兩種禽白血病病毒檢測(cè)方法的對(duì)比

王樹艷，沈前程，陳智武，凌 丁，粟永春

（1.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530007；2.廣西金陵農(nóng)牧集團(tuán)有限公司，廣西南寧 530049）

禽白血?。╝vian leukosis）是由反錄病毒科、禽C型反錄病毒群禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，是一種重要的免疫抑制性疫病，可造成感染雞群免疫抑制、抵抗力降低、生產(chǎn)性能下降等多種危害[1]。ALV 具有垂直傳播特性，感染雞群隨著繁育有感染加劇情況[2]。近年來，雞群ALV 感染和臨床暴發(fā)次數(shù)增加，混合感染嚴(yán)重[3]。

目前防控該病沒有有效的疫苗和藥物。實(shí)施種禽ALV 凈化是控制該病的最根本方法。改進(jìn)ALV 分離過程和提高檢出率，能夠加快ALV 凈化進(jìn)展，降低企業(yè)凈化投入，對(duì)ALV 凈化起到積極的推動(dòng)作用。ALV 檢測(cè)的常規(guī)法是通過離心分離血漿，然后接種于DF-1細(xì)胞來檢測(cè)的方法，是分離、檢測(cè)ALV 最準(zhǔn)確、最標(biāo)準(zhǔn)的方法[4-5]，而改進(jìn)法則是通過自然沉淀分離血漿來檢測(cè)。本試驗(yàn)對(duì)比了離心分離和自然沉淀血漿兩種方法對(duì)DF-1 細(xì)胞以及ALV 檢出率的影響，以期為提高ALV 檢出率提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

隨機(jī)選擇94 只225 日齡某公司淘汰公雞，每只采集2.0 mL 血液，分別注入2 支肝素鈉抗凝管（1.0 mL/管）中，分A、B 兩組，顛倒混勻，分別標(biāo)識(shí)（A1—A94、B1—B94）。其中A 組（改進(jìn)法）抗凝血在室溫自然沉淀2 h，B 組（常規(guī)法）常規(guī)離心，待抗凝血分層后，2～8 ℃冷藏備用。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)8120281），GIBCO 公司產(chǎn)品；胎牛血清（批號(hào)20050504），浙江天杭生物科技股份有限公司產(chǎn)品；DF-1 細(xì)胞，哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)；DMSO（批號(hào)1029B031），北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；肝素鈉抗凝管（批號(hào)191102），江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；禽白血病P27 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)JS774），IDEXX 公司產(chǎn)品。

二氧化碳培養(yǎng)箱，BPN150CW（uv）型，上海一恒科學(xué)食品有限公司產(chǎn)品；生物安全柜，BSC-1304IIA2型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，F(xiàn)C型，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，BM-37XBC型，上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 樣本處理 A 組抗凝血樣本在室溫條件下靜置2 h，B 組樣本3 000 r/min，離心5 min，使抗凝血中的血漿和細(xì)胞分層。

1.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮中復(fù)蘇DF-1 細(xì)胞，加入10%胎牛血清DMEM 高糖培養(yǎng)基，放入5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h；用5%的胎牛血清培養(yǎng)液調(diào)成細(xì)胞密度為6×106個(gè)/mL 的懸液，接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔，待細(xì)胞貼壁、形態(tài)健康、密度合適（70%鋪滿孔底）時(shí)，進(jìn)行血漿接種。

1.3.3 細(xì)胞接種與培養(yǎng) 取出處理后的樣本，室溫下放置2 h。A 組：吸取樣本上清，接種96 孔細(xì)胞板中，30 μL/孔，放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱4 h，觀察細(xì)胞形態(tài)后，再加入100 μL/孔的DMEM 高糖培養(yǎng)基，放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)7 d；B 組：按常規(guī)方法[4]接種96 孔細(xì)胞板中，30 μL/孔，放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，觀察細(xì)胞形態(tài)后，吸去液體，隨后用PBS 清洗1 次，每孔加入230 μL 1%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基（維持液），最后放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)7 d。

1.3.4 樣本檢測(cè) 將培養(yǎng)7 d 后的細(xì)胞樣本，從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，吸出每孔中的上清，再用PBS液清洗2 次/孔；加入PBS 液200 μL/孔，放入-20 ℃冰箱中，待培養(yǎng)液結(jié)冰后取出，室溫解凍，按該方法進(jìn)行3 次凍融。按照禽白血病ELISA P27檢測(cè)試劑操作要求和判定標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)培養(yǎng)上清中ALV P27 抗原。

1.3.5 凈化 使用改進(jìn)法在某場(chǎng)的A、B 兩個(gè)品種雞群中開展ALV 凈化檢測(cè)。在第一世代產(chǎn)蛋前開展3 次ALV 細(xì)胞分毒檢測(cè)，每品種抽檢初產(chǎn)蛋184 枚；在第二世代胎糞、血漿和初產(chǎn)蛋中分別抽檢ALV，評(píng)估凈化效果。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

將不同處理方法的檢測(cè)結(jié)果，使用SPSS 軟件進(jìn)行對(duì)比分析，以P＜0.05 判定為差異顯著，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)

結(jié)果（圖1）顯示：A 組接種血漿4 h 后，DF-1 細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞觸角明顯；B 組細(xì)胞間隙均勻，擴(kuò)大不明顯，細(xì)胞觸角明顯。培養(yǎng)7 d 后，A 組細(xì)胞呈細(xì)絲狀，布滿孔底，1.0%孔邊緣有細(xì)胞層脫落；B 組細(xì)胞呈細(xì)絲狀，10.0%孔邊緣有細(xì)胞層脫落，孔底有小空洞。結(jié)果表明，A 組細(xì)胞狀態(tài)優(yōu)于B 組。

圖1 接種后細(xì)胞狀態(tài)（160×）

2.2 P27 抗原檢測(cè)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表1～2）顯示：A 組在B 組的陰性樣本中檢出8 份陽(yáng)性樣本。A 組檢出率35.11%（33/94），B 組檢出率28.72%（27/94），A 組比B 組檢出率高6.39%，而兩組的OD 值無顯著差異（P＞0.05）。A 組靈敏度（真陽(yáng)性率）=25/（25+8）×100%=75.76%，特異性（真陰性率）=59/（59+2）×100%=96.72%；B 組靈敏度=25/（25+2）=92.59%，特異性=59/（59+8）=88.06%。

表1 不同處理方法的ALV 檢測(cè)結(jié)果符合情況對(duì)比

表2 不同處理方法的ALV 檢出率對(duì)比

2.3 凈化效果

對(duì)A 和B 品種雞群采用優(yōu)化后的細(xì)胞分毒方法，在第一世代3 次血漿分毒后，第二世代血漿ALV 檢出率比第一世代首次檢出率分別下降了86.40%和87.85%。第二世代胎糞ALV 檢出率平均為1.06%，蛋清檢出率平均為0.31%，基本實(shí)現(xiàn)了ALV 在雞群中的凈化（表3）。

表3 不同品種凈化效果（ALV 檢出率） %

3 討論

3.1 血漿樣本處理

從雞血漿中分離血清檢測(cè)ALV 是目前最常用的檢測(cè)方法之一[3]。采集后的抗凝血需要處理后才能接種DF-1 細(xì)胞。抗凝血的處理方法多種多樣，其中離心法是常用的方法。依據(jù)血漿中不同成分的密度，通過離心快速實(shí)現(xiàn)抗凝血不同成分的分層，大致分為上層血清、下層紅細(xì)胞層，中間白細(xì)胞層。少量樣本時(shí)，離心法是快速方便的分離血漿方法。鑒于ALV凈化過程中需要處理大量的抗凝血樣本，使用離心方法耗費(fèi)大量人力和時(shí)間，因此本試驗(yàn)通過抗凝血靜置的方法實(shí)現(xiàn)抗凝血不同成分的分層。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)

DF-1 細(xì)胞由于能夠區(qū)分內(nèi)源性和外源性的ALV，是其凈化的常用細(xì)胞系[6]。DF-1 細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)、樣本類型都會(huì)影響ALV 在細(xì)胞內(nèi)的增殖，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在維持培養(yǎng)時(shí)，改進(jìn)法培養(yǎng)液中含有雞血漿，使DF-1 細(xì)胞的狀態(tài)和維持時(shí)間均好于常規(guī)培養(yǎng)。這可能是由于血漿中含有白細(xì)胞和血小板等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，會(huì)有助于DF-1 細(xì)胞的生長(zhǎng)和維持。梁鞏等[7]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)加入同一種動(dòng)物的血清成分有利于細(xì)胞培養(yǎng)，其中驢血清比胎牛血清更有利。

3.3 ALV 檢出率

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A 組檢出率高于B 組6.39%。ALV 凈化過程中，血漿中病毒檢出情況直接影響凈化效果。不同處理方法會(huì)直接影響檢出率。改進(jìn)法提高檢出率的原因：其一，培養(yǎng)液中含有雞血漿可使DF-1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和維持時(shí)間比常規(guī)培養(yǎng)方法優(yōu)秀，利于病毒增殖；其二，改進(jìn)處理收獲的血漿中含有的白細(xì)胞更豐富，病毒含量更多，利于病毒感染。本試驗(yàn)為提高ALV 的檢出率提供了一種新思路。

3.4 品種凈化

ALV 凈化是一個(gè)長(zhǎng)期的過程，一般需要4～5個(gè)世代的檢測(cè)才能達(dá)到凈化水平（檢出率小于0.2%）[8]。ALV 凈化方案多樣，通過1 日齡胎糞、初期或留種前種蛋蛋清、父系公雞血漿和精液病毒分離等方法均可實(shí)現(xiàn)凈化[9]。樣本不同檢測(cè)ALV的方法也多種多樣，如PCR 方法更適合組織樣本病料進(jìn)行臨床可疑樣本診斷；免疫熒光試驗(yàn)（IFA）則在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用較多；細(xì)胞分毒檢測(cè)主要應(yīng)用于大量樣本鑒別檢測(cè)，如雞群ALV 凈化等[10]。

ALV 的細(xì)胞分毒過程對(duì)于凈化效果有重要意義。本試驗(yàn)采用改進(jìn)法進(jìn)行ALV 檢測(cè)和凈化，2個(gè)世代后的蛋清ALV 檢測(cè)陽(yáng)性率平均為0.31%，證明檢測(cè)凈化方案效果顯著，可基本實(shí)現(xiàn)ALV凈化。

4 結(jié)論

在檢測(cè)ALV 過程中，改進(jìn)后的血漿樣本處理方法和病毒分離過程，能夠提高樣本的ALV 檢測(cè)效率，從而加快凈化進(jìn)程。