海帶多糖超聲法提取工藝優(yōu)化及其對RAW264.7巨噬細胞炎癥反應的影響

吳紫云，王海潔，孫嬋嬋，賀紅軍

（煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005）

海帶是世界上養(yǎng)殖最廣和消費最多的食用褐藻，素有“海中蔬菜”之稱，含有多糖、肽、ω-3 脂肪酸、酚類物質(zhì)等豐富的生物活性化合物[1]，其營養(yǎng)成分多、藥用價值高，我國的海帶總產(chǎn)量位居世界第一，海帶的養(yǎng)殖業(yè)是一個大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)，且海帶深受亞洲人民的喜愛[2]。海帶多糖為一種硫化多糖，存在于褐藻中，研究表明，其具有抗腫瘤[3]、降血脂[4]、抗病毒[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]等改善人類健康和賦予各種生理功能的潛力。因此，海帶多糖已成為開發(fā)功能性食品和新型醫(yī)藥產(chǎn)品的重要來源[7]。目前，海帶多糖的提取方法有熱水浸提法[8]、超聲輔助提取法[9]、酶輔助提取法[10]等，但水提法耗能大，且得率低，酶法的生產(chǎn)成本高，酸提法酸度過高容易造成多糖的破壞。

巨噬細胞作為人體自身免疫系統(tǒng)中重要的一部分，其可維持組織形態(tài)，且具有監(jiān)視目標生物體的破壞和趨化性等功能[11]。這些功能的多樣性取決于其對炎癥信號的差異性反應，如脂多糖和一些γ 干擾素會誘導巨噬細胞，使其產(chǎn)生M1 型極化，釋放大量的促炎因子[12]，而白細胞介素刺激巨噬細胞產(chǎn)生M2型極化，使細胞因子得到釋放，發(fā)生炎癥的拮抗作用[13]。因此，激活巨噬細胞為抵抗疾病提供了一個新思路。

以鮮海帶為原料，通過超聲輔助法對海帶多糖進行提取，再通過海帶多糖對巨噬細胞的黏附試驗、細胞的增殖活力和細胞內(nèi)NO、ROS 的釋放，研究海帶多糖對巨噬細胞的炎癥反應。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶，購于煙臺萊山區(qū)海鮮市場；95%乙醇、無水乙醇，分析純，煙臺三和化學試劑有限公司提供；碳酸氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司提供；DMEM 培養(yǎng)基粉末、青霉素-鏈霉素混合溶液（100×雙抗），美國GIBCO 公司提供；胎牛血清培養(yǎng)基，浙江天杭生物科技有限公司提供；胰蛋白酶粉末、MTT 檢測試劑盒，北京biodee 公司提供；NO 檢測試劑盒，上海Beyotime 公司提供；二甲基亞砜、DCFH-DA，美國Sigma 公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

101-3 型電熱鼓風干燥箱，龍口市先科儀器公司產(chǎn)品；JM-05D-40 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；GTR16-2 型高速臺式冷凍離心機，北京時代北利離心機有限公司產(chǎn)品；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；DU800 型可見分光光度計，美國Beckman 公司產(chǎn)品；LGJ-10 型冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；Olympus IX 50 型倒置相差顯微鏡香港，MOTIC 公司產(chǎn)品；Thermo 3111 型CO2細胞培養(yǎng)箱，日本三洋電器集團產(chǎn)品；MS-TS 型電子分析天平，福州華志科技有限公司產(chǎn)品；LS-750 型液氮罐，泰來華頓公司產(chǎn)品；SW-CJ-1F 型生物超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；MH-2 型微孔板孵育振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；多功能酶標儀，Molecular Device 公司產(chǎn)品；流式細胞儀，杭州艾森公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲輔助法提取海帶粗多糖的單因素試驗

稱取2 g 海帶粉末放入錐形瓶中，按照比例加入去離子水，放入超聲波中處理30 min，其中分別以料液比（1∶40～1∶80）、超聲溫度（40～80 ℃）、超聲功率（60～100 W）和提取次數(shù)（1～5 次）為變量。以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，分離得到上清液。將海帶殘渣以相同的料液比繼續(xù)加入去離子水，重復以上步驟若干次。將上清液濃縮至一定體積，加入4 倍體積的無水乙醇。在4 ℃的溫度下醇沉12 h，離心，取其沉淀冷凍干燥，獲得粗多糖。

1.3.2 海帶多糖提取的響應面優(yōu)化

以單因素試驗的結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇料液比、溫度和超聲功率為變量，進行三因素三水平的響應面試驗。

響應面試驗設(shè)計因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應面試驗設(shè)計因素與水平設(shè)計

1.3.3 海帶多糖對巨噬細胞的影響

采用邢麗[14]的方法，觀察不同組別不同視野中的細胞貼壁情況。采用MTT 法[15]測定海帶多糖對巨噬細胞增殖活力的影響。參考張云超等人[16]的方法，建立LPS 脂多糖模型，參考唐赫鵬等人[17]的方法，分別測定建立和不建立LPS 脂多糖模型細胞內(nèi)NO 的釋放量。采用DCFH-DA 法[18]測定海帶多糖對巨噬細胞內(nèi)活性氧釋放的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取法提取海帶多糖的結(jié)果分析

2.1.1 變量因素對海帶多糖提取率的影響

變量因素對海帶多糖提取率的影響見圖1。

由圖1（a）可知，當超聲功率為80 W，提取次數(shù)為3 次，料液比為1∶60 時，隨著提取溫度的升高，海帶多糖的提取率先升高，再緩慢下降。當提取溫度為70 ℃時，海帶多糖的提取率達到最高。因此，選擇60，70，80 ℃進行后續(xù)響應面試驗。

由圖1（b）可知，當溫度為70 ℃，提取次數(shù)為3 次，超聲功率為80 W 時，隨著料液比的增大，多糖得率先升高再緩慢下降。當料液比為1∶60 時，多糖的提取率達到最高。因此，選擇料液比為1∶50，1∶60，1∶70 進行后續(xù)響應面試驗。

圖1 變量因素對海帶多糖提取率的影響

由圖1（c）可知，當溫度為70 ℃，提取次數(shù)為3 次，料液比為1∶60 時，隨著超聲功率的增大，海帶多糖的提取率先升高再下降。當超聲功率為90 W時，多糖的提取率達到最高。因此，選擇超聲功率80，90，100 W 進行后續(xù)響應面試驗。

由圖1（d）可知，當超聲功率為80 W，提取溫度為70 ℃，料液比為1∶60 時，隨著提取次數(shù)的升高，海帶多糖的提取率隨之升高。當提取次數(shù)為3～5 次時，提取率的增加幅度很小，對海帶多糖提取率的作用效果不明顯，且提高了成本。因此，選擇提取次數(shù)為3 次。

2.1.2 響應面法優(yōu)化海帶多糖的提取工藝

（1）響應面試驗方案及結(jié)果。以料液比、溫度和超聲功率為響應變量，海帶多糖得率為響應值，進行響應面試驗（見表2），對表2 數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，建立工藝參數(shù)回歸模型。該模型的回歸方程為：

Box-behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 Box-behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 為超聲法提取海帶多糖響應面模型的方差分析，響應面模型中p 值的大小決定了該模型是否顯著，p 值越小，該模型越顯著[19]。由表3 可知，該模型的p 值小于0.001，說明該模型達到極顯著性水平。從一次項的偏回歸系數(shù)可以得出，料液比對海帶多糖得率達到極顯著水平，提取溫度和超聲功率對海帶多糖的得率具有顯著性水平。從交互項可以看出，提取溫度和料液比之間的交互作用對海帶多糖提取率具有顯著性水平，提取溫度和超聲功率與料液比和超聲功率之間的交互作用對海帶多糖的得率均不具有顯著性。F 值可以判斷各因素對海帶多糖提取率的影響[19]。F 值的大小為料液比>超聲功率>提取溫度，即料液比對海帶多糖得率的影響最大，其次為超聲功率，最后是提取溫度。該模型失擬度的p 值為0.058 1（>0.05），說明模型的擬合度比較好，可用于討論多糖的真實提取率。

回歸模型方差分析見表3，方程相關(guān)系數(shù)見表4。

表3 回歸模型方差分析

由表4 可知，該模型的決定系數(shù)為0.984 6，模型的校正決定系數(shù)為0.964 8，模型的變異系數(shù)為3.55%，進一步說明了該模型的可靠性好。綜上得知回歸方程的擬合性比較高，可用于多糖提取率的預測。

表4 方程相關(guān)系數(shù)

（2）響應面及等高線分析。通過軟件繪制提取率與試驗因素的響應面及等高線分析圖，其中響應面圖中的縱坐標為海帶多糖的提取率，橫坐標分別為影響海帶多糖得率的試驗因素。

變量因素對海帶多糖得率交互影響的響應面圖見圖2。

圖2 變量因素對海帶多糖得率交互影響的響應面圖

圖2 為兩個交互因素對多糖得率的影響，可知交互項對多糖得率的影響作用大小為AB>AC>BC，與表3 的結(jié)果一致。采用響應面軟件對二次多元回歸方程求解，得知料液比、提取溫度和超聲功率的最適組合為料液比1∶63.72（mg∶mL），提取溫度67.73 ℃，超聲功率88.81 W，此時海帶多糖得率最高，達到17.88%。為了驗證試驗模型的有效性，考慮到實際情況將最佳工藝條件修正為料液比為1∶64（mg∶mL），提取溫度為68 ℃，超聲功率為89 W。在此工藝條件下，進行驗證試驗，發(fā)現(xiàn)海帶多糖的得率為17.73%，與預測值無顯著性差異。以上結(jié)果說明，該模型可以較好地預測海帶多糖的提取率。

目前，國內(nèi)外大量學者對海帶多糖的提取工藝進行了探究。楊曉雪[20]采用復合酶法與水提法結(jié)合提取褐藻糖膠，通過正交試驗優(yōu)化可知，當復合酶比例關(guān)系為果膠酶∶α -淀粉酶∶酸性蛋白酶∶纖維素酶∶木聚糖酶的比為11∶1∶5∶18∶11，復合酶添加量為480 U/g，酶解溫度為59 ℃，pH 值為4.5，提取時間為10 h，料液比為1∶30（g∶mL）時，此時褐藻多糖的得率為12.04%。Lu J H 等人[21]采用檸檬酸法提取多糖，得知最佳條件為pH 值2，溫度120 ℃，時間3 h，此時多糖得率為13.31±0.08%。試驗采用超聲輔助提取，得率顯著性高于其他提取工藝。

2.2 海帶多糖對巨噬細胞的影響

2.2.1 海帶多糖對RAW264.7 巨噬細胞貼壁能力的影響

海帶多糖對RAW264.7 巨噬細胞的貼壁能力的影響見圖3，不同質(zhì)量濃度海帶多糖對巨噬細胞增殖活力的影響見圖4。

圖3 海帶多糖對RAW264.7 巨噬細胞的貼壁能力的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度海帶多糖對巨噬細胞增殖活力的影響

由圖3 可知，RAW264.7 巨噬細胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度的海帶多糖處理后，其黏附作用沒有很大變化。與對照組相比，加入海帶多糖后，巨噬細胞由原來的圓形或者橢圓形分化為典型的梭狀，并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。

通過MTT 法檢測海帶多糖對RAW264.7 巨噬細胞活力的影響。試驗中，對海帶多糖設(shè)置了質(zhì)量濃度梯度，分別為50，100，200，300，400，500 μg/mL，每個濃度設(shè)置4 個重復。藥物質(zhì)量濃度處理細胞24 h 后，采用酶標儀在570 nm 處讀取吸收值。由圖4 可知，海帶多糖對RAW264.7 巨噬細胞活力沒有明顯的抑制作用。Ji Young Lee 等人[22]研究發(fā)現(xiàn)加入海帶多糖之后對巨噬細胞的活力沒有明顯的抑制作用，說明海帶多糖對巨噬細胞沒有毒性，與試驗結(jié)果一致。

2.2.2 海帶多糖對RAW264.7 巨噬細胞NO、ROS釋放量的影響

不同質(zhì)量濃度海帶多糖對建立LPS 脂多糖模型NO 釋放量和巨噬細胞NO 和ROS 釋放量的影響見圖5。

由圖5（a）可知，相對于模型（LPS）組，LPS與海帶多糖復合組中NO 的釋放量隨著海帶多糖質(zhì)量濃度的升高也升高，且當海帶多糖質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時，其NO 的釋放量高于模型組的釋放量。由圖5（b）可知，加入不同濃度的海帶多糖會導致RAW264.7 巨噬細胞NO 釋放量呈依賴性增加。對照組中NO 的釋放量為2.34 μmol/L，當海帶多糖質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時，NO 的釋放量達到16.75 μmol/L，為對照組的7.16 倍，說明海帶多糖可顯著提高巨噬細胞對NO 的釋放。

圖5 不同質(zhì)量濃度海帶多糖對建立LPS 脂多糖模型NO釋放量和巨噬細胞NO 和ROS 釋放量的影響

NO 是機體中不可或缺的生物活性分子，是非特異性宿主用來防御腫瘤和防止微生物入侵的重要活性物質(zhì)[23]。NO 在溶液中極易氧化成NO22-和NO33-，NO33-可通過鎘被還原為NO22-，在堿性條件下，NO22-和磺胺作用生成重氮鹽，與N-1-奈基乙二胺鹽酸進行偶聯(lián)反應，生成有顏色的化合物，從而可以確定NO 的含量。余玲等人[24]研究發(fā)現(xiàn)，添加雷公藤紅素與吲哚美辛會顯著降低LPS 模型中NO 的釋放，說明其具有較好的抗炎效果，與試驗結(jié)果相反，說明海帶多糖對巨噬細胞不產(chǎn)生抗炎作用。

由圖5（c）和圖5（d）可知，與對照組相比，加入不同質(zhì)量濃度的海帶多糖會導致RAW264.7 巨噬細胞總ROS 水平濃度依賴性的增加，其中海帶多糖質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時，ROS 釋放量達到最多。CFH-DA 本身沒有熒光，是非標記性的氧化敏感的熒光探針，其可以自由穿入細胞膜，當DCFH-DA進入細胞后，會被酯酶進行水解，水解成為DCFH，但是DCFH 卻不能穿過細胞膜，因此可以把探針裝到細胞內(nèi)。且細胞內(nèi)的ROS 可以使不含熒光的DCFH 轉(zhuǎn)化為含有熒光的DCF，從而可以檢測出ROS 的釋放量。Schepetkin I A 等人[25]的試驗表明，植物多糖可增強巨噬細胞的吞噬、分泌活性，誘導其釋放NO 和ROS 等炎癥因子。Yon-Suk K 等人[23]和Cheng F 等人[26]的研究表明，多糖可促使MAPKs 和NF-κB 通路的相關(guān)蛋白發(fā)生磷酸化，從而活化MAPKs 和NF-κB 的通路，進而使細胞分泌NO。當有害物質(zhì)入侵時，會激活免疫反應，釋放ROS 等炎癥因子[27]。

當巨噬細胞當受到外界的一些刺激時，會分化為促炎亞型（M1 巨噬細胞），或抗炎和組織修復亞型（M2 巨噬細胞），把這種分化的現(xiàn)象叫交替激活。M1 和M2 細胞在細胞表面受體、細胞和趨化因子的分布不同，并在炎癥反應中的效應作用相反[28]。當細胞受到一定的刺激時，M1 巨噬細胞表現(xiàn)出促炎作用、釋放NO 和ROS 及增強微生物和殺瘤活性。與此相反，M2 巨噬細胞則表現(xiàn)出免疫抑制活性。在試驗中，將海帶多糖作用于細胞，發(fā)現(xiàn)其可促使細胞釋放NO 和ROS。這可能是因為添加海帶多糖對巨噬細胞產(chǎn)生一定的刺激，分化為M1 巨噬細胞，從而使NO、ROS 的釋放量增大。因此，推測海帶多糖可以活化巨噬細胞，使其分化為M1 巨噬細胞，從而產(chǎn)生促炎的作用。

3 結(jié)論

通過超聲輔助法提取海帶多糖，采用響應面試驗得到最優(yōu)條件為料液比1∶64（mg∶mL），提取溫度68 ℃，超聲功率89 W，在此工藝條件下，海帶多糖的得率為17.73%。將最優(yōu)條件下提取的海帶多糖用于巨噬細胞的培養(yǎng)，結(jié)果表明海帶多糖對巨噬細胞無黏附作用。由原來的圓形或者橢圓形分化為典型的梭狀，且會出現(xiàn)一定程度的濃度依賴性。通過海帶多糖的刺激，可以使巨噬細胞顯著釋放炎癥因子NO 和ROS。因此，可推測海帶多糖可以活化巨噬細胞，使其分化為M1 巨噬細胞，從而產(chǎn)生促炎的作用。