三江并流區(qū)瀾滄江干流捕食線蟲真菌的水陸分布模式探究

張欣　張發(fā)　鄧巍　楊曉燕　李娜　肖文

摘要：為研究三江并流區(qū)瀾滄江干流水、陸生境中的捕食線蟲真菌（Nematode-Trapping Fungi，NTF）多樣性分布差異，在該區(qū)域布設(shè)9個采樣區(qū)對NTF進(jìn)行調(diào)查，并分析NTF在瀾滄江流域不同空間尺度下的水陸分布模式。每個樣區(qū)設(shè)置水、陸對稱采樣點(diǎn)各5個，每個采樣點(diǎn)用5點(diǎn)法采集水、陸樣品各1份，共采集90份樣品。采用單孢子挑離法獲得NTF純培養(yǎng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定物種。共獲得2屬13種76株NTF，其中陸生土壤中檢出2屬11種49株，水體底泥中檢出1屬6種27株。結(jié)果顯示，NTF物種組成在三江并流區(qū)瀾滄江干流水、陸生境間存在較大差異，具有水陸異質(zhì)性分布模式，干流陸地上具有比水生環(huán)境中更高的物種檢出率和物種多樣性；此外，與之前對瀾滄江支流NTF的水陸分布研究結(jié)果相比，NTF在干流上水陸分布差異比支流更大，表明在流域生態(tài)系統(tǒng)中，NTF的監(jiān)測結(jié)果同時也能反映不同空間尺度下的環(huán)境異質(zhì)性，以流域?yàn)檠芯繂卧訬TF為研究對象，可能更有助于了解微生物的空間分布格局。

關(guān)鍵詞：捕食線蟲真菌；多樣性分布；水陸關(guān)系；瀾滄江流域

中圖分類號：Q938.1? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? 文章編號：1674-3075（2023）06-0128-08

微生物多樣性的空間分布模式一直是生態(tài)學(xué)以及生物地理學(xué)嘗試回答的問題。此前已有研究從緯度、海拔、區(qū)域、全球等視角下探究了許多微生物類群的多樣性空間分布格局（Tedersoo et al， 2014；Hu et al，2019；Hu et al，2020；Kraemer et al，2020），但由于微生物自身的特性，微生物多樣性的空間格局研究相較動植物更易受到研究區(qū)域、空間尺度、研究技術(shù)和研究類群選擇等因素的影響，導(dǎo)致目前對微生物的空間分布格局及其驅(qū)動機(jī)制還未能形成相對統(tǒng)一的認(rèn)識。

傳統(tǒng)生態(tài)位理論認(rèn)為，高度的環(huán)境異質(zhì)性能夠塑造更豐富的生物多樣性，生物多樣性是探究生物空間分布格局的重要前提，而環(huán)境異質(zhì)性也是形成生物異質(zhì)性地理分布的先決條件（陳玉福和董鳴，2001；蘇婕，2019）?；诖耍袑W(xué)者提出在空間異質(zhì)性強(qiáng)、生物多樣性高的區(qū)域，以流域?yàn)閱卧_展微生物多樣性格局的研究可能有助于更好理解微生物空間格局及驅(qū)動機(jī)制（Carnevali et al，2021；Yang et al，2021）。流域的形成既能反映歷史地質(zhì)變遷過程、河流的屏障和聯(lián)通作用（Clark et al，2004；Oliveira et al，2017），又能體現(xiàn)水流造成的環(huán)境異質(zhì)性，因此，以流域?yàn)閱卧_展生物多樣性研究不僅能綜合反映驅(qū)動生物多樣性形成、維持的各種復(fù)雜生物與非生物因素之間的綜合作用，還能夠耦合水、陸地生態(tài)系統(tǒng)（鄧紅兵等，1998；陳求穩(wěn)和歐陽志云，2005）。有研究發(fā)現(xiàn)，微生物在流域尺度下是存在異質(zhì)性分布格局的（Liu et al，2015；Yang et al，2021），流域尺度下水生生態(tài)系統(tǒng)和陸地生態(tài)系統(tǒng)間的環(huán)境異質(zhì)性的差異很可能也會對微生物的分布造成影響，而捕食線蟲真菌（Nematode-Trapping Fungi，NTF）在高環(huán)境異質(zhì)性和生物多樣性的三江并流區(qū)的瀾滄江支流上是存在水陸分布差異的（張欣等，2022）?？紤]到NTF是全球廣泛分布的微生物類群，在該區(qū)域存在這種支流上的水陸分布差異，不僅說明選擇以流域尺度開展微生物空間格局研究的科學(xué)性，也體現(xiàn)了高環(huán)境異質(zhì)性和生物多樣性對微生物空間格局研究的重要性。

盡管現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展在一定程度上解決了微生物多樣性評估問題，但即便是采用最精確的測序技術(shù)也仍然無法很好解決稀有微生物類群的問題（Oono，2017）。因此，結(jié)合傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)技術(shù)開展一些微生物小類群的多樣性格局分析并理解驅(qū)動機(jī)制，也是推進(jìn)微生物生態(tài)學(xué)研究的必要手段（Chase & Marting，2018）。選擇一個生態(tài)功能重要、與其他類群相互作用力強(qiáng)，易于分離純化和鑒別的微生物類群，是開展純培養(yǎng)視角下微生物空間格局研究的關(guān)鍵（Chase & Marting，2018）。NTF是一類兼具腐生和肉食特性，可直接調(diào)控水陸環(huán)境中線蟲密度，間接影響細(xì)菌和土壤尿素含量的小類群廣布真菌（Wang et al，2014），該類真菌易分離純化，低倍鏡下可見，容易鑒別（Zhang et al，2014），是純培養(yǎng)視角下微生物多樣性空間分布格局研究的理想對象。

本研究在前期對三江并流區(qū)瀾滄江支流NTF分布格局研究（張欣等，2022）的基礎(chǔ)上，繼續(xù)探究該區(qū)域?yàn)憸娼闪鱊TF多樣性的水、陸間分布模式，進(jìn)一步比較瀾滄江干、支流生境中NTF水、陸分布差異，以驗(yàn)證流域視角下開展微生物分布格局研究的科學(xué)性。

1? ?材料與方法

1.1? ?研究區(qū)域概況

瀾滄江（21°08′～29°15′ N， 98°36′～102°19′ E）發(fā)源于青海省唐古拉山北麓，由德欽縣佛山鄉(xiāng)進(jìn)入云南境內(nèi)，與怒江、金沙江上游共同構(gòu)成了三江并流奇觀。其流經(jīng)的橫斷山區(qū)，是世界生物多樣性熱點(diǎn)區(qū)域之一，該區(qū)域云集了多種氣候類型，地形地貌復(fù)雜，整體物種多樣性和豐富度均處于較高水平（陳矼等，2004；莊鴻飛，2018）。處于三江并流區(qū)的瀾滄江流域海拔落差大，垂直立體氣候明顯，環(huán)境異質(zhì)性較高，被認(rèn)為是世界上生物多樣性最豐富的地區(qū)之一（顧純等，2019），也是流域視角下探究微生物空間分布格局的理想?yún)^(qū)域。

1.2? ?樣品采集

經(jīng)過系統(tǒng)的樣區(qū)布設(shè)和實(shí)地觀察，于三江并流區(qū)瀾滄江干流設(shè)置了9個采樣區(qū)，于枯水期進(jìn)行了樣品采集。每個采樣區(qū)選取后，以其地理坐標(biāo)為原點(diǎn)，在其上游10、20 m和下游10、20 m處布設(shè)陸地采樣點(diǎn)，同時設(shè)置與陸地采樣點(diǎn)距離不小于5 m的水體采樣點(diǎn)（圖1）。每個樣點(diǎn)用五點(diǎn)采樣法采集樣品1份，即每個樣區(qū)采集水體底泥和陸地土壤樣品各5份，所有樣區(qū)共采集90份樣品。樣品置于一次性自封袋，標(biāo)記樣點(diǎn)編號、采樣時間、海拔、經(jīng)緯度、水陸等樣品信息，采集好的樣品立刻送回實(shí)驗(yàn)室后一周內(nèi)完成土壤樣品的撒樣。

1.3? ?NTF分離、純化

1.3.1? ?培養(yǎng)基的制備? ?本研究所需培養(yǎng)基主要為玉米培養(yǎng)基（CMA，Cornmal Agar Medium）、土豆培養(yǎng)基（PDA，Potato Dextrose Agar Medium）以及燕麥培養(yǎng)基，配制方法參照文獻(xiàn)（Zhang et al，2014）進(jìn)行。

1.3.2? ?誘餌線蟲的培養(yǎng)及線蟲懸浮液的制備? ?將全齒復(fù)活線蟲（Panagrellus redivivus）接入燕麥培養(yǎng)基，放恒溫培養(yǎng)箱（26.5±1）℃培養(yǎng)1周，直到觀察到線蟲爬壁即可取出備用或放4℃冰箱保存。采用貝爾曼氏漏斗法制備線蟲懸浮液（Giuma & Cooke， 1972）。

1.3.3? ?NTF的分離純化? ?取直徑為90 mm的CMA培養(yǎng)基平板，取土壤樣本0.5～1 g均勻地撒在CMA上（撒樣時，應(yīng)注意在樣品之間留有空隙），加入線蟲懸浮液2 mL（約5 000條），每份土樣設(shè)3個重復(fù)。室溫下培養(yǎng)4周，體視顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。

觀察到NTF孢子后，用無菌牙簽挑取單個真菌孢子到直徑為60 mm的CMA培養(yǎng)基上，用自制保鮮膜封口，置于（26.5±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。

1.4? ?NTF鑒定

1.4.1? ?形態(tài)學(xué)鑒定? ?采用插片法制作NTF臨時裝片（蘇鴻雁等，2006），用奧林巴斯BX53微分干涉顯微鏡拍取分生孢子、孢子梗、厚垣孢子和捕食器官等形態(tài)特征。參照《Nematode-Trapping Fungi》（Zhang et al， 2014）和《中國真菌志·三十三卷》（張克勤和莫明和，2006）進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4.2? ?分子生物學(xué)鑒定? ?NTF菌絲在PDA上富集培養(yǎng)后，參照文獻(xiàn)（Jeewon et al，? 2002）進(jìn)行DNA的提取，以真菌通用引物ITS1 / ITS4（White et al， 1990）和RPB1-DF2asc（Hofstetter et al， 2007）/ RPB1-G2R（Stiller & Hall， 1997）分別擴(kuò)增ITS（internal transcribed spacer region of the ribosomal RNA gene，核糖體RNA上的非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）和RPB2（RNA polymerase II core subunit，RNA聚合酶II核心亞基編碼基因）序列。獲得測序結(jié)果后，在美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中通過ITS及RPB2序列同源性比對進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

1.5? ?數(shù)據(jù)處理

使用EXCEL和R語言對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及分析。計算水、陸及全部樣品中的物種檢出率，計算公式為：

總檢出率=（檢出NTF的樣品數(shù)/總樣品數(shù)）×100%

水檢出率=（檢出NTF的水體底泥樣品數(shù)/總水體底泥數(shù)）×100%

陸檢出率=（檢出NTF的陸地土壤數(shù)/總陸地土壤數(shù)）×100%

物種檢出率=（檢出某物種的樣品數(shù)/總樣品數(shù)）×100%

對水、陸及總體NTF物種多樣性指數(shù)進(jìn)行計算，比較水、陸間物種多樣性差異，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H′）計算公式為：

式中：H′為物種多樣性指數(shù)；Pi 為第i個種所占百分?jǐn)?shù)；S為采樣點(diǎn)的物種數(shù)。

應(yīng)用RStudio1.3.1093中的“VennDiagram”包繪制水陸間物種組成韋恩圖，使用Adobe Photoshop 2019將所得韋恩圖組合在一張圖上，比較各樣區(qū)對稱水、陸采樣點(diǎn)間物種組成差異。

2? ?結(jié)果

2.1? ?研究區(qū)域內(nèi)NTF檢出概況

經(jīng)過形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定（表1），在瀾滄江流域干流中，共分離到2屬13種76株NTF。其中，陸地土壤中共檢出2屬11種49株，水體底泥中共檢出1屬6種27株（圖2）。

2.2? ?各樣區(qū)水陸物種檢出率和多樣性比較

研究區(qū)域內(nèi)，陸地土壤中總檢出率為55.56%，物種多樣性指數(shù)為1.91；水體底泥中總檢出率為46.67%，物種多樣性指數(shù)為1.45。其中，IF樣區(qū)水陸樣品的物種檢出率相等，IK、IL、ER 3個樣區(qū)水體底泥中的物種檢出率高于陸地土壤，II、IJ、IG、IV、EQ 5個樣區(qū)陸地土壤的物種檢出率高于水體底泥；所有樣區(qū)陸地土壤中的物種多樣性均高于水體底泥（表2）。

2.3? ?瀾滄江干流各樣區(qū)對稱水陸間物種組成差異

干流各樣區(qū)的對稱水、陸樣點(diǎn)間的物種組成存在較大的差異：ER、IL兩個樣區(qū)水、陸間物種組成完全不同，且ER陸地土壤中檢出物種數(shù)高于水體底泥，IL樣區(qū)的對稱水、陸間檢出物種數(shù)相同；IJ、IF、IK和II 4個樣區(qū)的對稱水陸間物種組成存在差異的同時也存在一定的相似性，且均為陸地土壤中的物種數(shù)高于水體底泥；IV、IG和EQ 3個樣區(qū)水體底泥中的物種是陸地土壤中物種的子集（圖3）。

3? ?討論

3.1? ?三江并流區(qū)瀾滄江干流的NTF水陸分布差異

研究結(jié)果顯示，三江并流區(qū)瀾滄江干流的NTF在種、屬層面都存在明顯的水陸分布差異，陸地土壤中NTF的物種檢出率和多樣性明顯高于水體底泥。在巨大的海拔落差（1 200～5 000 m）（游珍等，2014）下，該區(qū)域?yàn)憸娼闪鞯牧魉佥^快，河流營養(yǎng)物沉積困難，微生物不易停留和定植，再加上海拔落差導(dǎo)致的水流不均質(zhì)性等可能是驅(qū)動該區(qū)域NTF水陸分布差異較大的主要環(huán)境因素。而陸生土壤可以容納幾乎所有的微生物，對于微生物的生長繁殖極為重要（李德新，2003），因此，在瀾滄江干流陸地上具有較水體底泥更高的NTF物種多樣性。在屬水平上，產(chǎn)黏性菌網(wǎng)的Arthrobotrys屬真菌是絕大多數(shù)生境中的優(yōu)勢屬，A.oligospora則是相應(yīng)生境的優(yōu)勢物種（Niu & Zhang，2011；Zhang et al，2014），本研究結(jié)果也支持了這一點(diǎn)。Arthrobotrys屬真菌在瀾滄江干流陸地土壤和水體底泥均有分布，而黏球和非收縮環(huán)的Dactylellina屬NTF只出現(xiàn)在陸地土壤中，該屬真菌具有營養(yǎng)要求高、腐生能力弱、生長緩慢等特點(diǎn)，生物量小且多分布在土壤深層，所以其被帶入水生生態(tài)系統(tǒng)的概率就比較小，檢出率也隨之減小，表明與水生環(huán)境相比，陸地環(huán)境可能更適合NTF 的生長，特別是一些分布范圍較小的物種。

3.2? ?瀾滄江干流NTF的水陸關(guān)系

從各樣區(qū)物種檢出情況來看，瀾滄江干流各樣區(qū)對稱水陸間物種組成存在較大差異：在9個樣區(qū)中僅有一個樣區(qū)水體底泥中檢出物種數(shù)高于陸地土壤，其余樣區(qū)均為陸地土壤檢出物種數(shù)高于水體底泥；有2個樣區(qū)的對稱水陸生境間物種組成完全不同；4個樣區(qū)水陸間既存在共有種，也有其水、陸特有物種；3個樣區(qū)水體底泥中檢出物種是陸地土壤檢出物種的子集。三江并流區(qū)瀾滄江干流多為深切的高山峽谷，河流在海拔的最低處，陸地土壤與水體間的環(huán)境異質(zhì)性較高，奔流在高山峽谷間的瀾滄江干流的水陸落差非常大，水體中微生物難以通過地下水系統(tǒng)橫向運(yùn)輸擴(kuò)散到河岸，再加上支流匯入帶入的物種，使得干流水陸間物種組成的相似度大大降低。然而，即便水陸間的物種組成存在較大差異，仍然有7個樣區(qū)對稱水陸間物種組成具有一定的相似性，這表明在流域這樣一個具有明顯邊界的生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)，水陸生境間高度的環(huán)境異質(zhì)性會顯著增加環(huán)境對微生物的選擇作用，但水陸生境仍會通過地表水循環(huán)形成一定的關(guān)聯(lián)性。

3.3? ?以流域?yàn)閱卧菀装l(fā)現(xiàn)微生物空間分布格局

NTF在全球不同生境中廣泛分布（Zhang et al，2014），之前在云南省開展的一系列NTF資源調(diào)查結(jié)果（畢廷菊等，2000；章靖等，2005），均呈現(xiàn)出隨機(jī)分布的特點(diǎn)，因此，要發(fā)現(xiàn)其分布格局可能需要充分考慮研究單元的選擇。而基于云南六大流域尺度的系統(tǒng)抽樣發(fā)現(xiàn)，NTF在中上和中下層面都具有流域分布特征（Yang et al，2021），同時，對三江并流區(qū)瀾滄江支流的調(diào)查結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，NTF在支流尺度下是非隨機(jī)分布的（張欣等，2022），本研究在瀾滄江干流發(fā)現(xiàn)了更明顯的水陸差異。這一方面說明，以流域?yàn)槌叨?，無論是在較大尺度（流域間）還是在較小尺度（流域內(nèi)），都能發(fā)現(xiàn)NTF的空間分布格局；同時也說明，流域內(nèi)的環(huán)境異質(zhì)性強(qiáng)度、水流聯(lián)通性和阻隔都能在NTF的水陸分布模式上體現(xiàn)；此外，環(huán)境異質(zhì)性越強(qiáng)的區(qū)域，NTF的異質(zhì)性分布就更明顯。對大尺度流域中真菌和細(xì)菌群落的多樣性調(diào)查結(jié)果也都顯示出流域分布格局（Liu et al，2019；Carnevali et al，2021；Crump et al，2007；Kraemer et al，2020；Wu et al，2013），由此認(rèn)為，以流域?yàn)閱卧情_展微生物多樣性格局研究的理想選擇。

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（責(zé)任編輯? ?鄭金秀）

Terrestrial and Aquatic Distribution Patterns of Nematode-trapping Fungi in the Mainstream of Lancang River of the Three Parallel Rivers Area

ZHANG Xin1，2， ZHANG Fa1，2， DENG Wei1，2， YANG Xiao‐yan1，2，3， LI Na1，2， XIAO Wen1，2，3，4

（1. Institute of Eastern-Himalaya Biodiversity Research， Dali? ?671003， P.R. China;

2. The “Key Laboratory of Yunnan State Education Department on Erhai Lake Basin Protection

and the Sustainable Development Research”， Dali? ?671003， P.R. China;

3. The provincial innovation team of biodiversity conservation and utility of the three parallel rivers region

from Dali University， Dali? ?671003， P.R. China;

4. Collaborative Innovation Center for Biodiversity and Conservation in the Three Parallel Rivers Region

of China， Dali? ?671003， P.R. China）

Abstract： In this study， we investigated the diversity of nematode-trapping fungi （NTF） in both terrestrial and aquatic environments in the mainstream of the Lancang River basin in Yunnan Province and analyzed the distribution patterns of the microorganisms between terrestrial and aquatic environments in the Lancang River watershed at different spatial scales. Nine sampling areas were systematically selected in the study area， with five terrestrial and five aquatic sampling points at each sampling area， and the five-point method was used to collect aquatic sediment and terrestrial soil samples. A total of 90 samples were collected. Pure cultures of NTF were obtained by single spore isolation， and the species were identified by morphological and molecular techniques. A total of 76 NTF strains from 13 species of 2 genera were isolated from the mainstream of Lancang River， including 49 NTF strains from 11 species of 2 genera from terrestrial soil， and 27 NTF strains from 6 species of 1 genus from aquatic sediment. There was a heterogeneous distribution pattern of NTF between terrestrial and aquatic environments， and the species detection rate and species diversity in the terrestrial environment were higher than those in the aquatic environment. Compared with a previous study on the distribution of NTF in the tributaries of Lancang River， there was a larger difference in the NTF distribution between the terrestrial and aquatic environments in the mainstream than in the tributaries. It is likely that these results reflect environmental heterogeneity due to different spatial scales in the watershed， and it is more useful to understand the spatial distribution pattern by taking the entire watershed as the research area and NTF as the subject.

Key words： nematode-trapping fungi; diversity distribution; aquatic-terrestrial link; Lancang River

watershed

收稿日期：2022-01-02? ? ? 修回日期：2022-08-23

基金項目：國家自然科學(xué)基金（U1602262；31760126）；云南省教育廳科學(xué)研究基金項目（2022Y890）。

作者簡介：張欣，1996年生，女，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)槲⑸锷鷳B(tài)學(xué)。E-mail：zhangx@eastern-himalaya.cn

通信作者：楊曉燕，1977年生，女，教授，研究方向?yàn)槲⑸锷鷳B(tài)學(xué)。E-mail：yangxy@eastern-himalaya.cn