副溶血弧菌T3SS1 VscF蛋白多肽抗體的制備與應用

薛婷月，廉樂樂，李婉君，薛 峰

（南京農業(yè)大學動物健康與食品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇南京 210095）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）為革蘭氏陰性菌，其感染途徑主要是食入生或未烹飪完全的海產品[1]。III型分泌系統(tǒng)（type III secretion system，T3SS）是高度組織化的多蛋白納米機器[2-4]，包括結構蛋白、分泌蛋白以及伴侶蛋白等，在多種革蘭氏陰性菌致病過程中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，多數副溶血弧菌臨床分離株含有兩套T3SS[5]，包括位于1 號染色體的T3SS1 和位于2 號染色體的T3SS2，其分別表現(xiàn)細胞毒性與腸毒性[6]。T3SS1 是副溶血弧菌的重要毒力因子，但其致病機制尚未被闡明。

T3SS 要將具有毒性作用的效應蛋白輸送到細胞內起作用，最關鍵的一步就是要先分泌并組裝成具有運輸功能的分泌器裝置，且只有與分泌器頂端的兩個疏水性轉位蛋白結合才能激活輸送作用[7]，而針狀蛋白在其中扮演著很重要的角色[8-9]。有關學者研究發(fā)現(xiàn)，在大多數革蘭氏陰性細菌中，菌體可將自身分泌的6 kD 左右的單體針蛋白聚合成細胞外針狀組分，從而協(xié)助菌體穿透真核質膜而形成效應子易位的分泌管道[10-12]。

vscF基因編碼的VscF蛋白是T3SS1 的針狀蛋白。本研究利用生物學軟件分析預測針狀蛋白VscF 線性抗原表位并選擇最優(yōu)多肽序列送至公司合成，然后與具有高度免疫原性的KLH蛋白偶聯(lián)，制備針對VscF蛋白的特異性多克隆抗體，旨在縮短常規(guī)抗原蛋白表達純化所需時間，獲得VscF 特異性多克隆抗體，為后續(xù)VscF 相關蛋白互作研究提供必要的抗體基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

MBS 交 聯(lián) 劑（Maleimide-benzoic acid Nhydroxysuccinimide ester），購自大連美侖生物技術有限公司；KLH 載體蛋白（Keyhole Limpet Hemocyanin），購自南京偉沃生物科技有限公司；DMF（N，N-二甲基甲酰胺），購自生工生物工程股份有限公司；PD-10 預裝柱、ECL 顯色液，購自GE Healthcare Life Science；VscF 肽段，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、TMB 單組分顯色液、PVDF 膜，均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；HRP-羊抗兔IgG 抗體，購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司；FITC 標記山羊抗兔Ig G（H+L），購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 VscF 多肽抗原表位篩選并合成 在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫檢索副溶血弧菌VscF蛋白序列ID，并在OptimumAntigenTM軟件輸入后檢索設計VscF 抗原多肽。綜合考慮序列長度、親水性/疏水性、表面定向性、靈活性等因素，選擇最優(yōu)多肽序列送金斯瑞生物公司合成。

1.2.2 MBS 法偶聯(lián)KLH 載體蛋白制備抗原KLH蛋白溶于10 mmol/L PBS 至終質量濃度為10 mg/mL，4 ℃冰箱透析過夜備用。MBS 溶解于DMF 至終質量濃度為10 mg/mL。KLH 與MBS 以10:1 的體積比混合，室溫孵育30 min 后過PD-10層析柱；緩慢加樣，PB 緩沖液洗脫，收集活化的KLH 于EP 管中；將多肽溶解于PBS 并等體積與活化的KLH混合，室溫孵育3 h，4 ℃透析過夜備用。

1.2.3 免疫新西蘭兔制備多克隆抗體 將偶聯(lián)KLH 的VscF 多肽混合物與弗氏完全佐劑等體積混合，分別皮下注射免疫2 只4 月齡新西蘭大白兔，在一免后21、35 d，將制備好的抗原與弗氏不完全佐劑混合進行2 次加強免疫，每次免疫劑量為200 μg/只；三免15 d 后心臟采血，分離血清獲取多克隆抗體，測定抗體效價。

1.2.4 間接ELISA 測定多克隆抗體效價 采用間接免疫法檢測VscF 抗體效價，將抗原多肽用包被液稀釋成4 μg/ mL，每孔100 μL 包被酶標板，4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌3 次，10 min/次；5%脫脂乳室溫（25 ℃）封閉2 h，PBST 洗滌3 次，10 min/次；將上述制備的多克隆抗體血清用PBS進行倍比稀釋，分別為1:1 000、1:2 000、1:4 000等，混勻后以100 μL/孔加入酶標板中，陰性血清作為空白對照，室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次，10 min/次；向每孔中加入100 μL 經1:5 000 稀釋的酶標二抗（山羊抗兔-HRP），置于37 ℃恒溫箱1 h，PBST 洗板3 次；每孔加入100 μL TMB顯色液，置于37 ℃顯色 15 min；加入100 μL 2 mol/L HCl 終止反應，即刻在酶標儀上讀取OD450吸光值。將陽性OD450/陰性OD450≥2.1（即P/N≥2.1）時所對應的最高稀釋倍數作為抗VscF 血清效價。

1.2.5 免疫印跡法檢測VscF 多抗特異性 將實驗室保存的VscF 原核表達蛋白進行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，300 mA 轉60 min 至PVDF 膜，將實驗室保存的VopS 與CyaA蛋白為陰性對照，后續(xù)封閉與洗脫參考抗體效價檢測。此處陽性抗體稀釋度選擇1:2 000，ECL 顯色液曝光。

1.2.6 多克隆抗體應用 將副溶血弧菌野生株與ΔvscF缺失株接種至含3%氯化鈉的LB 液體培養(yǎng)基，（36±1）℃培養(yǎng)至對數期，1×PBS 洗2～3 次，涂抹到載玻片上，風干，5% BSA 封閉1 h；加入VscF 多克隆抗體（稀釋度1:2 000），4 ℃孵育過夜；1×PBS 洗3～5 次，使用FITC 標記山羊抗兔Ig G（H+L）（稀釋度1:500），室溫孵育1 h；1×PBS 洗3～5 次，使用熒光倒置顯微鏡觀察熒光陽性情況及定位。

2 結果與分析

2.1 VscF 多肽抗原表位篩選

利用OptimumAntigenTM軟件分析VscF蛋白序列各參數，發(fā)現(xiàn)VscF蛋白的抗原決定簇位于前半段多肽序列，而其他部位為跨膜區(qū)域（圖1）。分析結果（表1）顯示，篩選出3 條多肽，最終選擇2 號肽段由相關生物公司合成。

表1 抗原多肽設計結果

圖1 VscF蛋白序列抗原表位篩選及相關特性分析結果

2.2 多克隆抗體效價檢測

間接ELISA 法檢測3 次免疫后新西蘭兔血清中的VscF 抗體效價。檢測結果（圖2）顯示，在稀釋度為1:512 000 時，P/N（0.363/0.170）＞2.1，表明抗體效價為1:512 000。

圖2 抗VscF 血清效價檢測結果

2.3 抗體特異性檢測

采用Western Blot 法檢測血清抗體對原核表達VscF蛋白抗原抗體反應的特異性，經SDS-PAGE電泳分離，考馬斯亮藍染色，發(fā)現(xiàn)1～4 號均有蛋白樣品存在（圖3-A）；ECL 曝光結果顯示，血清抗體1:2 000 稀釋后與VscF蛋白發(fā)生特異性反應，而其他對照組未出現(xiàn)顯色條帶（圖3-B），表明產生的多肽抗體具有VscF蛋白特異性，能夠準確檢測VscF蛋白。

圖3 VscF 抗體特異性檢測結果

2.4 多克隆抗體應用

制備的多克隆抗體可通過免疫熒光來鑒定針狀蛋白VscF 在副溶血弧菌野生株（WT）與ΔvscF缺失株中的表達情況。經誘導后的野生株表達針狀蛋白VscF 與VscF 多克隆抗體發(fā)生特異性反應，可見紅色箭頭標示的綠色熒光（圖4），而對照組ΔvscF則無法檢測到綠色熒光，表明VscF 多克隆抗體具有較好的反應性和特異性，可用于針狀蛋白VscF 后續(xù)研究。

圖4 免疫熒光染色測定VscF 多克隆抗體的反應性和特異性結果

3 討論

副溶血弧菌T3SS1 的研究主要包括效應蛋白與結構組裝兩個方面。已經發(fā)現(xiàn)的效應蛋白有VopQ[13-14]、VopS[15]、VPA0450[16-17]、VopR[18]，其均與細胞毒性有關。目前對T3SS1 特有的注射體結構研究甚少。有報道顯示：VopB1（VP1657）、VopD1（VP1656）[19]是與效應蛋白轉位相關的結構蛋白；VscI（VP1691）[20]與 YscI/HrpB 家族多個蛋白同源，參與效應蛋白的易位過程；VscF[21]與志賀氏菌MixH、耶爾森氏菌YscF 同源，以單體形式參與組成T3SS1 胞外針狀復合體。有報道[22-23]稱，耶爾森菌T3SS 針狀復合體可為效應蛋白運輸提供結構基礎。此外：Cao 等[24]在耶爾森菌屬中發(fā)現(xiàn)，YscI 通過直接與YscF 相互作用參與了針狀結構的組裝；Souza 等[25]證明，YscF 在細菌細胞質中的穩(wěn)定與伴侶蛋白YscE和YscG 有關，YscF、YscE 和YscG 形成可溶的異三聚體復合物，可防止YscF 在細菌細胞質內聚合。而副溶血弧菌T3SS1 針狀蛋白VscF 特異性多肽抗體的制備，為進一步研究副溶血弧菌T3SS1 針狀復合體的分泌組裝機制奠定了基礎。此方面相關研究比較全面，還包括針狀單體蛋白聚合方式、針體尺寸、針體長度調控與分泌誘導方式以及復合體中相關蛋白的互作和整個結構的組裝模式預測[26-28]。

制備多克隆抗體通常使用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，對抗原蛋白或者肽段進行表達與純化[29-30]，后續(xù)免疫動物，但是存在實驗周期長、蛋白表達不可溶和蛋白純度低等問題。本研究利用合成多肽制備多克隆抗體，與傳統(tǒng)方法相比，既縮短了構建載體與蛋白純化所需時間，又提高了蛋白純度。在綜合考慮序列長度、親水性/疏水性、表面定向性、靈活性等因素后，共篩選得到3 條備選多肽序列，其中2 號多肽序列位于N 端，更容易產生高性能抗體。最終生物合成了2 號多肽序列，偶聯(lián)KLH載體蛋白與免疫新西蘭兔后獲得多克隆抗體?？捡R斯亮藍染色結果表明，多抗純化效果較好，間接ELISA 效價比達1:512 000，顯示出VscF 多肽抗體具有良好的反應性。Western Blot 結果顯示，在25～35 kD 有一條特異性條帶；免疫熒光染色結果顯示，誘導后的野生株表達針狀蛋白VscF 可與VscF 多克隆抗體發(fā)生特異性反應。

綜上所述，副溶血弧菌T3SS1 針狀蛋白VscF多肽抗體制備成功，其反應性與特異性均良好，可作為VscF 驗證試驗中具有特異性結合作用的抗體，這為后續(xù)副溶血弧菌T3SS1 裝置組裝機制過程中的VscF 相關蛋白互作研究提供了抗體基礎。