禽白血病凈化檢測中不同樣品應(yīng)用的比較

李凱航，劉 健，楊顯超，趙 鵬，衛(wèi)龍興，李 鑫，楊德全，陶田谷晟，周錦萍

（1.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安 271018；3.奉賢區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201400）

近年來，隨著對(duì)禽白血?。╝vian leukemia，AL）防控凈化的日益重視，針對(duì)禽白血病病毒（avian leukemia virus，ALV）檢測方法的相關(guān)報(bào)道[1-2]較多。目前，國際上ALV 凈化檢測的普遍方法是使用胎糞和蛋清作為主要檢測樣品，開展ALV p27抗原ELISA 檢測。該方法準(zhǔn)確、可靠，應(yīng)用廣泛，但存在一定技術(shù)難度。因此，個(gè)別種雞場使用泄殖腔棉拭子作為主要凈化檢測樣品。近年流行病學(xué)研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，我國很多地方品種雞泄殖腔棉拭子AIV p27 抗原ELISA 檢測陽性率可達(dá)6%～90%，但受檢雞只不表現(xiàn)任何臨床病變。另外，在種雞場ALV 凈化檢測中，血漿病毒分離作為凈化檢測的主要方法之一，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確且可靠性高，而精液和蛋清的ALV 檢出率與血漿存在一定差異。針對(duì)凈化實(shí)施中這些實(shí)際問題，筆者所在實(shí)驗(yàn)室開展了種雞群ALV 凈化檢測中多種樣品的比對(duì)，以期通過比較，為ALV 凈化檢測中的樣品選用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器及試驗(yàn)動(dòng)物

ALV p27 抗原ELISA 檢測試劑盒（貨號(hào)99-09257），購自北京愛德士元亨生物科技有限公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、胰酶消化液（0.25%）、青鏈霉素溶液（100×），購自GIBCO 公司；兩性霉素B，購自北京索萊寶科技有限公司；肝素鈉抗凝管，購自和瑞醫(yī)療器械有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。TECAN SUNRISE 酶標(biāo)儀，為瑞士TECAN 公司產(chǎn)品；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，為美國Thermo 公司產(chǎn)品；DF-1 細(xì)胞，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院禽病研究室贈(zèng)送；試驗(yàn)用公雞、母雞，均來自上海某原種雞場AL 凈化第一世代的核心育種群種雞（5 500 套），蛋清和胎糞樣品由母雞所產(chǎn)種蛋和雛雞中采集。

1.2 樣品種類和數(shù)量

1.2.1 泄殖腔棉拭子與其他樣品比對(duì) 一是泄殖腔棉拭子與血漿：在核心群內(nèi)隨機(jī)挑選200 羽公雞，同步采集公雞泄殖腔棉拭子和血漿各200 份；二是泄殖腔棉拭子與精液：在對(duì)挑選出的200 羽公雞采集泄殖腔棉拭子時(shí)，再隨機(jī)選取其中30 羽公雞采集精液30 份；三是泄殖腔棉拭子與蛋清：在核心群內(nèi)隨機(jī)挑選30 羽母雞，同步采集母雞泄殖腔棉拭子和所產(chǎn)蛋蛋清各30 份。

1.2.2 血漿與其他樣品比對(duì) 一是血漿與精液：在核心群內(nèi)隨機(jī)挑選200 羽公雞（與1.2.1 所選公雞無交叉），同步采集公雞血漿和精液各200 份；二是血漿與蛋清：在核心群中挑選蛋清ALV p27抗原ELISA 檢測陽性的母雞62 只采集血漿。

1.2.3 蛋清與胎糞比對(duì) 從育種群中隨機(jī)采集30枚雞蛋的蛋清和對(duì)應(yīng)的1日齡同胞雛雞胎糞60份，即雞蛋和2 只雛雞均來自于同一只母雞。

1.3 樣品采集方法

1.3.1 泄殖腔棉拭子 以1.5 mL 離心管取1.0 mL PBS 緩沖液（pH7.2），用棉簽在雞只泄殖腔內(nèi)左轉(zhuǎn)3 圈，右轉(zhuǎn)3 圈，刮取泄殖腔內(nèi)側(cè)3～4 cm 處黏液，注意不要刮出血。刮取后，將棉簽頭折斷放于離心管中靜置過夜，浸出液上清可直接進(jìn)行p27 抗原ELISA 檢測。

1.3.2 血漿 母雞開產(chǎn)后，每只取初產(chǎn)蛋1 枚，收集外殼完整雞蛋進(jìn)行編號(hào)。母雞全血按照蛋號(hào)進(jìn)行采集，公雞全血與精液一一對(duì)應(yīng)采集。用肝素鈉抗凝管靜脈采集1.0 mL 血液，顛倒混勻3 次，2 000 r/min 離心2 min 后吸取血漿用于病毒分離。

1.3.3 蛋清 將雞蛋氣室向上放置，用酒精棉消毒后在氣室一側(cè)打孔，用吸管或適當(dāng)工具吸取蛋清，注意手不要碰到吸管頭部，不要吸到卵黃。每枚雞蛋吸取3 管蛋清，每管吸取1.0 mL 左右，置于1.5 mL 離心管內(nèi)，凍存2 管以備復(fù)檢，待檢蛋清樣品可直接進(jìn)行p27 抗原ELISA 檢測。

1.3.4 精液 無菌采集公雞精液50 μL 以上，取40 μL 加至160 μL 精液稀釋液中，振蕩混勻，3 000 r/min 離心2 min 后收集上清用于病毒分離。

1.3.5 胎糞 每只種雞的種蛋置于同一出殼紙袋中，待雛雞出殼后，用1.5 mL 離心管取0.5 mL PBS 稀釋液，用手將1 日齡雛雞腹部輕輕擠壓，然后在肛門處沾取糞便置于稀釋液中，將棉簽頭于離心管中折斷，用振蕩器對(duì)離心管進(jìn)行10 s短暫振蕩，置于液氮凍存。在對(duì)一只母雞的所有雛雞采集完胎糞后，必須更換手套或洗手消毒以避免交叉污染。檢測前取出凍存的胎糞樣品融化并靜置3 min，取上清直接進(jìn)行p27 抗原ELISA 檢測。

1.4 病毒分離培養(yǎng)

血漿和精液樣品需先進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，再使用細(xì)胞培養(yǎng)上清開展AIV p27 抗原ELISA 檢測。吸取100.0 μL 血漿或精液樣品加至已長成單層DF-1細(xì)胞的24 孔板中，將24 孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中吸附2～4 h；傾去上清，每孔加入0.5 mL PBS，清洗后棄去清洗液，加入含1% FBS 的DMEM 維持液，在37 ℃ 5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)7～9 d；取100.0 μL 細(xì)胞培養(yǎng)上清，-20 ℃凍存后室溫融化，反復(fù)凍融3 次后進(jìn)行p27 抗原ELISA 檢測。

1.5 AIV p27 抗原ELISA 檢測

血漿和精液在病毒分離培養(yǎng)后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行p27 抗原ELISA 檢測；泄殖腔棉拭子、蛋清和胎糞可按照1.3 方法處理后直接進(jìn)行 p27 抗原ELISA 檢測。具體為：取出96 孔抗體包被板，加樣前記錄樣品位置，陰、陽性對(duì)照樣品（均來自ELISA 檢測試劑盒，且陽性對(duì)照樣品已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理，抗原水平標(biāo)定為10 ng/mL）每孔100.0 μL各加2 孔；在剩余孔中加入100.0 μL 被檢樣品，18～26 ℃孵育60 min；用去離子水洗滌板孔，重復(fù)3 次，每孔加入100.0 μL 酶標(biāo)抗體，18～26 ℃孵育60 min；洗板3 次后，每孔加入100.0 μL TMB底物，18～26 ℃孵育15 min；每孔加入100.0 μL終止液，測量并記錄待測樣品和對(duì)照孔在650 nm波長的吸光值A(chǔ)（OD650）。被檢樣品p27 抗原含量通過計(jì)算樣品與陽性對(duì)照吸光值比值（S/P）來確定，S/P≤0.2 為陰性，S/P＞0.2 為陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

被檢樣品p27 抗原含量通過ELISA 檢測S/P值來表示，運(yùn)用SPSSAU 數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)各類樣品的S/P值進(jìn)行配對(duì)t 檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 泄殖腔棉拭子與其他樣品比對(duì)

2.1.1 泄殖腔棉拭子與血漿樣品 由表1可看出，雖然泄殖腔棉拭子檢測為ALV p27 抗原陰性的樣品，血漿檢測也均為陰性，但是泄殖腔棉拭子陽性率（72.00%）大大高于相應(yīng)血漿病毒分離培養(yǎng)后的檢測陽性率（6.00%）。

表1 泄殖腔棉拭子與血漿p27 抗原ELISA 檢測結(jié)果比對(duì)

2.1.2 泄殖腔棉拭子與精液樣品 由表2 可見，泄殖腔棉拭子檢測為ALV p27 抗原陰性的樣品，精液檢測也均為陰性。泄殖腔棉拭子陽性率仍然過高（80.00%），相對(duì)應(yīng)的精液檢測陽性率為16.67%。

表2 泄殖腔棉拭子與精液p27 抗原ELISA 檢測結(jié)果比對(duì)

2.1.3 泄殖腔棉拭子與蛋清樣品 由表3 可見，泄殖腔棉拭子檢測為ALV p27 抗原陰性的樣品，蛋清檢測也均為陰性，且泄殖腔棉拭子陽性率（66.67%）仍遠(yuǎn)高于對(duì)應(yīng)母雞所產(chǎn)蛋的蛋清陽性率（6.67%）。

表3 泄殖腔棉拭子與蛋清p27 抗原ELISA 檢測結(jié)果比對(duì)

2.2 血漿與其他樣品比對(duì)

2.2.1 血漿與蛋清樣品 挑選蛋清p27 抗原ELISA 檢測為陽性的母雞62 只，即蛋清陽性率為100%，然后采集對(duì)應(yīng)母雞血漿，病毒分離后檢測p27 抗原，發(fā)現(xiàn)陽性率僅為29.03%（表4）。

表4 血漿與蛋清p27 抗原ELISA 檢測結(jié)果比對(duì)

2.2.2 血漿與精液 由表5 可見，血漿p27 抗原ELISA 檢測陽性率為9.00%，精液陽性率為3.50%，精液、血漿雙陽性的樣品僅有2 份，即同一只公雞的血漿和精液也存在不同檢測結(jié)果。

表5 血漿與精液p27 抗原ELISA 檢測結(jié)果比對(duì)

2.3 蛋清與胎糞比對(duì)

蛋清檢測陽性樣品對(duì)應(yīng)母雞所產(chǎn)的2 只同胞雛雞的胎糞中，有1 份胎糞陽性便記為相同陽性。蛋清的p27 抗原陽性率為20.0%，略低于同胞雛雞的胎糞陽性率（26.7%），8 份胎糞陽性中有6 份與同胞蛋清為相同陽性，陽性符合率75%，詳見表6。從結(jié)果可以看出，不僅蛋清和胎糞的陽性率接近，兩者間的陽性符合率也高，說明蛋清樣品和同胞雛雞胎糞間檢測結(jié)果的相關(guān)性強(qiáng)。

表6 蛋清與胎糞（同胞雛雞）p27 抗原ELISA 檢測結(jié)果比對(duì) 單位：份

2.4 檢測結(jié)果顯著性分析

被檢樣品中的p27 抗原含量可通過ELISA檢測S/P值來表示，對(duì)各類樣品ELISA 檢測S/P值進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（配對(duì)t 檢驗(yàn)），發(fā)現(xiàn)泄殖腔棉拭子與其他樣品間差異均為極顯著（P＜0.01），血漿與蛋清、胎糞樣品間差異均為極顯著（P＜0.01），蛋清與胎糞樣品間差異顯著（P＜0.05），說明樣品間很難相互替代，詳見表7。

表7 不同樣品間p27 抗原ELISA 檢測結(jié)果顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

泄殖腔棉拭子ALV p27 抗原ELISA 檢測具有便于收集，簡單易操作等優(yōu)點(diǎn)，但據(jù)相關(guān)報(bào)道[6]，相對(duì)于血漿病毒分離法，不同類型雞泄殖腔棉拭子ALV p27 抗原檢測法存在很高的假陽性率和漏檢率。針對(duì)此問題，本研究對(duì)泄殖腔棉拭子與血漿、精液、蛋清等不同樣品的檢測結(jié)果分別作了對(duì)應(yīng)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，泄殖腔棉拭子p27 抗原ELISA 檢測為陰性的雞只，其他樣品檢測也均為陰性，但是泄殖腔棉拭子樣品的陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他樣品，且雞只不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，這與文獻(xiàn)[6]結(jié)果一致。推測原因應(yīng)為，泄殖腔中的非特異性成分影響了檢測準(zhǔn)確性，造成該類樣品檢測的“假陽性率”高。因此，僅依靠泄殖腔棉拭子檢測實(shí)施凈化會(huì)造成雞群淘汰率過高，既不科學(xué)也不經(jīng)濟(jì)，即不建議以泄殖腔棉拭子作為主要檢測樣品。

AL 凈化監(jiān)測中，始終困擾人們的是一般檢測手段無法區(qū)別內(nèi)源性ALV（指可整合進(jìn)染色體基因組的ALV，一般為可通過染色體垂直傳播的E亞型，通常致病性很弱），當(dāng)前能解決這一問題的方法是使用DF-1 細(xì)胞系對(duì)ALV 進(jìn)行分離培養(yǎng)。該細(xì)胞系對(duì)內(nèi)源性ALV 有抗性，僅可有效培養(yǎng)出外源性病毒（指不會(huì)通過染色體傳遞的ALV，包括A、B、C、D 和J 亞型，致病性強(qiáng)，雞群中以A、B 和J 亞型常見，凈化ALV 以外源性病毒為主）。用血漿樣品或組織研磨過濾樣品接種DF-1 細(xì)胞，培養(yǎng)9 d 后，使用商品化ELISA 試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中p27 特異性抗原[7]，這種聯(lián)合檢測方法科學(xué)、可靠，可作為方法比較的評(píng)判基準(zhǔn)之一。

感染禽可通過精液排出ALV，因此在凈化第一世代群體內(nèi)呈現(xiàn)一定陽性。同樣地，母雞會(huì)通過輸卵管不定期排毒造成蛋清陽性，蛋清樣品檢測同樣是凈化AL 的經(jīng)典方法。有研究[8]顯示，種雞群種蛋p27 抗原檢出率與種雞群及其孵化后雞群ALV 感染情況具有較好的相關(guān)性和吻合性。在本研究中，對(duì)血漿病毒分離陽性母雞所產(chǎn)蛋進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其蛋清p27 檢測陽性率為29.03%；將血漿與公雞相應(yīng)精液進(jìn)行同步病毒分離，結(jié)果血漿樣品檢測陽性率（9.00%）略高于精液（3.50%）。這說明出現(xiàn)病毒血癥的感染母雞或公雞，其生殖系統(tǒng)并非長期排毒，存在隨機(jī)排毒現(xiàn)象。同樣從表4～5 可見，蛋清、精液為陽性的樣品，其血漿檢測未必為陽性，說明病毒血癥和生殖系統(tǒng)排毒并非同步?？傊?，血漿樣品檢測雖然科學(xué)、可靠，但因ALV 排毒特性，無法替代蛋清、精液樣品檢測，僅依賴血漿檢測這一種方法會(huì)造成漏檢現(xiàn)象。此外，因1 日齡雛雞血漿采集量不能滿足檢測要求，所以血漿未與胎糞樣品做比對(duì)。

本次比對(duì)中，雛雞胎糞p27 抗原ELISA 檢測陽性率（26.7%）略高于蛋清（20.0%），但胎糞和蛋清的陽性符合率較高。早期感染雛雞終生帶毒，如不盡早淘汰，對(duì)于雞群凈化狀態(tài)的負(fù)面影響巨大。雛雞孵化時(shí)，內(nèi)源性ALV 表達(dá)較少，故胎糞檢測對(duì)于雞群凈化狀態(tài)評(píng)估具有重要意義。胎糞檢測陽性率略高，可能與胎糞樣品中含有的非特異性成分較多有關(guān)。

在ALV 凈化檢測中，血漿、精液、胎糞、蛋清等不同樣品各有其應(yīng)用局限性：血漿樣品需要采集自病毒血癥期間，精液和蛋清樣品檢測依賴于生殖系統(tǒng)隨機(jī)排毒，胎糞樣品對(duì)時(shí)效性要求嚴(yán)格，須在雛雞出生24 h 內(nèi)采集。而且，因血漿和精液樣品病毒含量不足，需要經(jīng)過病毒分離培養(yǎng)后檢測，這對(duì)大批量細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要求較高。在實(shí)際應(yīng)用中，為了提高單世代感染動(dòng)物的檢出率，建議在實(shí)施凈化的第一世代雞群中，采取全群采集公雞血漿、精液和母雞血漿的檢測方法，聯(lián)合采集初產(chǎn)蛋蛋清、雛雞胎糞等樣品，對(duì)雞群的出殼、育雛、開產(chǎn)、留種等生產(chǎn)階段關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測，凈化3～4 個(gè)世代后，再采用按比例抽查的維持凈化檢測方案，從而達(dá)到科學(xué)、經(jīng)濟(jì)、高效的整體凈化效果。