禽白血病凈化檢測中不同樣品應用的比較

李凱航，劉 健，楊顯超，趙 鵬，衛(wèi)龍興，李 鑫，楊德全，陶田谷晟，周錦萍

（1.上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103；2.山東農(nóng)業(yè)大學，山東泰安 271018；3.奉賢區(qū)動物疫病預防控制中心，上海 201400）

近年來，隨著對禽白血病（avian leukemia，AL）防控凈化的日益重視，針對禽白血病病毒（avian leukemia virus，ALV）檢測方法的相關報道[1-2]較多。目前，國際上ALV 凈化檢測的普遍方法是使用胎糞和蛋清作為主要檢測樣品，開展ALV p27抗原ELISA 檢測。該方法準確、可靠，應用廣泛，但存在一定技術難度。因此，個別種雞場使用泄殖腔棉拭子作為主要凈化檢測樣品。近年流行病學研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，我國很多地方品種雞泄殖腔棉拭子AIV p27 抗原ELISA 檢測陽性率可達6%～90%，但受檢雞只不表現(xiàn)任何臨床病變。另外，在種雞場ALV 凈化檢測中，血漿病毒分離作為凈化檢測的主要方法之一，數(shù)據(jù)準確且可靠性高，而精液和蛋清的ALV 檢出率與血漿存在一定差異。針對凈化實施中這些實際問題，筆者所在實驗室開展了種雞群ALV 凈化檢測中多種樣品的比對，以期通過比較，為ALV 凈化檢測中的樣品選用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器及試驗動物

ALV p27 抗原ELISA 檢測試劑盒（貨號99-09257），購自北京愛德士元亨生物科技有限公司；DMEM 細胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、胰酶消化液（0.25%）、青鏈霉素溶液（100×），購自GIBCO 公司；兩性霉素B，購自北京索萊寶科技有限公司；肝素鈉抗凝管，購自和瑞醫(yī)療器械有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。TECAN SUNRISE 酶標儀，為瑞士TECAN 公司產(chǎn)品；CO2細胞培養(yǎng)箱，為美國Thermo 公司產(chǎn)品；DF-1 細胞，由山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院禽病研究室贈送；試驗用公雞、母雞，均來自上海某原種雞場AL 凈化第一世代的核心育種群種雞（5 500 套），蛋清和胎糞樣品由母雞所產(chǎn)種蛋和雛雞中采集。

1.2 樣品種類和數(shù)量

1.2.1 泄殖腔棉拭子與其他樣品比對 一是泄殖腔棉拭子與血漿：在核心群內(nèi)隨機挑選200 羽公雞，同步采集公雞泄殖腔棉拭子和血漿各200 份；二是泄殖腔棉拭子與精液：在對挑選出的200 羽公雞采集泄殖腔棉拭子時，再隨機選取其中30 羽公雞采集精液30 份；三是泄殖腔棉拭子與蛋清：在核心群內(nèi)隨機挑選30 羽母雞，同步采集母雞泄殖腔棉拭子和所產(chǎn)蛋蛋清各30 份。

1.2.2 血漿與其他樣品比對 一是血漿與精液：在核心群內(nèi)隨機挑選200 羽公雞（與1.2.1 所選公雞無交叉），同步采集公雞血漿和精液各200 份；二是血漿與蛋清：在核心群中挑選蛋清ALV p27抗原ELISA 檢測陽性的母雞62 只采集血漿。

1.2.3 蛋清與胎糞比對 從育種群中隨機采集30枚雞蛋的蛋清和對應的1日齡同胞雛雞胎糞60份，即雞蛋和2 只雛雞均來自于同一只母雞。

1.3 樣品采集方法

1.3.1 泄殖腔棉拭子 以1.5 mL 離心管取1.0 mL PBS 緩沖液（pH7.2），用棉簽在雞只泄殖腔內(nèi)左轉3 圈，右轉3 圈，刮取泄殖腔內(nèi)側3～4 cm 處黏液，注意不要刮出血。刮取后，將棉簽頭折斷放于離心管中靜置過夜，浸出液上清可直接進行p27 抗原ELISA 檢測。

1.3.2 血漿 母雞開產(chǎn)后，每只取初產(chǎn)蛋1 枚，收集外殼完整雞蛋進行編號。母雞全血按照蛋號進行采集，公雞全血與精液一一對應采集。用肝素鈉抗凝管靜脈采集1.0 mL 血液，顛倒混勻3 次，2 000 r/min 離心2 min 后吸取血漿用于病毒分離。

1.3.3 蛋清 將雞蛋氣室向上放置，用酒精棉消毒后在氣室一側打孔，用吸管或適當工具吸取蛋清，注意手不要碰到吸管頭部，不要吸到卵黃。每枚雞蛋吸取3 管蛋清，每管吸取1.0 mL 左右，置于1.5 mL 離心管內(nèi)，凍存2 管以備復檢，待檢蛋清樣品可直接進行p27 抗原ELISA 檢測。

1.3.4 精液 無菌采集公雞精液50 μL 以上，取40 μL 加至160 μL 精液稀釋液中，振蕩混勻，3 000 r/min 離心2 min 后收集上清用于病毒分離。

1.3.5 胎糞 每只種雞的種蛋置于同一出殼紙袋中，待雛雞出殼后，用1.5 mL 離心管取0.5 mL PBS 稀釋液，用手將1 日齡雛雞腹部輕輕擠壓，然后在肛門處沾取糞便置于稀釋液中，將棉簽頭于離心管中折斷，用振蕩器對離心管進行10 s短暫振蕩，置于液氮凍存。在對一只母雞的所有雛雞采集完胎糞后，必須更換手套或洗手消毒以避免交叉污染。檢測前取出凍存的胎糞樣品融化并靜置3 min，取上清直接進行p27 抗原ELISA 檢測。

1.4 病毒分離培養(yǎng)

血漿和精液樣品需先進行病毒分離培養(yǎng)，再使用細胞培養(yǎng)上清開展AIV p27 抗原ELISA 檢測。吸取100.0 μL 血漿或精液樣品加至已長成單層DF-1細胞的24 孔板中，將24 孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中吸附2～4 h；傾去上清，每孔加入0.5 mL PBS，清洗后棄去清洗液，加入含1% FBS 的DMEM 維持液，在37 ℃ 5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)7～9 d；取100.0 μL 細胞培養(yǎng)上清，-20 ℃凍存后室溫融化，反復凍融3 次后進行p27 抗原ELISA 檢測。

1.5 AIV p27 抗原ELISA 檢測

血漿和精液在病毒分離培養(yǎng)后，取細胞培養(yǎng)上清進行p27 抗原ELISA 檢測；泄殖腔棉拭子、蛋清和胎糞可按照1.3 方法處理后直接進行 p27 抗原ELISA 檢測。具體為：取出96 孔抗體包被板，加樣前記錄樣品位置，陰、陽性對照樣品（均來自ELISA 檢測試劑盒，且陽性對照樣品已經(jīng)標準化處理，抗原水平標定為10 ng/mL）每孔100.0 μL各加2 孔；在剩余孔中加入100.0 μL 被檢樣品，18～26 ℃孵育60 min；用去離子水洗滌板孔，重復3 次，每孔加入100.0 μL 酶標抗體，18～26 ℃孵育60 min；洗板3 次后，每孔加入100.0 μL TMB底物，18～26 ℃孵育15 min；每孔加入100.0 μL終止液，測量并記錄待測樣品和對照孔在650 nm波長的吸光值A（OD650）。被檢樣品p27 抗原含量通過計算樣品與陽性對照吸光值比值（S/P）來確定，S/P≤0.2 為陰性，S/P＞0.2 為陽性。

1.6 統(tǒng)計分析

被檢樣品p27 抗原含量通過ELISA 檢測S/P值來表示，運用SPSSAU 數(shù)據(jù)分析軟件對各類樣品的S/P值進行配對t 檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 泄殖腔棉拭子與其他樣品比對

2.1.1 泄殖腔棉拭子與血漿樣品 由表1可看出，雖然泄殖腔棉拭子檢測為ALV p27 抗原陰性的樣品，血漿檢測也均為陰性，但是泄殖腔棉拭子陽性率（72.00%）大大高于相應血漿病毒分離培養(yǎng)后的檢測陽性率（6.00%）。

表1 泄殖腔棉拭子與血漿p27 抗原ELISA 檢測結果比對

2.1.2 泄殖腔棉拭子與精液樣品 由表2 可見，泄殖腔棉拭子檢測為ALV p27 抗原陰性的樣品，精液檢測也均為陰性。泄殖腔棉拭子陽性率仍然過高（80.00%），相對應的精液檢測陽性率為16.67%。

表2 泄殖腔棉拭子與精液p27 抗原ELISA 檢測結果比對

2.1.3 泄殖腔棉拭子與蛋清樣品 由表3 可見，泄殖腔棉拭子檢測為ALV p27 抗原陰性的樣品，蛋清檢測也均為陰性，且泄殖腔棉拭子陽性率（66.67%）仍遠高于對應母雞所產(chǎn)蛋的蛋清陽性率（6.67%）。

表3 泄殖腔棉拭子與蛋清p27 抗原ELISA 檢測結果比對

2.2 血漿與其他樣品比對

2.2.1 血漿與蛋清樣品 挑選蛋清p27 抗原ELISA 檢測為陽性的母雞62 只，即蛋清陽性率為100%，然后采集對應母雞血漿，病毒分離后檢測p27 抗原，發(fā)現(xiàn)陽性率僅為29.03%（表4）。

表4 血漿與蛋清p27 抗原ELISA 檢測結果比對

2.2.2 血漿與精液 由表5 可見，血漿p27 抗原ELISA 檢測陽性率為9.00%，精液陽性率為3.50%，精液、血漿雙陽性的樣品僅有2 份，即同一只公雞的血漿和精液也存在不同檢測結果。

表5 血漿與精液p27 抗原ELISA 檢測結果比對

2.3 蛋清與胎糞比對

蛋清檢測陽性樣品對應母雞所產(chǎn)的2 只同胞雛雞的胎糞中，有1 份胎糞陽性便記為相同陽性。蛋清的p27 抗原陽性率為20.0%，略低于同胞雛雞的胎糞陽性率（26.7%），8 份胎糞陽性中有6 份與同胞蛋清為相同陽性，陽性符合率75%，詳見表6。從結果可以看出，不僅蛋清和胎糞的陽性率接近，兩者間的陽性符合率也高，說明蛋清樣品和同胞雛雞胎糞間檢測結果的相關性強。

表6 蛋清與胎糞（同胞雛雞）p27 抗原ELISA 檢測結果比對 單位：份

2.4 檢測結果顯著性分析

被檢樣品中的p27 抗原含量可通過ELISA檢測S/P值來表示，對各類樣品ELISA 檢測S/P值進行顯著性檢驗（配對t 檢驗），發(fā)現(xiàn)泄殖腔棉拭子與其他樣品間差異均為極顯著（P＜0.01），血漿與蛋清、胎糞樣品間差異均為極顯著（P＜0.01），蛋清與胎糞樣品間差異顯著（P＜0.05），說明樣品間很難相互替代，詳見表7。

表7 不同樣品間p27 抗原ELISA 檢測結果顯著性檢驗結果

3 討論

泄殖腔棉拭子ALV p27 抗原ELISA 檢測具有便于收集，簡單易操作等優(yōu)點，但據(jù)相關報道[6]，相對于血漿病毒分離法，不同類型雞泄殖腔棉拭子ALV p27 抗原檢測法存在很高的假陽性率和漏檢率。針對此問題，本研究對泄殖腔棉拭子與血漿、精液、蛋清等不同樣品的檢測結果分別作了對應比較，結果發(fā)現(xiàn)，泄殖腔棉拭子p27 抗原ELISA 檢測為陰性的雞只，其他樣品檢測也均為陰性，但是泄殖腔棉拭子樣品的陽性率遠遠高于其他樣品，且雞只不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，這與文獻[6]結果一致。推測原因應為，泄殖腔中的非特異性成分影響了檢測準確性，造成該類樣品檢測的“假陽性率”高。因此，僅依靠泄殖腔棉拭子檢測實施凈化會造成雞群淘汰率過高，既不科學也不經(jīng)濟，即不建議以泄殖腔棉拭子作為主要檢測樣品。

AL 凈化監(jiān)測中，始終困擾人們的是一般檢測手段無法區(qū)別內(nèi)源性ALV（指可整合進染色體基因組的ALV，一般為可通過染色體垂直傳播的E亞型，通常致病性很弱），當前能解決這一問題的方法是使用DF-1 細胞系對ALV 進行分離培養(yǎng)。該細胞系對內(nèi)源性ALV 有抗性，僅可有效培養(yǎng)出外源性病毒（指不會通過染色體傳遞的ALV，包括A、B、C、D 和J 亞型，致病性強，雞群中以A、B 和J 亞型常見，凈化ALV 以外源性病毒為主）。用血漿樣品或組織研磨過濾樣品接種DF-1 細胞，培養(yǎng)9 d 后，使用商品化ELISA 試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清中p27 特異性抗原[7]，這種聯(lián)合檢測方法科學、可靠，可作為方法比較的評判基準之一。

感染禽可通過精液排出ALV，因此在凈化第一世代群體內(nèi)呈現(xiàn)一定陽性。同樣地，母雞會通過輸卵管不定期排毒造成蛋清陽性，蛋清樣品檢測同樣是凈化AL 的經(jīng)典方法。有研究[8]顯示，種雞群種蛋p27 抗原檢出率與種雞群及其孵化后雞群ALV 感染情況具有較好的相關性和吻合性。在本研究中，對血漿病毒分離陽性母雞所產(chǎn)蛋進行檢測，發(fā)現(xiàn)其蛋清p27 檢測陽性率為29.03%；將血漿與公雞相應精液進行同步病毒分離，結果血漿樣品檢測陽性率（9.00%）略高于精液（3.50%）。這說明出現(xiàn)病毒血癥的感染母雞或公雞，其生殖系統(tǒng)并非長期排毒，存在隨機排毒現(xiàn)象。同樣從表4～5 可見，蛋清、精液為陽性的樣品，其血漿檢測未必為陽性，說明病毒血癥和生殖系統(tǒng)排毒并非同步?？傊獫{樣品檢測雖然科學、可靠，但因ALV 排毒特性，無法替代蛋清、精液樣品檢測，僅依賴血漿檢測這一種方法會造成漏檢現(xiàn)象。此外，因1 日齡雛雞血漿采集量不能滿足檢測要求，所以血漿未與胎糞樣品做比對。

本次比對中，雛雞胎糞p27 抗原ELISA 檢測陽性率（26.7%）略高于蛋清（20.0%），但胎糞和蛋清的陽性符合率較高。早期感染雛雞終生帶毒，如不盡早淘汰，對于雞群凈化狀態(tài)的負面影響巨大。雛雞孵化時，內(nèi)源性ALV 表達較少，故胎糞檢測對于雞群凈化狀態(tài)評估具有重要意義。胎糞檢測陽性率略高，可能與胎糞樣品中含有的非特異性成分較多有關。

在ALV 凈化檢測中，血漿、精液、胎糞、蛋清等不同樣品各有其應用局限性：血漿樣品需要采集自病毒血癥期間，精液和蛋清樣品檢測依賴于生殖系統(tǒng)隨機排毒，胎糞樣品對時效性要求嚴格，須在雛雞出生24 h 內(nèi)采集。而且，因血漿和精液樣品病毒含量不足，需要經(jīng)過病毒分離培養(yǎng)后檢測，這對大批量細胞培養(yǎng)技術要求較高。在實際應用中，為了提高單世代感染動物的檢出率，建議在實施凈化的第一世代雞群中，采取全群采集公雞血漿、精液和母雞血漿的檢測方法，聯(lián)合采集初產(chǎn)蛋蛋清、雛雞胎糞等樣品，對雞群的出殼、育雛、開產(chǎn)、留種等生產(chǎn)階段關鍵時間點進行檢測，凈化3～4 個世代后，再采用按比例抽查的維持凈化檢測方案，從而達到科學、經(jīng)濟、高效的整體凈化效果。