道的BrYV分離物聚為一類，其中BrYV-Pingba-BC-2與BrYV-China（KY310572）的親緣關(guān)系較近;BrYV-Weining-LB-1與BrYV-Cheongsong親緣關(guān)系較近;BrYV-Pingba-BC-1、BrYV-Pingba-GL-1、BrYV-Zunyi-LB-1、BrYV-Zhijing-BC-1、BrYV-Zhijing-BC-2、BrYV-Weining-GL-1、BrYV-Weining-GL-2、BrYV-Weining-LB-2、BrYV-Xiuwen-GL-1等9個(gè)分離物聚為一類，該類與BrYV-ABJ（NC016038）、BrYV-ABJ（HQ388348）、BrYV-BBJ（HQ388349）和BrYV-SA（MH427277）親緣關(guān)系較近;BrYV-Xiuwen-GL-2、BrYV-Pingba-GL-2、BrYV-Zunyi-LB-2、BrYV-Guanling-LB-1和BrYV-Guanling-LB-2等5個(gè)分離物聚為一類，該類與BrYV-BJS（HQ388351）親緣關(guān)系較近。綜上所述，貴州不同地區(qū)不同蔬菜作物的16個(gè)BrYV分離與BrYV-A和BrYV-B基因型無(wú)明顯分界，親緣關(guān)系均較近。

3 討論

已有大量研究人員采用分子生物學(xué)方法對(duì)我國(guó)許多地區(qū)十字花科蔬菜的病毒種類進(jìn)行鑒定，如袁偉玲等（2015）對(duì)湖北廣水蘿卜病毒病進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要感染病毒為蠶豆萎蔫病毒（Broad bean wilt virus，BBWV）、TuMV和CMV，其中約25%的樣本是由2種或2種以上的病毒復(fù)合侵染;劉歡等（2017）對(duì)我國(guó)西北地區(qū)陜西省和甘肅省大白菜病毒病進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要感染病毒為煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、CMV和TuMV;葉艷英等（2012）研究的山東甘藍(lán)、廖一鳴（2018）研究的沈陽(yáng)蘿卜及熊艷等（2018）研究的重慶蘿卜主要感染病毒的優(yōu)勢(shì)毒源均為T(mén)uMV。但目前對(duì)BrYV基因組編碼蛋白的序列分析鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期研究（王莉爽等，2015）發(fā)現(xiàn)，侵染貴州十字花科蔬菜的病毒僅為CMV和TuMV。由于蔬菜引進(jìn)和氣候環(huán)境的變化，蔬菜病毒病的種類發(fā)生了變化，因此本研究利用馬鈴薯卷葉病毒屬的通用引物對(duì)貴州的白菜、蘿卜和甘藍(lán)疑似病毒病樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出BrYV和BWYV 2種病毒，但僅對(duì)檢出率較高的BrYV P0和CP基因序列進(jìn)行擴(kuò)增研究，因此，病毒病癥狀明顯的樣品中是否還存在其他病毒種類有待鑒定。

本研究根據(jù)BrYV P0和CP基因序列比對(duì)及其系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，可將16個(gè)BrYV分離物P0基因分為BrYV-A和BrYV-B 2種基因型，表明貴州白菜、蘿卜和甘藍(lán)BrYV分離物可能來(lái)自于不同毒源的不同變異株;16個(gè)BrYV分離物CP基因與BrYV-A和BrYV-B基因型無(wú)明顯分界，親緣關(guān)系均較近。綜上所述，貴州BrYV分離物的P0和CP基因均與BrYV-A和BrYV-B聚在一起，表明貴州不同地區(qū)的白菜、蘿卜和甘藍(lán)BrYV分離物存在BrYV-A和BrYV-B 2種基因型。基因重組是病毒變異的重要因素，本研究對(duì)16個(gè)BrYV分離物進(jìn)行基因重組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P0基因檢測(cè)出5個(gè)潛在重組事件，CP基因未檢出重組事件;但其他區(qū)段是否存在基因重組事件，還需進(jìn)行全基因組序列分析。

BrYV是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的侵染十字花科作物的一種新病毒，其基因型致病性、分布和寄主范圍仍有待確定。根據(jù)BrYV基因組5'端序列的差異性，將其主要分為3種基因型，即BrYV-A、BrYV-B和BrYV-C（Xiang et al.，2011;Zhang et al.，2014）。本研究基于BrYV的P0和CP基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果對(duì)貴州省6個(gè)縣（市）白菜、蘿卜和甘藍(lán)BrYV分離物進(jìn)行基因型鑒定，但由于受樣品數(shù)量、地域及采集時(shí)間的限制，對(duì)于BrYV-A和BrYV-B基因型在貴州省是否存在其他寄主，有待進(jìn)一步研究。為更好地了解BrYV的3種基因型的流行學(xué)信息，有必要對(duì)貴州不同地區(qū)不同蔬菜作物的3種BrYV基因型進(jìn)行鑒定，為該病害的防控打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

BrYV在貴州白菜、蘿卜和甘藍(lán)上普遍發(fā)生，但對(duì)蘿卜的危害最重，主要存在BrYV-A和BrYV-B 2種基因型。

參考文獻(xiàn)：

廖一鳴. 2018. 沈陽(yáng)和蓋州地區(qū)蘿卜病毒病的分子檢測(cè)與鑒定[D]. 沈陽(yáng)：沈陽(yáng)大學(xué). [Liao Y M. 2018. Detection and identification of radish virus disease in Shenyang and Gaizhou[D]. Shenyang：Shenyang University.]

劉歡，李春游，劉斐，郝興安，吳云鋒. 2017. 3種大白菜病毒多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的建立[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），45（9）：109-115. doi：10.13207/j.cnki.jnwafu.2017.09.015. [Liu H，Li C Y，Liu F，Hao X A，Wu Y F. 2017. Simultaneous detection of three viruses infec-ting Chinese cabbage by multiplex RT-PCR[J]. Journal of Northwest A & F University（Natural Science Edition），45（9）：109-115.]

劉勇，李凡，李月月，張松柏，高希武，謝艷，燕飛，張安盛，戴良英，程兆榜，丁銘，牛顏冰，王升吉，車(chē)海彥，江彤，史曉斌，何自福，吳云鋒，張德詠，青玲，嚴(yán)婉榮，楊學(xué)輝，湯亞飛，鄭紅英，唐前君，章松柏，章東方，蔡麗，陶小榮. 2019. 侵染我國(guó)主要蔬菜作物的病毒種類、分布與發(fā)生趨勢(shì)[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，52（2）：239-261. doi：10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.005. [Liu Y，Li F，Li Y Y，Zhang S B，Gao X W，Xie Y，Yan F，Zhang A S，Dai L Y，Cheng Z B，Ding M，Niu Y B，Wang S J，Che H Y，Jiang T，Shi X B，He Z F，Wu Y F，Zhang D Y，Qing L，Yan W R，Yang X H，Tang Y F，Zheng H Y，Tang Q J，Zhang S B，Zhang D F，Cai L，Tao X R. 2019. Identification，di-stribution andoccurrence of viruses in the main vegetables of China[J]. Scientia Agricultura Sinica，52（2）：239-261.]

彭艷梅，張曉艷，王穎，向海英，張宗英，李大偉，于嘉林，韓成貴. 2015. 蕓薹黃化病毒三種基因型在我國(guó)的發(fā)生分布檢測(cè)[C]//中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)會(huì)議論文集. ?？冢褐袊?guó)植物病理學(xué)會(huì). [Peng Y M，Zhang X Y，Wang Y，Xiang H Y，Zhang Z Y，Li D W，Yu J L，Han C G. 2015. Detection of three genotypes of Brassica yellow virus in China [C]//Proceedings of the Conference of the Chinese Society of Plant Pathology. Haikou：The Chinese Society of Plant Pathology.]

王莉爽，陳小均，陳文，譚清群，楊學(xué)輝. 2015. 貴州蔬菜病毒病主要病毒種類檢測(cè)[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，42（20）：63-67. doi：10.3969/j.issn.1004-874X.2015.20.012. [Wang L S，Chen X J，Chen W，Tan Q Q，Yang X H. 2015. Detection of main viral species of vegetable virus deseases in Guizhou[J]. Guangdong Agricultural Sciences，42（20）：63-67.]

吳斌，張眉，姜珊珊，張安盛，崔漢青，辛志梅，馬立平，王升吉. 2018. 大白菜、蘿卜蕪菁花葉病毒系統(tǒng)進(jìn)化及CP序列分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，50（8）：100-105. doi：10.14083/j.issn.1001-4942.2018.08.021. [Wu B，Zhang M，Jiang S S，Zhang A S，Cui H Q，Xin Z M，Ma L P，Wang S J. 2018. Phylogenetic evolution and CP nucleotide sequence analysis of TuMV in Chinese cabbage and radish[J]. Shandong Agricultural Sciences，50（8）：100-105.]

熊艷，孫淼，向華豐，王鶴冰，張洪成，青玲. 2018. 重慶市蘿卜蕪菁花葉病毒的檢測(cè)與序列分析[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，45（3）：432-438. doi：10.13802/j.cnki.zwbhxb.2018.2016188. [Xiong Y，Sun M，Xiang H F，Wang H B，Zhang H C，Qing L. 2018. Detection and sequence analysis of CP gene of Turnip mosaic virus（TuMV） infecting radish plants in Chongqing City[J]. Journal of Plant Protection，45（3）：432-438.]

葉艷英，曾鋼，閆曉紅，馬榮才，吳才君，姚磊. 2012. 蕪菁花葉病毒蘿卜與甘藍(lán)分離物P3基因的克隆與序列分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，34（2）：264-269. doi：10.3969/j.issn. 1000-2286.2012.02.012. [Ye Y Y，Zeng G，Yan X H，Ma R C，Wu C Q，Yao L. 2012. Cloning and sequence analysis of P3 gene of Turnip mosaic virus isolates from Brassica and Raphanus[J]. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis，34（2）：264-269.]

袁偉玲，袁尚勇，甘彩霞，崔磊，鄧曉輝. 2015. 湖北廣水蘿卜病毒病的分子鑒定與防治[J]. 長(zhǎng)江蔬菜，（8）：61-62. doi：10.3865/j.issn.1001-3547.2015.08.021. [Yuan W L，Yuan S Y，Gan C X，Cui L，Deng X H. 2015. Molecular identification and prevention of radish virus disease in Guangshui of Hubei Province[J]. Journal of Changjiang Vegetables，（8）：61-62.]

Chen X R，Wang Y，Zhao H H，Zhang X Y，Wang X B，Li D W，Yu J L，Han C G. 2018. Brassica yellows virusmovement protein upregulates anthocyanin accumulation，lea-ding to the development of purple leaf symptoms，on Arabidopsis thaliana[J]. Scientific Reports，8（1）：16273. doi：10.1038/s41598-018-34591-5.

Lim S，Yoo R H，Igori D，Zhao F，Kim K H，Moon J S. 2015. Genome sequence of a recombinant Brassica yellows virus infecting Chinese cabbage[J]. Archives of Virology，160（2）：597-600. doi：10.1007/s00705-014-2258-1.

Peter K A，Gildow F，Palukaitis P，Gray S M. 2009. The C terminus of the polerovirus p5 readthrough domain limits virus infection to the phloem[J]. Journal of Virology，83（11）：5419-5429. doi：10.1128/JVI.02312-08.

Pfeffer S，Dunoyer P，Heim F，Richards K E，Jonard G，Ziegler G V. 2002. P0 of beet western yellows virus is a suppressor of posttranscriptional gene silencing[J]. Journal of Virology，76（13）：6815-6824. doi：10.1128/JVI.76.13. 6815-6824.2002.

Sun Q，Li Y Y，Wang Y，Zhao H H，Zhao T Y，Zhang Z Y，Li D W，Yu J L，Wang X B，Zhang Y L，Han C G. 2018. Brassica yellows virus P0 protein impairs the antiviral activity of? NbRAF2 in Nicotiana benthamiana[J]. Journal of Experimental Botany，69（12）：3127-3139. doi：10.1093/ jxb/ery131.

Wang Q，Mao J J，Xiang H Y，Dong L H，Sun Y H，Liu G S，Liu H B. 2015. First report of Brassica yellows virus on tobacco in China[J]. Plant Disease，99（8）：1192. doi：10. 1094/PDIS-12-14-1348-PDN.

Wang Q，Xu F Z，An L L，Xiang H Y，Zhang W H，Liu G S，Liu H B. 2019. Molecular characterization of a new recombinant Brassica yellows virus infecting tobacco in China[J]. Virus Genes，55：253-256. doi：10.1007/s11262-019-01636-4.

Xiang H Y，Dong S W，Shang Q X，Zhou C J，Li D W，Yu J L，Han C G. 2011. Molecular characterization of two geno-types of a new polerovirus infecting brassicas in China[J]. Archives of Virology，156（12）：2251-2255. doi：10. 1007/s00705-011-1091-z.

Zhang X Y，Dong S W，Xiang H Y，Chen X R，Li D W，Yu J L，Han C G. 2015. Development of three full-length infectious cDNA clones of distinct Brassica yellows virus genotypes for agrobacterium-mediated inoculation[J]. Virus Research，197：13-16. doi：10.1016/j.virusres.2014.12. 005.

Zhang X Y，Peng Y M，Wang Y，Zhang Z Y，Li D W，Yu J L，Han C G. 2016. Simultaneous detection and differentiation of three genotypes of Brassica yellows virus by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction[J]. Virology Journal，13（1）：189. doi：10.1186/s12985-016-0647-7.

Zhang X Y，Xiang H Y，Zhou C J，Li D W，Yu J L，Han C G. 2014. Complete genome sequence analysis identifies a new genotype of Brassica yellows virus that infects cabbage and radish in China[J]. Archives of Virology，159（8）：2177-2180. doi：10.1007/s00705-014-2027-1.

（責(zé)任編輯 陳 燕）