云耳菌株“百云6號(hào)”菌絲體對(duì)外源硒的耐受性研究*

李發(fā)盛，黃雪星**，歐 娜，何達(dá)崇，周 興，曾維銘，羅先群

（1.廣西科學(xué)院生物研究所，廣西 南寧 530003；2.廣西科學(xué)院，廣西 南寧 530003）

硒（Se）是一種非金屬元素，是人體不可缺少的微量元素之一，在人體各項(xiàng)生理功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，硒具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、預(yù)防心血管疾病、抗病毒、抗衰老、抗癌等作用，攝入適量的硒對(duì)人體健康有著非常積極的作用，而缺硒會(huì)對(duì)人體重要器官功能產(chǎn)生影響，導(dǎo)致疾病的發(fā)生[1-3]。

食（藥）用菌是良好的硒生物轉(zhuǎn)化載體，能夠?qū)h(huán)境中的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為安全高效的有機(jī)硒[4]，且食用菌含有豐富的蛋白質(zhì)和多種營養(yǎng)元素，具有很大的應(yīng)用潛力。不同濃度、不同形態(tài)的外源硒對(duì)食用菌生長及品質(zhì)具有一定影響[4，9]。不同食（藥） 用菌品種對(duì)硒的忍耐性和富集能力均有差別[4-5]。

廣西所產(chǎn)黑木耳，俗稱云耳（Auricularia auricula-judae），云耳是廣西著名特產(chǎn)，因品質(zhì)好而遠(yuǎn)銷海內(nèi)外。通過以云耳為試驗(yàn)材料，研究云耳菌絲體對(duì)硒的敏感度及耐受能力，為進(jìn)一步探究其菌絲體和子實(shí)體富硒能力提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

經(jīng)過自然選育獲得的廣西本土優(yōu)良云耳菌株百云6號(hào)，已通過國家新品種認(rèn)定，由廣西科學(xué)院生物研究所保藏。

1.2 供試培養(yǎng)基、主要試劑和儀器

平板培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、VB10.01 g、瓊脂粉15 g，自來水1 000 mL，pH自然。

固體培養(yǎng)基：桑枝屑50%、雜木屑40%、麩皮8%、石灰粉1%、石膏粉1%，料液比為1∶1.5，滅菌前pH為8.0～8.5，其中桑枝屑和雜木屑需經(jīng)40目篩粉化處理。

主要試劑：外源硒化學(xué)純（Na2SeO3），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

主要儀器：電子分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司；高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；數(shù)顯游標(biāo)卡尺，上海量刃工具有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 平板培養(yǎng)法測(cè)定硒對(duì)云耳菌株百云6號(hào)菌絲生長的影響

準(zhǔn)確配制Na2SeO3添加液的濃度分別為0、10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、60 mg·L-1、80 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1、400 mg·L-1、500 mg·L-1、1 000 mg·L-1的平板培養(yǎng)基 （對(duì)應(yīng)硒濃度依次分別為 0、4.43 mg·L-1、8.86 mg·L-1、17.71 mg·L-1、26.58 mg·L-1、35.43 mg·L-1、44.29 mg·L-1、66.44 mg·L-1、88.58 mg·L-1、132.87 mg·L-1、177.16 mg·L-1、221.45 mg·L-1、442.90 mg·L-1）。121℃滅菌20 min后，趁熱分別注入經(jīng)滅菌并烘干的培養(yǎng)皿（直徑9 cm）內(nèi)，每皿約25 mL。冷卻凝固后，于超凈臺(tái)內(nèi)按無菌操作接入經(jīng)常規(guī)活化的、等量的菌株百云6號(hào)菌塊，每個(gè)梯度濃度重復(fù)3皿。接好種的平板于25℃倒置避光培養(yǎng)。當(dāng)所有供試平板中任意一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)菌絲基本長滿時(shí)停止培養(yǎng)，取出所有平板，用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄整個(gè)菌落的直徑，對(duì)菌絲的生長勢(shì)及菌落形態(tài)特征進(jìn)行觀察判斷。計(jì)算菌絲的生長速度和抑制率，采用SPSS 17.0軟件對(duì)菌絲生長速度進(jìn)行差異顯著性分析。

1.3.2 計(jì)算方法

平板法菌絲生長速度（V，mm·d-1）的計(jì)算公式為：

式中：R為菌絲長度（mm）；D為菌絲生長天數(shù)（d）。

固體栽培法菌絲生長速度（V，mm·d-1）的計(jì)算公式為：

式中：S為菌絲長度（mm）；D為菌絲生長天數(shù)（d）。

菌絲生長抑制率（A，%）的計(jì)算公式[6]為：

式中：V0為CK組菌絲平均生長速度（mm·d-1）；Vt為各濃度菌絲平均生長速度（mm·d-1）。

1.3.3 固體培養(yǎng)法測(cè)定硒對(duì)云耳菌株百云6號(hào)菌絲生長的影響

準(zhǔn)確配制 Na2SeO3濃度分別為 0、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1、60 mg·kg-1、80 mg·kg-1、100 mg·kg-1、150 mg·kg-1、200 mg·kg-1、300 mg·kg-1、400 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1的固體培養(yǎng)基（對(duì)應(yīng)的硒濃度分別為0、4.43 mg·kg-1、8.86 mg·kg-1、17.71 mg·kg-1、26.58 mg·kg-1、35.43 mg·kg-1、44.29 mg·kg-1、66.44 mg·kg-1、88.58 mg·kg-1、132.87 mg·kg-1、177.16 mg·kg-1、221.45 mg·kg-1、442.90 mg·kg-1）。每個(gè)濃度準(zhǔn)備干料1 000 g，當(dāng)天17:00分別于塑料盆內(nèi)拌料、建堆，潤料過夜。第2天上午8:00充分拌料均勻后，用12 cm×26 cm×0.05 cm菌袋分裝，每個(gè)濃度等量均分為5袋。料面高度誤差不超過0.3 cm，以確保培養(yǎng)料松緊度的一致性。菌包經(jīng)0.16 MPa滅菌2.5 h。冷卻后，于超凈臺(tái)內(nèi)按常規(guī)無菌操作接固體原種在料面上，并于25℃恒溫避光培養(yǎng)。當(dāng)生長最慢的菌包內(nèi)的菌絲生長長度達(dá)0.5 cm時(shí)，即同時(shí)于所有供試菌包中菌絲生長的前端劃線，作為菌絲生長速度的起始點(diǎn)，繼續(xù)培養(yǎng)。直到生長最快的菌包的菌絲基本長滿時(shí)（40 d），用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄菌絲生長長度，對(duì)菌絲的生長勢(shì)及生理變化進(jìn)行觀察描述。按1.3.2的公式計(jì)算菌絲的生長速度和抑制率，采用SPSS 17.0軟件對(duì)菌絲生長速度進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板培養(yǎng)法測(cè)定硒對(duì)云耳菌株百云6號(hào)菌絲生長的影響結(jié)果分析

2.1.1 不同硒濃度對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲菌落形態(tài)特征影響

采用平板法研究不同硒濃度對(duì)云耳菌株百云6號(hào)菌絲體菌落形態(tài)特征的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 不同硒濃度對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲體生長的影響Fig.1 Effect of different selenium concentrations on the mycelia growth of Baiyun No.6

從圖1可以看出，外源硒濃度在0～88.58 mg·L-1時(shí)，接種菌塊的菌絲恢復(fù)生長較快，菌絲生長粗壯有力、潔白、整齊、濃密，菌苔厚實(shí)，氣生菌絲粗、短，菌落邊緣完整。外源硒濃度為88.58 mg·L-1～132.87 mg·L-1時(shí)，接種菌塊的菌絲恢復(fù)生長變慢，菌絲體逐漸變得細(xì)弱無力，色澤變淺，氣生菌絲少而弱，菌落邊緣不整齊。外源硒濃度達(dá)到442.90 mg·L-1時(shí)，云耳菌株百云6號(hào)菌絲體雖然還可以生長，但已受到強(qiáng)烈抑制。

2.1.2 硒對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲生長速度影響

采用平板法研究不同硒濃度對(duì)云耳菌株百云6號(hào)菌絲體生長速度的影響，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同硒濃度對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲體生長的影響Tab.1 Effect of different selenium concentrations on the mycelia growth of Baiyun No.6

從表1可以看出，菌絲體生長速度受外源硒影響較大。隨著硒濃度的升高，菌絲平均生長速度先加快，后減慢。當(dāng)外源硒濃度≤35.43 mg·L-1時(shí)，對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲生長速度有促進(jìn)作用。與對(duì)照（CK）相比，外源硒濃度為8.86 mg·L-1時(shí)，菌絲平均生長速度的增加率（抑制率為負(fù)數(shù)的表示增加率）達(dá)到最大，為2.02%，但沒有顯著性差異；當(dāng)外源硒濃度≥44.29 mg·L-1時(shí)，菌株百云6號(hào)菌絲生長開始受到抑制。相對(duì)對(duì)照（CK） 而言，外源硒的濃度在44.29 mg·L-1～88.58 mg·L-1時(shí)菌絲平均生長速度雖然受到抑制，但菌絲長勢(shì)卻沒有明顯差別；外源硒濃度達(dá)132.87 mg·L-1時(shí)，菌絲平均生長速度明顯受到抑制，抑制率達(dá)33.16%，同時(shí)菌絲長勢(shì)也明顯變?nèi)?；外源硒濃度達(dá)到442.90 mg·L-1時(shí)，菌株百云6號(hào)菌絲生長受到強(qiáng)烈抑制，抑制率達(dá)69.06%，菌絲長勢(shì)更弱。

2.2 固體培養(yǎng)法測(cè)定硒對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲生長的影響結(jié)果分析

2.2.1 不同硒濃度對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲生理變化影響

采用固體培養(yǎng)法，不同硒濃度對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲生理變化影響試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 不同硒濃度對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲體生長的影響Fig.2 Effect of different selenium concentrations on the mycelia growth of Baiyun No.6

由圖2可看出，外源硒濃度在0～442.90 mg·kg-1時(shí)菌絲均能正常生長，但隨外源硒濃度由低到高，菌絲體在生理方面產(chǎn)生明顯變化，主要表現(xiàn)在：當(dāng)外源硒濃度達(dá)到88.58 mg·kg-1時(shí)出現(xiàn)條狀（索狀）菌絲，隨著外源硒濃度進(jìn)一步增加，條狀（索狀）菌絲越來越明顯，其數(shù)量也越來越多；產(chǎn)生的黃水越來越多；外源硒濃度在0～66.44 mg·kg-1時(shí)菌絲扭結(jié)形成的耳芽數(shù)量較多，沒有顯著差異，外源硒濃度≥88.58 mg·kg-1時(shí)，菌絲扭結(jié)形成的耳芽數(shù)量明顯減少，當(dāng)外源硒濃度達(dá)到442.90 mg·kg-1時(shí)，菌絲已不能扭結(jié)形成耳芽。由此說明，這些生理變化與外源硒的脅迫作用有直接關(guān)系。

2.2.2 不同硒濃度對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲生長速度影響

采用固體培養(yǎng)法研究不同硒濃度對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲生長速度的影響，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 不同硒濃度對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲體生長的影響Tab.2 Effect of different selenium concentrations on the mycelia growth of Baiyun No.6 strain

從表2可以看出，隨外源硒濃度的升高，菌絲平均生長速度呈現(xiàn)逐步加快至最高，之后逐步減慢的過程。當(dāng)外源硒濃度≤66.44 mg·kg-1時(shí)，其對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲生長速度有促進(jìn)作用，菌絲體更為粗壯有力。與對(duì)照（CK） 相比，外源硒濃度為35.43 mg·kg-1時(shí)，菌株百云6號(hào)菌絲平均生長速度的增加率達(dá)到最大，為6.51%，且具有極顯著差異性。當(dāng)外源硒濃度≥88.58 mg·kg-1時(shí)，菌株百云6號(hào)菌絲生長速度開始受到抑制，但不明顯，不過菌絲體的生理變化卻非常明顯，如黃水增多、條狀菌絲明顯、耳芽減少等，直至外源硒濃度達(dá)到442.90 mg·kg-1時(shí)，菌絲生長速度受抑制率卻只有9.25%，但菌絲已不能扭結(jié)形成耳芽。

2.3 平板法和固體法外源硒對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲生長影響對(duì)比分析

2種培養(yǎng)方法的外源硒對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲生長影響的主要節(jié)點(diǎn)相關(guān)數(shù)據(jù)見表3。

表3 外源硒對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲生長影響節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)Tab.3 Nodal data on the effect of exogenous selenium on mycelia growth of Baiyun No.6

從表3數(shù)據(jù)可以看出，2種培養(yǎng)方法的外源硒對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲生長影響濃度有較大區(qū)別，其中固體培養(yǎng)法外源硒對(duì)菌絲生長最大促進(jìn)的硒濃度、最大生長速度增加率的硒濃度、最大生長速度增加率、最小抑制率的硒濃度、最大抑制率分別是平板培養(yǎng)法的1.88倍、4.00倍、2.61倍、2.00倍、0.13倍，充分說明固體培養(yǎng)法外源硒對(duì)菌絲生長的影響度比平板培養(yǎng)法要小很多，與吉清妹等[7]的研究亞硒酸鈉對(duì)靈芝生長及富硒效應(yīng)的影響，說明亞硒酸鈉對(duì)靈芝的抑制作用在木屑培養(yǎng)基中明顯比在PDA固體平板培養(yǎng)基上小的結(jié)論一致。究其原因，應(yīng)與培養(yǎng)基質(zhì)的不同有直接關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

通過在平板培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法的2種培養(yǎng)基質(zhì)中添加外源硒對(duì)菌株百云6號(hào)菌絲生長影響試驗(yàn)結(jié)果說明，其菌絲體具有很強(qiáng)的耐硒能力，且于2種培養(yǎng)基質(zhì)中表現(xiàn)出來的抑制率差別較大。當(dāng)外源硒濃度≤35.43 mg·L-1（平板法） 和 66.44 mg·kg-1（固體法）對(duì)菌絲生長均有促進(jìn)作用，菌絲體相對(duì)對(duì)照（CK） 更加粗壯有力；當(dāng)外源硒的濃度≥44.29 mg·L-1（平板法） 和 88.58 mg·kg-1（固體法） 時(shí)，對(duì)菌絲生長有抑制作用，抑制率為8.70%（平板法）和0.68%（固體法），之后隨硒濃度升高，抑制程度和抑制率隨之提高，當(dāng)外源硒的濃度達(dá)到442.90 mg·kg-1時(shí)，平板培養(yǎng)法的菌絲生長已受到嚴(yán)重抑制，抑制率達(dá)到69.06%，而固體培養(yǎng)法的菌絲生長受到的抑制程度不大，抑制率只有9.52%，但是，菌絲體的生理變化卻非常明顯，主要是形成的條狀（索狀）菌絲十分明顯且數(shù)量多，更為重要的是菌絲體不能扭結(jié)形成耳芽，說明菌絲已經(jīng)不能由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)化為生殖生長。試驗(yàn)結(jié)果對(duì)菌株百云6號(hào)的菌絲體和子實(shí)體富硒的進(jìn)一步研究提供十分有價(jià)值的科學(xué)依據(jù)。

食（藥）用菌品種不同，其菌絲體對(duì)外源硒的敏感度和忍耐力都會(huì)有所不同，甚至差異較大。吳周斌等[6]關(guān)于真姬菇菌絲體對(duì)硒耐受性的研究發(fā)現(xiàn)，硒濃度≤50 mg·L-1時(shí)對(duì)真姬菇菌絲生長有促進(jìn)作用，硒濃度≥75 mg·L-1時(shí)有抑制作用，真姬菇菌絲對(duì)硒最大耐受濃度為 150 mg·L-1～200 mg·L-1。吉清妹等[7]研究亞硒酸鈉對(duì)靈芝生長及富硒效應(yīng)的影響表明，濃度為 0.1 g·kg-1～0.8 g·kg-1的亞硒酸鈉對(duì)4種靈芝的生長速度、子實(shí)體的生物量均有抑制作用，且隨著濃度的增大而有所加強(qiáng)。宋飛飛等[8]關(guān)于無機(jī)硒對(duì)桑黃（SH623）菌株菌絲生長影響的研究結(jié)果表明，外源硒濃度≤18.63 mg·L-1時(shí)，其對(duì)桑黃菌株菌絲的生長速度影響不顯著，當(dāng)外源硒濃度≥37.25 mg·L-1時(shí)，桑黃菌株菌絲生長速度受到顯著的抑制，抑制率達(dá)到45.86%，SH623菌株對(duì)硒的最大耐受濃度約為298.00 mg·L-1。裴冰倩等[9]關(guān)于有機(jī)硒與無機(jī)硒對(duì)榆黃蘑菌絲生長的影響研究，結(jié)果表明硒濃度為0.05 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、5.00 mg·L-1時(shí)均對(duì)榆黃蘑菌絲生長有不同程度的抑制。梁英等[10]對(duì)黑木耳富硒栽培研究的結(jié)果表明，當(dāng)硒濃度≤80 mg·kg-1時(shí)，促進(jìn)黑木耳菌絲的生長，硒濃度≥80 mg·kg-1時(shí)會(huì)抑制黑木耳菌絲的生長。因此，對(duì)不同食（藥）用菌品種進(jìn)行耐硒研究均有意義。

同一食用菌品種，在不同培養(yǎng)基質(zhì)中添加外源硒，其菌絲體對(duì)硒的敏感度和忍耐力也是不同的。本試驗(yàn)結(jié)果和吉清妹等[7]的研究已經(jīng)證明，這與培養(yǎng)基質(zhì)所含成分及基質(zhì)的物理性狀等有直接關(guān)系，至于其機(jī)理究竟如何，尚待進(jìn)一步探討。