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    小灣庫區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性與水質(zhì)狀況分析

    2023-04-29 21:17:39吳嘉偉譚鳳霞祁梅張瀟峮何杰秋吳澤成張峰柴毅
    水生態(tài)學(xué)雜志 2023年6期
    關(guān)鍵詞:微生物群落高通量測序環(huán)境因子

    吳嘉偉 譚鳳霞 祁梅 張瀟峮 何杰秋 吳澤成 張峰 柴毅

    摘要:為了解小灣庫區(qū)不同水域的微生物多樣性及微生物群落與生態(tài)環(huán)境的關(guān)系,2019年在庫區(qū)選取6個采樣點(W1~W6),通過16S rDNA基因擴增和高通量測序,分析庫區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)組成與多樣性差異及水質(zhì)狀況。結(jié)果顯示,小灣庫區(qū)水體整體呈偏堿性,COD含量為14.79~24.47 mg/L,TN濃度為0.53~2.39 mg/L,TP濃度為0.14~1.17 mg/L。不同采樣點的微生物Chao1指數(shù)、覆蓋率均較高,Shannon指數(shù)為3.42~4.48,Simpson指數(shù)為0.030~0.092,反映出各采樣點微生物群落多樣性豐富,其中群落豐富度以W6區(qū)域最高。各采樣點的微生物主要有變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和綠彎菌門(Chloroflexi),豐度之和達(dá)90%以上,以變形菌門為優(yōu)勢菌;在屬水平上,以不動桿菌屬(Acinetobacter)為第一優(yōu)勢菌屬。PCoA分析發(fā)現(xiàn),W5和W6聚為一類,W1~W4聚為另一類,并具有顯著差異。研究表明,小灣庫區(qū)水質(zhì)整體良好,但部分區(qū)域已出現(xiàn)富營養(yǎng)化現(xiàn)象,且有擴散趨勢,需采取環(huán)境治理措施。建議通過合理放養(yǎng)、適度捕撈的方式充分利用水域天然餌料資源,在保證小灣庫區(qū)正常水力發(fā)電的前提下,適度開發(fā)庫區(qū)漁業(yè)資源。

    關(guān)鍵詞:微生物群落;高通量測序;多樣性分析;環(huán)境因子;小灣庫區(qū)

    中圖分類號:Q938.1,X524? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A? ? ? ? 文章編號:1674-3075(2023)06-0122-06

    小灣水庫位于云南臨滄市與大理白族自治區(qū)和保山市交界處,是瀾滄江中下游河段段梯級水電規(guī)劃中的龍頭電站,也是我國“西電東送”的主力電源之一;水庫正常蓄水水位1 240 m,總面積189.1 km2,總庫容151 億m3。大型水利工程修建之后,水生態(tài)系統(tǒng)格局一般都會發(fā)生巨大變化,包括環(huán)境格局和生物格局,如三峽大壩修建以來,許多庫灣和支流均暴發(fā)了不同程度的水華(蔡慶華和胡征宇,2006)以及重金屬污染事件(張代均等,2005);丹江口庫區(qū)也長期存在嚴(yán)重的總氮污染(朱艷容等,2020),極易引起水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題。

    微生物群落是水生態(tài)系統(tǒng)化學(xué)循環(huán)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu),其群落豐度和多樣性直接受水環(huán)境影響,能在一定程度上反映水生態(tài)系統(tǒng)的健康情況(錢瑋等,2018),因此對微生物群落豐度及多樣性研究與評價非常重要。目前,關(guān)于小灣水庫的研究多集中于地質(zhì)分析及水體變化等方面,而針對庫區(qū)水質(zhì)及水生態(tài)系統(tǒng)的研究僅見水生生物相關(guān)調(diào)查(何琳劍等,2020),鮮見有關(guān)水體微生物的研究。高通量測序技術(shù)因其測序快速、測序通量高,且可對多樣品的多個可變區(qū)同時測序,近年來常用于水體微生物群落分析(Langille et al, 2013;Yuan et al, 2014)。本研究通過16S rRNA高通量測序技術(shù),對小灣庫區(qū)水體微生物群落特征及多樣性進(jìn)行分析,旨在為環(huán)境監(jiān)測和水生態(tài)系統(tǒng)評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1? ?材料與方法

    1.1? ?樣點設(shè)置及水樣采集

    項目組于2019年7月采集小灣庫區(qū)水樣,根據(jù)庫區(qū)及周邊的地形特征,分別在瀾滄江干流和黑惠江支流自上游至下游設(shè)置了6個采樣點,樣點具體信息見表1及圖1。根據(jù)樣點水深不同分3個采樣層次:水深<1 m,取樣點距水面≥0.3 m、距河底≥0.3 m;水深1~5 m,在水面下0.5 m處取樣;水深>5 m,在水面下0.5 m水深處及距河底0.5 m處分別取樣。使用HQM-1型有機玻璃采水器在每個采樣點采水1 L。測定各項水質(zhì)指標(biāo)后,加入10~15 mL魯哥氏液固定。

    1.2? ?水質(zhì)指標(biāo)測定

    采用便攜式pH計現(xiàn)場測定水溫(WT)及pH值,塞氏盤法測定透明度(SD)。溶解氧(DO)、化學(xué)需氧量(COD)、總氮(TN)和總磷(TP)等水質(zhì)指標(biāo),通過多參數(shù)水質(zhì)分析儀(HQ40D,Hach Loveland, USA)現(xiàn)場測定。

    1.3? ?基因組DNA提取與PCR擴增

    水樣進(jìn)行微生物采集后,使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit試劑盒(Omega Bio-tek, USA)提取水樣微生物總DNA,然后使用Nano Drop Lite微量核酸檢測儀進(jìn)行濃度測定。對微生物16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴增,使用通用引物:515F:5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'和907R:5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'。

    對PCR產(chǎn)物采用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)在Promega QuantiFluor上進(jìn)行文庫定量,合格PCR產(chǎn)物濃度在2 nmol/L以上。

    1.4? ?測序及數(shù)據(jù)分析

    將合格PCR產(chǎn)物按照樣本測序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。使用Illumina PE250測序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測序,得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接,同時質(zhì)控和過濾序列質(zhì)量,區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類和物種分類?;贠TU聚類結(jié)果,計算ɑ-多樣性(Chao1,覆蓋率,Shannon,Simpson);多樣性以及PCoA聚類均使用QIIME流程。

    2? ?結(jié)果

    2.1? ?水質(zhì)理化指標(biāo)

    環(huán)境指標(biāo)分析檢測結(jié)果(表2)表明,小灣庫區(qū)各采樣點水溫差異不明顯;pH均值為8.41,水質(zhì)呈偏堿性;W1~W4區(qū)域的水體透明度較高,SD≥110 cm;各采樣點DO含量較高,均值達(dá)9.24 mg/L。COD含量差異不大,在14.79~24.47 mg/L,W5相對含量較低;TN濃度在0.53~2.39 mg/L,最高值在W6,最低值在W1;TP濃度在0.14~1.17 mg/L,整體含量較高,最高值在W6,最低值在W1。

    2.2? ?微生物群落ɑ-多樣性

    使用Illumina PE250測序,獲得細(xì)菌序列總數(shù)為276 405,總堿基數(shù)為103 973 473 bp,平均長度為376.16 bp,其中99.91%分布于351~400 bp。ɑ-多樣性指數(shù)可以反映出樣本內(nèi)的微生物群落多樣性。Chao1指數(shù)用于物種總數(shù)評價,其值越高,則說明微生物豐富度越高。由表3可以看出,小灣庫區(qū)整體微生物群落豐富度較高,其中W6區(qū)域微生物豐富度最高,W4的豐富度最低。覆蓋率代表測序?qū)ξ锓N的覆蓋度,表3中覆蓋率均大于99%,說明樣本測序結(jié)果可以反映樣品的真實情況。Shannon指數(shù)為3.42~4.48,Simpson指數(shù)為0.030~0.092,差異較大。這兩項指標(biāo)通常都可用來評價微生物群落多樣性,其指數(shù)均反映W6區(qū)域的微生物多樣性最高,W5最低。稀釋曲線(圖2)基本趨于平緩,也反映出測序深度達(dá)到要求,可信度較高。

    2.3? ?微生物群落結(jié)構(gòu)特征

    小灣庫區(qū)微生物序列主要分布于8個菌門(圖3)。其中,變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和綠彎菌門(Chloroflexi)之和在前5種樣品中可達(dá)90%以上,較為特殊的是W6樣品中浮霉菌門(Planctomycetes)較多,為第二優(yōu)勢菌,豐度高達(dá)19.96%;但在其他采樣點,該菌含量均較低。各采樣點中,藍(lán)細(xì)菌門為采樣點W1、W2、W4和W5的第一優(yōu)勢門類,占全細(xì)菌群落的37.49%~43.50%;變形菌門在W3和W6的第一優(yōu)勢門類,占全細(xì)菌群落的48.31%~55.30%。其他被檢測到的主要優(yōu)勢菌門還有厚壁菌門(Firmicutes)。

    2.4? ?微生物分類Heatmap圖譜

    根據(jù)測序結(jié)果和注釋OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本間豐度和相似性聚類,構(gòu)建小灣庫區(qū)微生物屬層次的物種分類Heatmap圖譜(圖4),以顏色梯度變化表現(xiàn)豐度值的高低。不動桿菌屬(Acinetobacter)的豐度最高,其次為未分類的Chloroplast_norank,再依次為原綠絲藍(lán)細(xì)菌屬(Prochlorothrix)、細(xì)鞘絲藻亞科未鑒定菌種(Leptolyngbyaceae_uncultured)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)和藍(lán)菌屬(Cyanobium)。

    2.5? ?樣品PCoA聚類分析

    基于Weighted unifrac距離的PCoA分析,比對個樣本間相似性,結(jié)果如圖5所示。PC1貢獻(xiàn)度為44.96%,PC2貢獻(xiàn)度為13.49%。從圖5可以看出,W5、W6樣品聚為一類,而W1~W4樣品聚為另一類,且兩類有顯著差異。

    3? ?討論

    3.1? ?小灣庫區(qū)各采樣點的水質(zhì)差異及其成因

    本次研究結(jié)果表明,小灣庫區(qū)水體溶氧整體較高,說明水體具備較強自凈能力(Tao et al, 2015)。水體中各類浮游植物對pH反應(yīng)敏感(丁蕾和支崇遠(yuǎn),2006),豐富的TN、TP也會造成浮游植物大量繁殖(況琪軍等,2000;董旭輝等,2004)。分析發(fā)現(xiàn)小灣庫區(qū)整體呈堿性,W5和W6較其他區(qū)域水質(zhì)更偏堿性,且TN和TP含量也相對偏高,適合微生物和浮游植物大量繁殖,進(jìn)而導(dǎo)致這2個區(qū)域的水體透明度較低;此結(jié)果也與何琳劍等(2020)對小灣庫區(qū)水生生物的調(diào)查結(jié)果類似。W6的pH、DO、TN、TP指標(biāo)較高,推測其原因是流域梯級水電站開發(fā)改變了江河的水文水力特性,水體流速變慢,水位升高,且靠近水電站的區(qū)域所受影響更加明顯(蔡慶華和胡征宇,2006;傅一迪和趙玉新,2011);W6在瀾滄江流域下游,最接近壩區(qū),因此水域湖庫化程度最高,加速了營養(yǎng)物質(zhì)的堆積速率,該水域各項水質(zhì)指標(biāo)明顯高于其他采樣水域也符合這一規(guī)律。

    3.2? ?微生物群落結(jié)構(gòu)反映小灣庫區(qū)的富營養(yǎng)狀態(tài)

    ɑ-多樣性指數(shù)是反映微生物多樣性的綜合指標(biāo)。本次研究發(fā)現(xiàn),小灣庫區(qū)各采樣點豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均較高,且差異不大,可見小灣庫區(qū)為微生物繁殖生存提供了適宜環(huán)境,且微生物分布均勻。W6區(qū)域的Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)最高,而Shannon指數(shù)最低,說明W6水域微生物豐富度和多樣性均為最高;從水質(zhì)分析結(jié)果也可看出,該水域的富營養(yǎng)化程度較高,更有利于微生物的大量繁殖(張瑜斌等,2012)。

    高通量測序發(fā)現(xiàn),小灣庫區(qū)各水域微生物群落組成結(jié)構(gòu)相似,優(yōu)勢菌門主要有變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門、放線菌門、擬桿菌門和綠彎菌門,這些均為典型淡水細(xì)菌門類,與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似(Bart et al, 2009;Parfenova et al, 2013;劉亞軍等,2019)。變形菌門是水環(huán)境中普遍存在的一種原核生物,雖然從總體生物量看,變形菌門在小灣庫區(qū)以第一優(yōu)勢門存在,但在多個采樣水域,藍(lán)細(xì)菌門均為優(yōu)勢菌門。Shu等(2011)研究表明,庫區(qū)水體出現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌廣泛分布的狀況,大多是由于水體流動性變差,浮游植物大量繁殖,使水體溶氧增高、營養(yǎng)物質(zhì)快速沉積所致,而藍(lán)細(xì)菌作為水生態(tài)環(huán)境的指示物種,其大量分布也說明水體已處在富營養(yǎng)化進(jìn)程中,水體TN、TP含量較高(Yan et al, 2017;Spring et al, 2000;Wakana et al, 2020)。但所調(diào)查水域未見厭氧性厚壁菌大量繁殖,說明尚未有工業(yè)、生活廢水排污等情況出現(xiàn)(Amarja et al, 2008)。Niftrik等(2009)研究發(fā)現(xiàn),浮霉菌為好氧菌,而浮霉菌門的大量繁殖則對溶氧、pH、總氮、總磷等環(huán)境因子有較高要求(李紅曉等,2016;Spring et al, 2018),W6區(qū)域浮霉菌門為第二優(yōu)勢菌,與該區(qū)域各項水質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性較高。

    PCoA分析表明,W5與W6聚為一類,W1~W4聚為一類。環(huán)境微生物多樣性反映群落生態(tài)組成的主要特征,也是環(huán)境優(yōu)劣評估的重要指標(biāo)(李紅曉等,2016)。W6區(qū)域?qū)儆跒憸娼掠谓?;此次調(diào)查結(jié)果表明,該區(qū)域水體已處于富營養(yǎng)化進(jìn)程中,而W5區(qū)域?qū)儆诤诨萁Я飨掠谓危琖5與W6聚為一類,說明水體富營養(yǎng)化狀況已呈擴散趨勢,需對瀾滄江下游水域采取水質(zhì)管控措施。

    3.3? ?發(fā)展生態(tài)漁業(yè)可有效控制小灣庫區(qū)富營養(yǎng)化

    除2個下游江段外,小灣庫區(qū)整體水質(zhì)較好,溶氧充分,氮磷營養(yǎng)鹽水平為中等偏高。本次調(diào)查中未見小灣庫區(qū)的規(guī)?;瘽O業(yè)養(yǎng)殖,但檢測結(jié)果表明,小灣庫區(qū)整體COD含量較低,水體初級生產(chǎn)力充足(何琳劍等,2020),說明具備養(yǎng)殖業(yè)開發(fā)潛力(Shinichi et al, 2004)。鑒于小灣庫區(qū)多處水體有富營養(yǎng)化趨勢,而已有研究表明(Guo et al, 2015),適量放養(yǎng)草食性和濾食性魚類,是控制浮游植物密度、調(diào)控水體微生物群落結(jié)構(gòu)、減緩水體富營養(yǎng)化的重要途徑之一(王宇庭等,2017)。因此,建議通過合理放養(yǎng)、適度捕撈的方式,充分利用水域天然餌料資源,在保證小灣庫區(qū)水力正常發(fā)電的前提下,可適度發(fā)展生態(tài)漁業(yè)。小灣庫區(qū)的浮游植物、浮游動物及魚類資源組成及其漁產(chǎn)力的合理評價,尚有待后期深入研究。

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    (責(zé)任編輯? ?萬月華)

    Microbial Community Diversity and Analysis of Water Quality Status

    in Xiaowan Reservoir

    WU Jia‐wei1,2, TAN Feng‐xia1,2, QI Mei2, ZHANG Xiao‐qun3, HE Jie‐qiu4,

    WU Ze‐cheng4, ZHANG Feng4, CHAI Yi1,2,

    (1. Hubei Key Laboratory of Waterlogging Disaster and Agricultural Use of Wetland ,

    Yangtze University, Jingzhou? ?434025, P.R. China;

    2. College of Animal Science, Yangtze University, Jingzhou? ?434025, P.R. China;

    3. Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan? ?430223, P.R. China;

    4. Yunnan Xiaowan Ecological Fishery Co. Ltd., Fengqing? ?677000, P.R. China)

    Abstract: Xiaowan reservoir is located in the middle-lower reaches of Lancang River. In this study, we explored the microbial diversity of different waters in the Xiaowan reservoir area and analyzed the relationship of the microbial community with the local ecological environment. Our aim was to provide basic environmental monitoring data for aquatic ecosystem evaluation. Water samples were collected at six sampling sites (W1-W6) during 2019 in Xiaowan reservoir, along the main stem of Lancang River and one tributary, Heihui River. Gene amplification of 16S rDNA and high-throughput sequencing were used to analyze the structural composition, diversity differences of the microbial communities and water quality in the reservoir area. The water in Xiaowan reservoir was alkaline, high oxygen levels, a COD range of 14.79-24.47 mg/L, TN range of 0.53-2.39 mg/L and TP range of 0.14-1.17 mg/L. The Chao1 indices and coverage rates of the microbial communities at different sampling sites were high, and the Shannon and Simpson indices were in the range of 3.42-4.48 and 0.030-0.092, respectively, indicating that the diversity of microbial community in the Xiaowan reservoir area was rich, and highest at the W6 site. The microbial community primarily consisted of Proteobacteria, Cyanobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes and Chloroflexi, accounting for more than 90% of the total abundance, and Acinetobacter was the most dominant group at the genus level. Proteobacteria was the most dominant taxon at W3 and W6, accounting for 48.31% -55.30%? of the total abundance at both sites. Cyanobacteria was the most dominant taxon at W1, W2, W4 and W5, accounting for 37.49%-43.50%? of the total abundance at these sites. Principal Component Analysis (PCoA) shows that the microbial communities at W5 and W6 were clustered into a single group, while the microbial communities at W1, W2, W3 and W4 were clustered into another significantly different group. The overall water quality of Xiaowan reservoir was good, but eutrophication has occurred in some areas and is tending to spread. Therefore, prevention and control measures should be taken immediately, and environmental monitoring should be carried regularly out in Xiaowan reservoir. We also suggest moderate development of the fishery resource with appropriate fish release and fishing to make use of the natural small fish resources in the investigated area.

    Key words:microbial community structure; high-throughput sequencing; diversity analysis; environmental factors; Xiaowan reservoir area

    收稿日期:2020-08-22? ? ? 修回日期:2023-06-15

    基金項目:長江大學(xué)濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開放基金(KF202006);瀾滄江小灣庫區(qū)生態(tài)漁業(yè)發(fā)展規(guī)劃項目(云南小灣生態(tài)漁業(yè)有限公司,2017)。

    作者簡介:吳嘉偉,1996年生,男,碩士研究生,研究方向為水域生態(tài)學(xué)。E-mail: 1609991711@qq.com

    通信作者:柴毅,1978年生,女,副教授,主要從事水生生物學(xué)研究。E-mail: chaiyi123456@126.com

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