四種牛結(jié)節(jié)性皮膚病抗體ELISA檢測試劑盒的比對

閉璟珊，趙鐘毅，呂 蕎，韋正吉，鄒聯(lián)斌，蘇姣秀，尹德煒，鄭 敏

（1.廣西動物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530000；2.廣西大學(xué)，廣西南寧 530004）

牛結(jié)節(jié)性皮膚?。╨umpy skin disease，LSD）是由牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起的病毒性傳染病，也稱為牛疙瘩皮膚病、牛結(jié)節(jié)疹和牛結(jié)節(jié)性皮膚炎，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報動物疫病[1]。LSDV 具備高度的宿主種屬特異性，主要感染牛和水牛，感染后臨床主要表現(xiàn)為體溫升高、消沉倦怠、淋巴結(jié)腫大、產(chǎn)奶量下降，最顯著的特征是皮膚（黏膜、器官）表面廣泛性結(jié)節(jié)和水腫。LSDV 還可導(dǎo)致原發(fā)和繼發(fā)性肺炎以及母牛流產(chǎn)，公牛暫時或永久不育，嚴重影響生產(chǎn)性能和經(jīng)濟價值，對養(yǎng)牛業(yè)危害巨大。1929年，贊比亞首次報道發(fā)生LSD。1988年LSD 向北傳播至埃及和以色列，隨后逐漸在亞歐大陸范圍內(nèi)傳播[2]。近年來LSD 流行速度加快，2019年8 月我國首次在新疆地區(qū)確診此病[3]。2020年6 月以后，該病在我國多個省份蔓延，給我國養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失。

目前，LSD 血清學(xué)檢測方法主要有病毒中和試驗（virus neutralization test，VNT）[4]、間接熒光抗體試驗[5]、瓊脂凝膠免疫擴散試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[6-7]。VNT 雖然是血清學(xué)檢測的金標準，其敏感性和特異性分別可達78%和97%，但需要操作活病毒，對實驗室條件和操作人員技能要求比較高，也無法滿足高通量檢測的需要[4]。ELISA 適合高通量檢測，且操作簡單，是日常檢測LSD 的常用方法。有研究[7-9]表明，ELISA 方法檢測結(jié)果與VNT 檢測結(jié)果較為一致，可以用于LSD 免疫抗體監(jiān)測和輔助免疫效果評價。

LSDV與山羊痘病毒（goatpox virus，GPV）、綿羊痘病毒（sheepox virus，SPV）同屬于痘病毒科羊痘病毒屬（Capripoxvirus）。這幾種病毒之間基因組同源性很高[4]，因此許多市售的商品化ELISA 試劑盒可用于上述3 種羊痘病毒屬成員抗體檢測。根據(jù)2020年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)的《牛結(jié)節(jié)性皮膚病防治技術(shù)規(guī)范》[10]，許多地區(qū)對牛進行了5 倍劑量的羊痘疫苗免疫。因此，通過檢測羊痘病毒屬特異性抗體水平評價牛群的感染情況和免疫效果，對防控LSD 具有重要參考作用。為篩選最為理想的血清抗體檢測方法，本研究嘗試對4 種市售的商品化LSD 抗體ELISA 檢測試劑盒進行分析對比，以期為同行開展LSDV 檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測試劑盒 A、B、C、D 等4 種商品化LSDV 抗體檢測試劑盒，由3 個廠家生產(chǎn)，分別購自其代理商。其中A、B 為國外兩家企業(yè)生產(chǎn)，C、D 為國內(nèi)某機構(gòu)研制生產(chǎn)。4 種試劑盒共涉及雙抗原夾心法、間接法以及競爭法3 種檢測原理。具體信息見表1。

表1 4 種LSDV 抗體ELISA 檢測試劑盒檢測原理和流程

1.1.2 血清、疫苗、細胞和病毒 LSDV 感染牛血清17 份，采集自廣西樂業(yè)縣、田林縣疫點發(fā)病黃牛；羊痘疫苗5 倍劑量免疫1 個月后的牛血清36 份，采集自廣西百色市右江區(qū)黃牛和廣西柳州市柳南區(qū)荷斯坦奶牛；羊痘疫苗正常劑量免疫1～3個月后的羊血清41 份，采集自廣西都安縣3 個黑山羊場；陰性牛血清20 份，采集自無LSDV 病史，也未接種羊痘疫苗的健康荷斯坦奶牛群。所有血清均由本實驗室采集，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。所接種羊痘疫苗（批號202008），購自哈藥集團生物疫苗有限公司；表達綠色熒光蛋白EGFP 的重組山羊痘病毒vTK-Eg，由本實驗室構(gòu)建并保存[11]；原代牛睪丸細胞，由金宇生物技術(shù)股份有限公司采用健康未免疫羊痘疫苗的荷斯坦小牛睪丸制備并惠贈，由本實驗室液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 儀器設(shè)備 全波長酶標儀，購自Tecan 公司；微量移液器，購自Eppendorf 公司；37 ℃普通恒溫箱，購自上海?，敼荆患毎囵B(yǎng)箱和EVOS FL 細胞成像系統(tǒng)，購自Thermofisher 公司。

1.2 中和抗體檢測

114 份血清樣本經(jīng)滅活處理后，利用重組病毒vTK-Eg 采用固定病毒稀釋血清法，在原代牛睪丸細胞上測定血清中和抗體。具體試驗步驟參照OIE《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》進行。

1.3 ELISA 抗體檢測

對上述114 份血清樣品，分別用4 種ELISA檢測試劑盒進行抗體檢測。操作步驟和結(jié)果判定，均按照相應(yīng)試劑盒內(nèi)說明書進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

以中和試驗數(shù)據(jù)為標準，計算4 種試劑盒的診斷敏感性（diagnostic sensitivity，Dse）、診斷特異性（diagnostic specitivity，Dsp）和符合率（agreement）。診斷敏感性計算公式：Dse=TP/（TP+FN）×100%；診斷特異性：Dsp=TN/（TN+FP）×100%；符合率=（TP+TN）/n×100%。其中，TP 表示真陽性（true positive），F(xiàn)N 表示假陰性（false negative），TN表示真陰性（true negative），F(xiàn)P 表示假陽性（false positive），n為樣本數(shù)量。進一步采用Kappa 檢驗評價試劑盒檢測結(jié)果的一致性，若Kappa 值＜0，則一致性為極差；若Kappa 值為0～0.20，則一致性為微弱；若Kappa 值為0.21～0.40，則一致性為弱；若Kappa 值為0.41～0.60，則一致性為中度；若Kappa 值為0.61～0.80，則一致性為高度；若Kappa 值為0.81～1.00，則一致性為極強。數(shù)據(jù)處理采用Excel 軟件，統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 軟件。

2 結(jié)果

2.1 重組病毒vTK-Eg 中和抗體檢測

熒光顯微鏡下觀察，在未加血清以及加入1:32 稀釋的陽性血清細胞孔中可以觀察到明亮呈黃綠色的病毒噬斑（圖1-A～B）；而加入1:16 以及1:8 稀釋的陽性血清細胞孔中觀察不到明亮呈黃綠色的病毒噬斑（圖1-C～D）。認為陽性血清1:16稀釋后已可完全中和重組病毒vTK-Eg，因此將中和抗體大于等于1:16 時判為陽性。

圖1 部分血清樣品VNT 結(jié)果（40×）

2.2 VNT 及ELISA 檢測結(jié)果統(tǒng)計

VNT 及4 種ELISA 試劑盒對114 份血清的檢測結(jié)果見表2～3。表2 顯示，ELISA 試劑盒檢測結(jié)果與VNT 檢測結(jié)果存在一定差異，而且4 種試劑盒檢測結(jié)果也不完全一致。其中，17 份感染牛血清、36 份免疫牛血清、41 份免疫羊血清和20 份陰性血清，用試劑盒A 分別檢出8、15、22 和2 份中和抗體陽性樣品；用試劑盒B 分別檢出4、7、16 和0 份中和抗體陽性樣品；用試劑盒C 分別檢出9、24 和0 份中和抗體陽性樣品；用試劑盒D 分別檢出11、20、14 和0 份中和抗體陽性樣品。20 份陰性血清的VNT 檢測結(jié)果顯示全部為陰性，試劑盒B、C、D 的檢測結(jié)果也全部為陰性，僅有試劑盒A 檢出2 份陽性。

表2 VNT 與4 種ELISA 試劑盒檢測結(jié)果 單位：份

表3 顯示，114 份血清中，經(jīng)VNT 檢測為陽性的共有61 份，經(jīng)試劑盒A 檢測為陽性的37 份，試劑盒B 檢測為陽性的23 份，試劑盒C 檢測為陽性的24 份，試劑盒D 檢測為陽性的42 份。

表3 VNT 與4 種ELISA 試劑盒檢測結(jié)果比較 單位：份

以VNT 結(jié)果作為金標準，分別計算4 種試劑盒的診斷敏感性、診斷特異性、符合率和Kappa 值，結(jié)果見表4。從診斷特異性看，4 種試劑盒特異性均能達到80%以上，其中試劑盒B 和D 的特異性達到90%以上。從診斷敏感性看，4 種試劑盒的敏感性均低于80%，其中試劑盒B 的敏感性低于40%，試劑盒C 的敏感性略高于70%。從符合率上看，試劑盒C、D 的符合率均達到80%，試劑盒B 的符合率較低，僅為63.16%。

表4 4 種ELISA 試劑盒各項指標評價結(jié)果

3 討論

羊痘病毒感染主要引起細胞免疫，但研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，無論癥狀是否明顯，從LSDV 自然感染中康復(fù)的動物均能產(chǎn)生包括中和抗體在內(nèi)的特異性抗體，能夠中和病毒并對再次感染具有抵抗力。LSD疫情在我國的發(fā)生，給養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大威脅。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)的《牛結(jié)節(jié)性皮膚病防治技術(shù)規(guī)范》[10]要求，疫情所在縣和相鄰縣可采用國家批準的山羊痘疫苗，按山羊的5 倍劑量對全部牛只進行免疫。如何評價免疫牛群的保護性抗體水平，是否可通過監(jiān)測抗體水平確定LSD 在非免疫牛群中的流行情況，成為LSD 防控工作的重要問題。目前市場上已有多個檢測LSD 抗體的ELISA 試劑盒在銷售，本研究對其中4 種LSD 抗體ELISA 檢測試劑盒進行了評估，力爭使檢測結(jié)果能夠充分反映樣品的真實情況，體現(xiàn)動物群體的抗體水平，為免疫效果評價及防控策略制定和優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持。

根據(jù)Kappa 一致性檢驗結(jié)果判定標準，Kappa值越大，兩者一致性越高，表明結(jié)果的可靠程度就越高。對4 種試劑盒的Kappa 值分析可得出，試劑盒A 與VNT 的一致性為中等，而試劑盒B 的一致性為弱，試劑盒C、D 的一致性為高度。本試驗中，4 種試劑盒敏感性均低于80%，診斷特異性均在80%以上，最高達94%。Milovanovi? 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，以VNT 結(jié)果為金標準，IDVET 公司研發(fā)的IDScreen? Capripox double antigen Multi-species ELISA kit 敏感性和特異性分別為91%和87%。而本研究結(jié)果與之有較大差距，其原因可能與我國免疫的是國產(chǎn)山羊痘疫苗毒株AV41 而非LSD Neethling 毒株有關(guān)，也與國內(nèi)外動物群體免疫背景不同需重新優(yōu)化判定標準有關(guān)。

值得一提的是，在檢測免疫了羊痘疫苗的羊血清時，試劑盒A 的檢出率較高；但在檢測牛血清（感染牛血清和免疫牛血清）時，試劑盒A、B的檢出率都不高。與之相反，試劑盒C、D 在檢測牛血清（感染牛血清和免疫牛血清）時檢出率較高，而試劑盒C 在檢測羊血清時檢出率為0（數(shù)據(jù)未顯示）。這可能是不同試劑盒包被的抗原來源和酶標二抗不同，造成樣品類型和檢測對象的不同所導(dǎo)致。

LSD 于2019年傳入我國，尚未有針對該病原的陽性血清[14]，所以只能通過收集臨床樣品檢測抗體水平，以此開展對試劑盒的評估?？紤]到生物安全問題，本研究利用了本課題組之前以山羊痘弱毒疫苗毒株AV41 構(gòu)建的重組山羊痘病毒vTK-Eg進行中和試驗。OIE 也推薦用羊痘病毒替代LSDV開展中和抗體測定[7]。該病毒攜帶EGFP 綠色熒光蛋白，便于在熒光顯微鏡下觀察細胞病變[10]。本研究選取的免疫牛血清采集自羊痘疫苗免疫1 個月后的牛，此時抗體水平尚未上升到高位，樣品陽性少、陰性多的檢測結(jié)果可能對試劑盒的實驗結(jié)果分析產(chǎn)生影響，使之出現(xiàn)偏差。另外，由于樣本數(shù)量限制，本次試驗并未對試劑盒批次間穩(wěn)定性進行評價，在實際應(yīng)用中仍有必要對試劑盒穩(wěn)定性進行進一步評測。

依據(jù)本研究結(jié)果，在檢測LSD 抗體時，國產(chǎn)試劑盒C、D 在各項評價指標上表現(xiàn)相對較好，而進口試劑盒A、B 可能更適合于其他羊痘病毒屬成員抗體檢測。結(jié)果提示，在開展羊痘病毒屬抗體檢測時，應(yīng)根據(jù)實際情況合理選擇試劑盒，以保證檢測結(jié)果的準確性。