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    血清4型和5型副豬嗜血桿菌易感仔豬發(fā)病模型的建立

    2021-09-07 01:46:12宋曉明董紹明李佃場張洪亮秦曉冰
    中國動物檢疫 2021年9期
    關(guān)鍵詞:嗜血血清型毒力

    宋曉明,董紹明,李佃場,宋 杰,王 森,張洪亮,秦曉冰,單 虎

    (1.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,山東省新獸藥創(chuàng)制協(xié)同創(chuàng)新中心,山東青島 266109;2.乳山市行政審批服務局,山東乳山 264500;3.即墨區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展服務中心,山東青島 266200)

    副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS),屬于巴斯德菌科(Pastteurellaceae)嗜血桿菌屬(Haemophilus),為革蘭氏陰性菌,是仔豬上呼吸道早期定居的菌群成員之一。該菌可引起以豬的多發(fā)性漿膜炎、纖維素性胸膜炎、腦膜炎、腹膜炎、心包炎和關(guān)節(jié)炎等多器官病變?yōu)樘卣鞯母必i嗜血桿菌病,又稱格拉塞爾氏病[1]。該病在各年齡段豬群中均有發(fā)生,斷奶和保育仔豬比較易感,5~8 周齡仔豬的發(fā)病率為10%~15%,發(fā)病嚴重的養(yǎng)殖場死亡率可達50%以上。HPS 呈世界性分布,危害范圍比較廣,與其他細菌、病毒等多病原混合感染情況嚴重。作為豬群一種主要的繼發(fā)病原,HPS 對國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成了不良影響。據(jù)報道[2],HPS 臨床分離株表現(xiàn)出對幾種抗生素的抗性。因此,接種疫苗和血清抗體(IgG 或IgA)是控制該病的有效手段[3-4]。但由于HPS 血清型多樣化且不同血清型菌株毒力差異較大,導致不同血清型菌株間交叉保護作用差,疫苗接種失敗的發(fā)生率很高[5-7]。為解決上述問題,有必要構(gòu)建穩(wěn)定、可靠的易感仔豬感染模型,從而為HPS 致病機制、診斷和免疫研究奠定技術(shù)基礎。

    1 材料與方法

    1.1 HPS 菌株

    HPS 血清4型SD-05、ZC-7 株,血清5型HB-08、PZ-26 株,均由本實驗室分離并保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 培養(yǎng)基以及主要試劑

    胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB),購自英國OXOID 公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),購自Sigma 公司;新生牛血清,購自浙江天杭生物科技有限公司;DL 2 000 DNA Marker、ExTaqDNA 聚合酶、dNTP Mixture,購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

    1.3 試驗動物

    21~28 日齡健康易感仔豬100 頭,由試驗定點豬場提供,經(jīng)HPS 正向間接血凝診斷試劑盒檢測確認,抗體呈陰性。

    1.4 毒力測定

    1.4.1 分離株復蘇培養(yǎng) 將HPS 血清4型(SD-05、ZC-7)、5型(HB-08、PZ-26)菌株分別接種在添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSA固體培養(yǎng)基上復蘇,連續(xù)傳至第3 代;無菌條件下挑取單菌落至5 mL 添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)10~12 h,作為種子液;將種子液按照2%接種量接種至100 mL 添加有0.005% NAD 和5%新生牛血清的TSB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min擴大培養(yǎng)10~12 h;應用平板菌落計數(shù)法進行活菌計數(shù),并將菌液在4 ℃條件下9 000 r/min 離心10 min,棄上清后以PBS 分別稀釋成不同濃度進行毒力測定。

    1.4.2 分離株毒力測定 對于每種分離株,選取20 頭健康仔豬開展試驗。將仔豬隨機分成4 組(A—D),每組5 頭。其中A—C 為試驗組,D 為對照組。對試驗組仔豬腹腔注射不同濃度菌株,每頭2.0 mL,同時對D 組仔豬注射PBS 作為對照,觀察14 d。記錄試驗組發(fā)病情況,根據(jù)毒力測定結(jié)果選取毒力較強的菌株用于仔豬感染試驗。

    1.5 仔豬感染試驗

    分別以1.4.2 試驗中得到的血清4型、5型最適菌株最適劑量,對5 頭試驗仔豬進行腹腔注射,每頭2.0 mL,另外5 頭仔豬注射PBS 作為對照。觀察感染后仔豬臨床癥狀,記錄仔豬發(fā)病及死亡情況,對死亡豬只進行剖解,觀察其心、肝、脾、肺、腎等組織器官的病理變化。

    1.6 HPS 分離鑒定

    1.6.1 HPS 分離培養(yǎng) 無菌條件下分別采集感染血清4型、5型菌株死亡仔豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、心包積液、心血、關(guān)節(jié)液、腹腔積液、胸腔積液等組織病料,并接種于含0.005%NAD 和5%新生牛血清的TSA、TSB 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24~48 h,挑取疑似單菌落進一步純化培養(yǎng)。

    1.6.2 引物設計與合成 根據(jù)GenBank 中HPS 16s rRNA基因序列(登錄號:M75065)設計引物(上游:5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3';下游:5'-GGCTTCGTCACCCTCTGTA-3')。預計擴增目的片段大小為822 bp,引物送北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

    1.6.3 PCR 擴增 取鏡檢無雜菌污染的菌液1 mL,用高速離心機10 000 r/min 離心5 min,棄掉上清液;沉淀用雙蒸水溶解,再將其100 ℃煮沸15 min;12 000 r/min 離心5 min,收集上清作為模板用于PCR 擴增。反應體系為25.0 μL:上、下游引物各0.8 μL,細菌DNA 模板2.0 μL,10×Buffer 2.5 μL,雙 蒸 水16.5 μL,dNTP 2.0 μL,rTaq酶0.4 μL。反應條件:預變性94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 45 s,循環(huán)30 次;終延伸72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析。

    2 結(jié)果

    2.1 毒力測定

    2.1.1 血清4型菌株 由表1~2可以看出,HPS血清4型分離株SD-05和ZC-7以攻毒劑量(1.1~1.2)×109CFU注射后,在14 d 內(nèi)SD-05株可使2/5 仔豬發(fā)病,ZC-7 株則不能導致仔豬發(fā)?。患哟蠊ザ緞┝恐粒?.4~4.8)×109CFU 時,SD-05 株可使仔豬全部發(fā)病,并導致3/5 仔豬死亡,而ZC-7 株只有3/5 仔豬發(fā)病,2/5 仔豬死亡;當劑量增加至(8.8~9.6)×109CFU 時,SD-05 株可導致4/5仔豬死亡,ZC-7株只引起3/5仔豬死亡。因此,推測血清4型SD-05 株毒力較強。為保證易感仔豬感染模型中同時有發(fā)病和死亡病例,選擇SD-05株最適感染劑量為4.8×109CFU。

    表1 血清4型菌株SD-05 株對健康易感斷奶仔豬毒力測定結(jié)果

    表2 血清4型菌株ZC-7 株對健康易感斷奶仔豬毒力測定結(jié)果

    2.1.2 血清5型菌株 由表3~4 可以看出,血清5型分離株HB-08 和PZ-26 以攻毒劑量(1.1~1.175)×109CFU 注射時,在14 d 內(nèi),HB-08 株可使3/5 仔豬發(fā)病,PZ-26 株可使2/5 仔豬發(fā)??;加大劑量至(4.4~4.7)×109CFU 時,HB-08 株可使全部仔豬發(fā)病,并導致4/5 仔豬死亡,PZ-26 株也可使全部仔豬發(fā)病,但只引起2/5 仔豬死亡;當進一步加大攻毒劑量至(8.8~9.4)×109CFU 時,HB-08 株可引起仔豬全部死亡,PZ-26 株只引起3/5 仔豬死亡。因此,推測血清5型HB-08 株毒力較強。同樣地,為保證易感仔豬感染模型中同時有發(fā)病和死亡病例,選擇HB-08 株最適感染劑量為4.7×109CFU。

    表3 血清5型菌株HB-08 株對健康易感斷奶仔豬毒力測定結(jié)果

    2.2 感染仔豬病理變化

    2.2.1 感染血清4型SD-05 株 感染后,仔豬體溫升高,出現(xiàn)精神沉郁、呼吸困難、咳嗽、消瘦、跛行、可視黏膜發(fā)紺等臨床癥狀。剖檢可見胸腹腔內(nèi)和各臟器表面有纖維素性滲出物,心臟出現(xiàn)“絨毛心”等病理變化(圖1)。

    圖1 仔豬感染HPS 血清4型SD-05 株后剖檢變化

    表4 血清5型菌株P(guān)Z-26 株對健康易感斷奶仔豬毒力測定結(jié)果

    2.2.2 仔豬感染血清5型HB-08 株 仔豬感染血清5型HB-08 株后的臨床表現(xiàn)及剖解變化(圖2)與感染血清4型SD-05 株基本相同。

    圖2 仔豬感染HPS 血清5型HB-08 株后剖檢變化

    2.3 PCR 鑒定

    將分離到的血清4型SD-05 株、血清5型HB-08 株經(jīng)PCR 特異性擴增,得到822 bp 的目的片段(圖3),與預期片段大小一致。

    圖3 HPS 血清4型(SD-05)、5型(HB-08)分離株P(guān)CR 產(chǎn)物擴增結(jié)果

    3 討論

    副豬嗜血桿菌病的特征性病變是通過細菌全身性侵襲從而產(chǎn)生纖維性多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎。HPS 能夠通過粘附和侵襲上皮細胞而定居并引發(fā)感染,通過降解IgA,逃避先天免疫系統(tǒng),并在宿主內(nèi)部繁殖產(chǎn)生強烈炎癥反應[8-9]。HPS 可誘導CD163+單核細胞呈比例增加,產(chǎn)生大量TNF-α、IL-1 和IL-6 等促炎細胞因子,并誘導上皮和內(nèi)皮細胞的凋亡和白介素IL-6 和IL-8 的釋放[10],這些細胞因子在該病典型病變的炎癥反應和發(fā)展中起作用。豬肺泡巨噬細胞的吞噬作用可消除HPS 非毒力菌株的感染,但其強毒株能夠逃避巨噬細胞的吞噬[11]。HPS 強毒株一旦進入血液,就能以抗體非依賴性方式避免補體介導的殺傷,因此能夠到達全身各部位,引起多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎[12]。

    不同國家或地區(qū)存在的HPS 血清型不同,菌株的毒力差異也很大。我國流行的HPS 主要血清型為4型和5型,其次是12型、13型、14型等,但個別地區(qū)間略有差異[13-18]。本試驗發(fā)現(xiàn),HPS不同血清型以及相同血清型的不同菌株對21~28 日齡健康易感斷奶仔豬的毒力也不相同。綜合試驗數(shù)據(jù),HPS 血清4型SD-05 株和血清5型HB-08 株毒力較強,對仔豬建立發(fā)病模型的最適接種劑量分別為4.8×109、4.7×109CFU。

    SD-05 株和HB-08 株可導致仔豬體溫升高,使其出現(xiàn)精神沉郁、呼吸困難、咳嗽、消瘦、跛行、可視黏膜發(fā)紺等臨床癥狀;剖檢可見,胸腹腔內(nèi)以及心臟、肺臟、腎臟、脾臟等臟器表面有纖維素性滲出物,心臟出現(xiàn)“絨毛心”等病理變化,以上癥狀及病理變化為副豬嗜血桿菌病的特征性病變,且隨后在攻毒死亡仔豬組織器官中成功分離到HPS 血清4型SD-05 株和血清5型HB-08 株。綜上,本研究初步建立了血清4型和5型HPS 感染的仔豬發(fā)病模型,可應用于新獸用生物制品的安全性和免疫效力評價。在后續(xù)研究中,需進一步豐富完善更多指標,擴大該模型的應用范圍。本研究為HPS 致病機制、診斷和免疫研究奠定了基礎。

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