PAQR4在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其在細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用

康星凱，盧文勇，蔡慧欣，楊文軍

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽胰外科，浙江 溫州 32500）

肝細(xì)胞癌（HCC）是全球最常見的癌癥之一，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高，患者的生存率低[1-2]。HCC的高病死率與缺乏早期診斷的相應(yīng)指標(biāo)有關(guān)，往往在診斷出HCC時(shí)患者多已經(jīng)到了中晚期，并已發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]。因此，尋找HCC早期診斷及治療的標(biāo)志物具有很大意義。人孕激素和脂聯(lián)素受體（progestin and adipoQ receptor，PAQR）家族目前已發(fā)現(xiàn)的成員有11個(gè)，被命名為PAQR 1至11。近來研究已發(fā)現(xiàn)，PAQR4 在乳腺癌[4]、胃癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6-7]中上調(diào)，促使疾病進(jìn)展、提示預(yù)后不良。然而目前有關(guān)PAQR4在HCC中的表達(dá)和作用機(jī)制仍不清楚。本研究擬通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析PAQR4在HCC組織中的表達(dá)，并通過實(shí)驗(yàn)研究敲低PAQR4后分析肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移情況，探討PAQR4在HCC中產(chǎn)生作用的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 生物信息分析

本研究采用的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床資料來源于TCGA數(shù)據(jù)庫（http://cancergenome.nih.gov/）。臨床病理資料包括患者的年齡、性別、家族癌癥史等信息。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)使用了兩種HCC細(xì)胞系Hep3B和Huh-7，購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。Hep3B細(xì)胞在添加丙酮酸鈉、10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。Huh7 細(xì)胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中，并視細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。

1.3 轉(zhuǎn)染

使用兩種siRNA下調(diào)Hep3B和Huh7 中PAQR4的表達(dá)，由吉瑪基因公司合成。siPAQR4-1 序列：5’-AGGCUCCGUGCUCUAUCACTT-3’，5’-GUGAU AGAGCACGGAGCCUGC-3’；siPAQR4-2序列：5’-U CUUGCUCUGAGAGUUCAATT-3’，5’-UUGAACUC UCAGAGCAAGACG-3’。使用Lipofectamine2000（Life Technologies）將siPAQR4-1、siPAQR4-2和對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染到Hep3B和huh7中，后續(xù)根據(jù)操作說明完成。將待處理細(xì)胞在6孔板中進(jìn)行鋪板，貼壁過夜后，待細(xì)胞達(dá)到60%左右，進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，（單轉(zhuǎn)，終濃度為10 nmol/L siRNA），對(duì)照組轉(zhuǎn)入等量對(duì)照siRNA，對(duì)照siRNA為和目的基因的序列沒有同源性的普通陰性對(duì)照的siRNA，并于培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后換回原培養(yǎng)基。

1.4 PAQR4表達(dá)水平檢測(cè)

使用Trizol法，根據(jù)操作說明提取RNA，并使用分光光度計(jì)測(cè)量OD260、OD280數(shù)值，估算提取到的RNA的濃度及質(zhì)量。根據(jù)TaKaRa公司說明書嚴(yán)格進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈（RT-PCR）反應(yīng)。每組3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參，使用伯樂（Bio-Rad）實(shí)時(shí)定量PCR儀器檢測(cè)。所用的引物序列為：PAQR4（F-5’-CGAACTGGGCAACATCTACA-3’；R-5’-AGGG TGTTGACAAGGCAGAC-3’），GAPDH（F-5’-GCAA ATTCCATGGCACCGTC-3’；R-5’-CCTGGAAGATG GTGATGGGA-3’），PAQR4的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.5 PAQR4蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blotting法。對(duì)Hep3B和Huh7進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作后換回原培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，進(jìn)行提蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶中封閉1 h后，使用PAQR4抗體（13401-1-AP，proteintech）和GAPDH抗體（2118S，Cell Signaling Technology）作為一抗孵育，抗體均以1:1 000進(jìn)行稀釋，4 ℃搖床過夜，PBS洗膜3次后，用辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗室溫孵育1 h，PBS洗膜3 次后再用ECL plus試劑進(jìn)行曝光，觀察。

1.6 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

采用MTS法。本研究使用MTS試劑盒（Promega）進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。使用96孔板，加入100 μL培養(yǎng)基。Hep3B和Huh7均為2 000個(gè)細(xì)胞/孔。在培養(yǎng)0、24、48 h后96孔板內(nèi)分別加入20 μL的MTS溶液，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后使用多功能酶標(biāo)儀對(duì)各孔在570 nm波長(zhǎng)下的OD值進(jìn)行測(cè)量。然后依據(jù)所測(cè)到OD值數(shù)據(jù)繪制出細(xì)胞的增殖曲線。

1.7 細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)

Transwell小室進(jìn)行遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，本研究使用的為24孔板，培養(yǎng)孔中放置8 μm孔徑的普通（用于評(píng)估遷移）或基質(zhì)凝膠涂層（用于評(píng)估侵襲）的transwell插入物（Costar）。

下室中加入500 μL DMEM（含10%胎牛血清）。Hep3B或huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，用PBS洗滌2次，重懸于200 μL無血清培養(yǎng)基（2×104個(gè)/孔）中，加入上室。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，將遷移到下室的細(xì)胞在多聚甲醛中進(jìn)行20 min的固定，再使用20%乙醇0.01%結(jié)晶紫溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。10 min后，使用棉簽手動(dòng)擦拭過濾器頂部未遷移的細(xì)胞。然后進(jìn)行拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，計(jì)量資料采用（）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。組間比較采用Pearson卡方檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。采用Pearson卡方檢驗(yàn)進(jìn)行PAQR4 表達(dá)與免疫細(xì)胞相關(guān)性分析。P＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAQR4在HCC組織中表達(dá)上調(diào)

首先從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載369 例HCC組織和50例癌旁組織的PAQR4 mRNA表達(dá)水平相關(guān)數(shù)據(jù)。分析發(fā)現(xiàn)，HCC組織中PAQR4 mRNA水平明顯高于癌旁組織（P＜0.05）（圖1A）。

進(jìn)一步在TCGA數(shù)據(jù)庫中收集基因表達(dá)數(shù)據(jù)。生存分析顯示，HCC患者組織中PAQR4高表達(dá)患者較PAQR4 低表達(dá)患者生存生存期短（P=0.0014）（圖1B）。進(jìn)一步分析兩組臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，PAQR4的表達(dá)與年齡、家族癌癥史、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、TNM分期存在相關(guān)性，提示PAQR4高表達(dá)可能與這些因素有關(guān)（表1）。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中350例HCC患者PAQR4低表達(dá)組與高表達(dá)臨床病理特征比較

圖1 PAQR4在HCC組織中的表達(dá)比較（A）及PAQR4與HCC預(yù)后的相關(guān)性（B）

2.2 PAQR4調(diào)控HCC的細(xì)胞增殖能力

將兩種不同的siRNA 轉(zhuǎn)染到Hep3B 細(xì)胞和Huh7 細(xì)胞中，通過PCR檢測(cè)PAQR4 RNA，觀察肝癌細(xì)胞中PAQR4 的表達(dá)情況。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染si-PAQR4-1、siPAQR4-2、siCon后Hep3b細(xì)胞中PAQR4的表達(dá)量分別為（0.714±0.076）、（0.492±0.157）、（1.001±0.001），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A，P＜0.05）；Huh7 細(xì)胞中PAQR4 的RNA表達(dá)量分別為（0.477±0.155）、（0.304±0.107）、（1.001±0.000），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B，P＜0.05）。

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA后HCC細(xì)胞系Hep3B（A）和Huh7（B）中PAQR4的RNA表達(dá)量（*P＜0.05）

研究通過Western blotting檢測(cè)Hep3B和Huh7中PAQR4 的蛋白表達(dá)量（圖3），分析發(fā)現(xiàn)，敲低后PAQR4的表達(dá)量確實(shí)降低，表明本實(shí)驗(yàn)采用的敲低PAQR4模型可用于后續(xù)的研究。

圖3 轉(zhuǎn)染siRNA后HCC細(xì)胞系Hep3B（A）和Huh7（B）中PAQR4的蛋白表達(dá)量

MTS細(xì)胞增殖能力檢測(cè)結(jié)果表明，敲低PAQR4后細(xì)胞的吸光度值低于陰性對(duì)照，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4），這提示敲低PAQR4 會(huì)導(dǎo)致Hep3b和Huh7細(xì)胞的增殖能力減弱。

圖4 HCC細(xì)胞系Hep3B（A）和Huh7（B）細(xì)胞增殖情況

2.3 PAQR4調(diào)控HCC的細(xì)胞侵襲和遷移能力

用Transwell實(shí)驗(yàn)分析敲低PAQR4 后HCC的細(xì)胞侵襲和遷移能力，結(jié)果表明，PAQR4在Hep3B和Huh7細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞侵襲和遷移能力下降，穿過小室的細(xì)胞數(shù)量少于陰性對(duì)照組（圖5）。

2.4 PAQR4表達(dá)與免疫細(xì)胞相關(guān)

免疫系統(tǒng)細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。Bindea[8]報(bào)道免疫細(xì)胞類型的特征基因集。因此，本研究評(píng)估了PAQR4的表達(dá)是否與HCC組織中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，通過計(jì)算免疫細(xì)胞的特征基因集，利用GSVA（R包）的ssGSEA算法[9]分析HCC中這些免疫細(xì)胞類型的相對(duì)數(shù)量，以TPM值計(jì)算mRNA表達(dá)量。mRNA表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化值以log2轉(zhuǎn)化值表示。通過TCGA GDC門戶網(wǎng)站（http://portal.gdc.cancer.gov/），獲取HCCmRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，然后計(jì)算PAQR4表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的Pearson相關(guān)性。

研究發(fā)現(xiàn)，PAQR4的表達(dá)與HCC組織中中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、細(xì)胞毒性細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、T輔助型17（Th17）細(xì)胞、B細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)，而與T輔助型2（Th2）細(xì)胞、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞、NK細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、CD56bright NK細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)（圖6、表2）。

表2 PAQR4表達(dá)與不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性分析

圖6 PAQR4表達(dá)與不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

3 討論

當(dāng)前，HCC的治療方法首選手術(shù)，但中晚期肝癌往往已經(jīng)出現(xiàn)癌灶轉(zhuǎn)移，治療效果受限。肝移植也仍存在疾病復(fù)發(fā)等局限性。因此，尋找有效的肝癌治療策略迫在眉睫[10-11]。

PAQR4屬于PAQR家族，該家族在2005年首次被發(fā)現(xiàn)，具有7個(gè)跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域[12]。2017年Wang等[13]發(fā)現(xiàn)PAQR4 在細(xì)胞增殖中起著至關(guān)重要的作用。已有的研究表明，PAQR4可在多種癌癥中高表達(dá)，并對(duì)癌癥進(jìn)展起到重要的作用。在乳腺癌中，PAQR4能夠通過抑制CDK4的降解和泛素化，起到促腫瘤的效果[4]。在前列腺癌中，敲低PAQR4 能夠抑制癌增殖、遷移、侵襲，還能夠抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[14]。但截止目前，PAQR4在HCC中的表達(dá)與機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步探討。

本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，與正常的肝組織進(jìn)行相比，PAQR4在肝癌組織中的表達(dá)上調(diào)；臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，PAQR4的表達(dá)與年齡、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、TNM分期有關(guān)，這說明PAQR4對(duì)肝癌發(fā)生和進(jìn)展具有促進(jìn)作用。因此，PAQR4有望成為判斷肝癌的一個(gè)新的生物標(biāo)記物以及治療靶點(diǎn)。PAQR高表達(dá)與肝癌患者預(yù)后較差存在著相關(guān)性，因而PAQR4可能成為一個(gè)潛在的預(yù)后指標(biāo)。本研究通過siRNA敲低PAQR4導(dǎo)致HCC細(xì)胞系Hep3B和Huh7中的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力遭到抑制，這進(jìn)一步證實(shí)PAQR4在肝癌中的促進(jìn)作用，也與其他文獻(xiàn)中的PAQR4可促癌的結(jié)論一致。因此，我們的研究結(jié)果有助于進(jìn)一步明確肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

近年來，car-t細(xì)胞療法、免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法等免疫治療策略成為熱點(diǎn)[15]。肝臟是重要的免疫器官。腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞組成和比例的變化對(duì)腫瘤的發(fā)展也起著至關(guān)重要的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，PAQR4的表達(dá)與肝癌組織中中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、細(xì)胞毒性細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、T輔助型17（Th17）細(xì)胞、B細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)，而與t輔助型2（Th2）細(xì)胞、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞、NK細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、CD56bright NK細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)。PAQR4可能會(huì)影響這些免疫細(xì)胞的數(shù)量，從而最終改變各種細(xì)胞分泌物的多少，改變腫瘤的微環(huán)境。在未來我們需要進(jìn)一步明確為何PAQR4導(dǎo)致了免疫環(huán)境的這種變化，及其在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的機(jī)制，這將會(huì)有助于我們制定靶向免疫治療策略，為今后肝癌的治療提供新的途徑。