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    副溶血弧菌T3SS1 VscF蛋白多肽抗體的制備與應(yīng)用

    2021-09-07 01:46:12薛婷月廉樂樂李婉君
    中國動物檢疫 2021年9期

    薛婷月,廉樂樂,李婉君,薛 峰

    (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物健康與食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210095)

    副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)為革蘭氏陰性菌,其感染途徑主要是食入生或未烹飪完全的海產(chǎn)品[1]。III型分泌系統(tǒng)(type III secretion system,T3SS)是高度組織化的多蛋白納米機(jī)器[2-4],包括結(jié)構(gòu)蛋白、分泌蛋白以及伴侶蛋白等,在多種革蘭氏陰性菌致病過程中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)副溶血弧菌臨床分離株含有兩套T3SS[5],包括位于1 號染色體的T3SS1 和位于2 號染色體的T3SS2,其分別表現(xiàn)細(xì)胞毒性與腸毒性[6]。T3SS1 是副溶血弧菌的重要毒力因子,但其致病機(jī)制尚未被闡明。

    T3SS 要將具有毒性作用的效應(yīng)蛋白輸送到細(xì)胞內(nèi)起作用,最關(guān)鍵的一步就是要先分泌并組裝成具有運(yùn)輸功能的分泌器裝置,且只有與分泌器頂端的兩個疏水性轉(zhuǎn)位蛋白結(jié)合才能激活輸送作用[7],而針狀蛋白在其中扮演著很重要的角色[8-9]。有關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌中,菌體可將自身分泌的6 kD 左右的單體針蛋白聚合成細(xì)胞外針狀組分,從而協(xié)助菌體穿透真核質(zhì)膜而形成效應(yīng)子易位的分泌管道[10-12]。

    vscF基因編碼的VscF蛋白是T3SS1 的針狀蛋白。本研究利用生物學(xué)軟件分析預(yù)測針狀蛋白VscF 線性抗原表位并選擇最優(yōu)多肽序列送至公司合成,然后與具有高度免疫原性的KLH蛋白偶聯(lián),制備針對VscF蛋白的特異性多克隆抗體,旨在縮短常規(guī)抗原蛋白表達(dá)純化所需時間,獲得VscF 特異性多克隆抗體,為后續(xù)VscF 相關(guān)蛋白互作研究提供必要的抗體基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    MBS 交 聯(lián) 劑(Maleimide-benzoic acid Nhydroxysuccinimide ester),購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;KLH 載體蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin),購自南京偉沃生物科技有限公司;DMF(N,N-二甲基甲酰胺),購自生工生物工程股份有限公司;PD-10 預(yù)裝柱、ECL 顯色液,購自GE Healthcare Life Science;VscF 肽段,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、TMB 單組分顯色液、PVDF 膜,均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;HRP-羊抗兔IgG 抗體,購自艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司;FITC 標(biāo)記山羊抗兔Ig G(H+L),購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 VscF 多肽抗原表位篩選并合成 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫檢索副溶血弧菌VscF蛋白序列ID,并在OptimumAntigenTM軟件輸入后檢索設(shè)計VscF 抗原多肽。綜合考慮序列長度、親水性/疏水性、表面定向性、靈活性等因素,選擇最優(yōu)多肽序列送金斯瑞生物公司合成。

    1.2.2 MBS 法偶聯(lián)KLH 載體蛋白制備抗原KLH蛋白溶于10 mmol/L PBS 至終質(zhì)量濃度為10 mg/mL,4 ℃冰箱透析過夜備用。MBS 溶解于DMF 至終質(zhì)量濃度為10 mg/mL。KLH 與MBS 以10:1 的體積比混合,室溫孵育30 min 后過PD-10層析柱;緩慢加樣,PB 緩沖液洗脫,收集活化的KLH 于EP 管中;將多肽溶解于PBS 并等體積與活化的KLH混合,室溫孵育3 h,4 ℃透析過夜備用。

    1.2.3 免疫新西蘭兔制備多克隆抗體 將偶聯(lián)KLH 的VscF 多肽混合物與弗氏完全佐劑等體積混合,分別皮下注射免疫2 只4 月齡新西蘭大白兔,在一免后21、35 d,將制備好的抗原與弗氏不完全佐劑混合進(jìn)行2 次加強(qiáng)免疫,每次免疫劑量為200 μg/只;三免15 d 后心臟采血,分離血清獲取多克隆抗體,測定抗體效價。

    1.2.4 間接ELISA 測定多克隆抗體效價 采用間接免疫法檢測VscF 抗體效價,將抗原多肽用包被液稀釋成4 μg/ mL,每孔100 μL 包被酶標(biāo)板,4 ℃孵育過夜,PBST 洗滌3 次,10 min/次;5%脫脂乳室溫(25 ℃)封閉2 h,PBST 洗滌3 次,10 min/次;將上述制備的多克隆抗體血清用PBS進(jìn)行倍比稀釋,分別為1:1 000、1:2 000、1:4 000等,混勻后以100 μL/孔加入酶標(biāo)板中,陰性血清作為空白對照,室溫孵育2 h,PBST 洗滌3 次,10 min/次;向每孔中加入100 μL 經(jīng)1:5 000 稀釋的酶標(biāo)二抗(山羊抗兔-HRP),置于37 ℃恒溫箱1 h,PBST 洗板3 次;每孔加入100 μL TMB顯色液,置于37 ℃顯色 15 min;加入100 μL 2 mol/L HCl 終止反應(yīng),即刻在酶標(biāo)儀上讀取OD450吸光值。將陽性O(shè)D450/陰性O(shè)D450≥2.1(即P/N≥2.1)時所對應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)作為抗VscF 血清效價。

    1.2.5 免疫印跡法檢測VscF 多抗特異性 將實(shí)驗(yàn)室保存的VscF 原核表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,300 mA 轉(zhuǎn)60 min 至PVDF 膜,將實(shí)驗(yàn)室保存的VopS 與CyaA蛋白為陰性對照,后續(xù)封閉與洗脫參考抗體效價檢測。此處陽性抗體稀釋度選擇1:2 000,ECL 顯色液曝光。

    1.2.6 多克隆抗體應(yīng)用 將副溶血弧菌野生株與ΔvscF缺失株接種至含3%氯化鈉的LB 液體培養(yǎng)基,(36±1)℃培養(yǎng)至對數(shù)期,1×PBS 洗2~3 次,涂抹到載玻片上,風(fēng)干,5% BSA 封閉1 h;加入VscF 多克隆抗體(稀釋度1:2 000),4 ℃孵育過夜;1×PBS 洗3~5 次,使用FITC 標(biāo)記山羊抗兔Ig G(H+L)(稀釋度1:500),室溫孵育1 h;1×PBS 洗3~5 次,使用熒光倒置顯微鏡觀察熒光陽性情況及定位。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 VscF 多肽抗原表位篩選

    利用OptimumAntigenTM軟件分析VscF蛋白序列各參數(shù),發(fā)現(xiàn)VscF蛋白的抗原決定簇位于前半段多肽序列,而其他部位為跨膜區(qū)域(圖1)。分析結(jié)果(表1)顯示,篩選出3 條多肽,最終選擇2 號肽段由相關(guān)生物公司合成。

    表1 抗原多肽設(shè)計結(jié)果

    圖1 VscF蛋白序列抗原表位篩選及相關(guān)特性分析結(jié)果

    2.2 多克隆抗體效價檢測

    間接ELISA 法檢測3 次免疫后新西蘭兔血清中的VscF 抗體效價。檢測結(jié)果(圖2)顯示,在稀釋度為1:512 000 時,P/N(0.363/0.170)>2.1,表明抗體效價為1:512 000。

    圖2 抗VscF 血清效價檢測結(jié)果

    2.3 抗體特異性檢測

    采用Western Blot 法檢測血清抗體對原核表達(dá)VscF蛋白抗原抗體反應(yīng)的特異性,經(jīng)SDS-PAGE電泳分離,考馬斯亮藍(lán)染色,發(fā)現(xiàn)1~4 號均有蛋白樣品存在(圖3-A);ECL 曝光結(jié)果顯示,血清抗體1:2 000 稀釋后與VscF蛋白發(fā)生特異性反應(yīng),而其他對照組未出現(xiàn)顯色條帶(圖3-B),表明產(chǎn)生的多肽抗體具有VscF蛋白特異性,能夠準(zhǔn)確檢測VscF蛋白。

    圖3 VscF 抗體特異性檢測結(jié)果

    2.4 多克隆抗體應(yīng)用

    制備的多克隆抗體可通過免疫熒光來鑒定針狀蛋白VscF 在副溶血弧菌野生株(WT)與ΔvscF缺失株中的表達(dá)情況。經(jīng)誘導(dǎo)后的野生株表達(dá)針狀蛋白VscF 與VscF 多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng),可見紅色箭頭標(biāo)示的綠色熒光(圖4),而對照組ΔvscF則無法檢測到綠色熒光,表明VscF 多克隆抗體具有較好的反應(yīng)性和特異性,可用于針狀蛋白VscF 后續(xù)研究。

    圖4 免疫熒光染色測定VscF 多克隆抗體的反應(yīng)性和特異性結(jié)果

    3 討論

    副溶血弧菌T3SS1 的研究主要包括效應(yīng)蛋白與結(jié)構(gòu)組裝兩個方面。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)蛋白有VopQ[13-14]、VopS[15]、VPA0450[16-17]、VopR[18],其均與細(xì)胞毒性有關(guān)。目前對T3SS1 特有的注射體結(jié)構(gòu)研究甚少。有報道顯示:VopB1(VP1657)、VopD1(VP1656)[19]是與效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)位相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白;VscI(VP1691)[20]與 YscI/HrpB 家族多個蛋白同源,參與效應(yīng)蛋白的易位過程;VscF[21]與志賀氏菌MixH、耶爾森氏菌YscF 同源,以單體形式參與組成T3SS1 胞外針狀復(fù)合體。有報道[22-23]稱,耶爾森菌T3SS 針狀復(fù)合體可為效應(yīng)蛋白運(yùn)輸提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。此外:Cao 等[24]在耶爾森菌屬中發(fā)現(xiàn),YscI 通過直接與YscF 相互作用參與了針狀結(jié)構(gòu)的組裝;Souza 等[25]證明,YscF 在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定與伴侶蛋白YscE和YscG 有關(guān),YscF、YscE 和YscG 形成可溶的異三聚體復(fù)合物,可防止YscF 在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚合。而副溶血弧菌T3SS1 針狀蛋白VscF 特異性多肽抗體的制備,為進(jìn)一步研究副溶血弧菌T3SS1 針狀復(fù)合體的分泌組裝機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。此方面相關(guān)研究比較全面,還包括針狀單體蛋白聚合方式、針體尺寸、針體長度調(diào)控與分泌誘導(dǎo)方式以及復(fù)合體中相關(guān)蛋白的互作和整個結(jié)構(gòu)的組裝模式預(yù)測[26-28]。

    制備多克隆抗體通常使用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng),對抗原蛋白或者肽段進(jìn)行表達(dá)與純化[29-30],后續(xù)免疫動物,但是存在實(shí)驗(yàn)周期長、蛋白表達(dá)不可溶和蛋白純度低等問題。本研究利用合成多肽制備多克隆抗體,與傳統(tǒng)方法相比,既縮短了構(gòu)建載體與蛋白純化所需時間,又提高了蛋白純度。在綜合考慮序列長度、親水性/疏水性、表面定向性、靈活性等因素后,共篩選得到3 條備選多肽序列,其中2 號多肽序列位于N 端,更容易產(chǎn)生高性能抗體。最終生物合成了2 號多肽序列,偶聯(lián)KLH載體蛋白與免疫新西蘭兔后獲得多克隆抗體??捡R斯亮藍(lán)染色結(jié)果表明,多抗純化效果較好,間接ELISA 效價比達(dá)1:512 000,顯示出VscF 多肽抗體具有良好的反應(yīng)性。Western Blot 結(jié)果顯示,在25~35 kD 有一條特異性條帶;免疫熒光染色結(jié)果顯示,誘導(dǎo)后的野生株表達(dá)針狀蛋白VscF 可與VscF 多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。

    綜上所述,副溶血弧菌T3SS1 針狀蛋白VscF多肽抗體制備成功,其反應(yīng)性與特異性均良好,可作為VscF 驗(yàn)證試驗(yàn)中具有特異性結(jié)合作用的抗體,這為后續(xù)副溶血弧菌T3SS1 裝置組裝機(jī)制過程中的VscF 相關(guān)蛋白互作研究提供了抗體基礎(chǔ)。

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