肝癌代謝重編程相關(guān)基因富集分析及ATP檸檬酸裂解酶表達(dá)的臨床意義

周青青，李軍建，鄭亦胡，余正平，朱千東

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000，1.手術(shù)室，2.肝膽胰外科）

我國是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）的高發(fā)國家。在HCC病程中，抑癌基因失活、原癌基因激活及基因突變效應(yīng)積累等都對HCC發(fā)生、發(fā)展具有顯著誘發(fā)和促進(jìn)作用。最新研究表明，調(diào)控腫瘤形成與進(jìn)展的一個關(guān)鍵因素是腫瘤細(xì)胞代謝重編程（metabolic reprogramming）[1]，該過程重新界定了腫瘤細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的通量與流向，用以滿足腫瘤細(xì)胞物質(zhì)代謝和能量代謝，保證腫瘤細(xì)胞的存活與增殖，在不利條件下保持生存優(yōu)勢[2]。這些代謝改變?yōu)榧?xì)胞提供核酸、蛋白質(zhì)等大分子合成所需要的中間代謝物，對于腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展至關(guān)重要。因此，系統(tǒng)性地研究代謝重編程相關(guān)基因表達(dá)在HCC預(yù)后和治療中的靶標(biāo)作用意義重大。在本研究中，我們首先分析了來源于TCGA（The Cancer Genome Atlas）的公共大樣本數(shù)據(jù)，通過富集分析篩選獲得參與HCC腫瘤進(jìn)展的代謝重編程相關(guān)基因；其次，在候選基因中ATP檸檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）作為腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)代謝通路上游的關(guān)鍵酶，在許多腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要作用，因此我們在HCC臨床標(biāo)本中檢測ACLY表達(dá)水平，并納入GEO（gene expression omnibus）的大樣本表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究，明確ACLY表達(dá)在HCC生存預(yù)后中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 TCGA數(shù)據(jù)：下載數(shù)據(jù)庫中所有374例HCC測序數(shù)據(jù)（截止2019年9月），將其中50對HCC與癌旁配對樣本納入差異表達(dá)分析。標(biāo)本以編號區(qū)分腫瘤組織或癌旁組織，基因表達(dá)數(shù)據(jù)為level 3級別。該測序數(shù)據(jù)完成于Illumina HiSeq 2000測序平臺。

1.1.2 GEO數(shù)據(jù)：下載數(shù)據(jù)庫中基因芯片數(shù)據(jù)集GSE14520，該數(shù)據(jù)集包括247 例HCC基因芯片數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。本研究排除26 例樣本：其中22 例樣本隸屬GPL571 平臺，5 例無臨床結(jié)果數(shù)據(jù)（1 例隸屬GPL571 平臺，并且無結(jié)果數(shù)據(jù)）。最后，隸屬GPL3921 平臺的221 例基因芯片數(shù)據(jù)被納入最終分析。所有肝組織標(biāo)本均來自2002年至2003年在復(fù)旦大學(xué)附屬肝癌研究所和中山醫(yī)院接受根治性切除的患者[3-4]，隨訪數(shù)據(jù)和術(shù)前檢查數(shù)據(jù)較完整。

1.1.3 人HCC組織標(biāo)本的選?。航M織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本來自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2018年5月至10 月間因原發(fā)性HCC行肝切除術(shù)的15 例病例的HCC組織標(biāo)本及癌旁組織，其中男11 例，女4 例，年齡37～78歲，平均55.8歲。術(shù)前未接受放療、化療等治療，術(shù)中均未見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，術(shù)后經(jīng)病理證實為HCC，其中高分化7例，中分化6例，低分化2例。所有患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 基因富集分析：本研究采用的基因富集方法包括GSEA（gene set enrichment analysis）、GO（gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）。GSEA無需先找差異基因，計算的基本原理是掃描排序序列，當(dāng)出現(xiàn)一個特定功能基因集中的基因時，就增加該功能集富集評分（enrichment score，ES）值，反之，就減少ES值，所以在整個掃描過程中，ES是一個動態(tài)的值，可以避免一些人為篩選差異基因?qū)е碌钠?。GO可分為分子功能（molecular function）、生物學(xué)過程（biological process）和細(xì)胞組分（cellular component）三個部分，分別對基因進(jìn)行注釋和分類。我們通過應(yīng)用Cytoscape軟件和BiNGO插件進(jìn)行分析[5-6]。KEGG通路富集分析以KEGG通路為單位，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)檢驗，在整個基因組背景中找出差異表達(dá)基因中顯著性富集的通路。此分析同樣需要篩選出候選的差異基因列表。在本研究中，我們通過在線網(wǎng)絡(luò)工具KOBAS[7]（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行此分析。

1.2.2 樣本總RNA提取及qRT-PCR檢測：按照Invitrogen公司Trizol試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA有無降解，檢測所提取RNA的濃度和純度，RNA的A260/A280在1.8～2.0 范圍內(nèi)者方可進(jìn)行后續(xù)實驗。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，避光保存于-20 ℃冰箱。以此cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，熒光定量PCR反應(yīng)使用SYBR法Q-PCR試劑盒在BIORAD CFX96 熒光定量PCR儀上操作。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s；55 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。最后采用2-△△Ct方法計算基因相對表達(dá)值。引物委托上海生物工程公司合成，序列如下：ACLY（F’TC GGCCAAGGCAATTTCAGAG，R’CGAGCATACTT GAACCGATTCT）；GAPDH（F’GTCTTCACCACCA TGGAGAAG，R’CAAAGTTGTCATGGATGACCTT GG）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

TCGA RNAseq數(shù)據(jù)通過R軟件（http://www.rproject.org/，version 3.2.5），采用R包“edgeR”包來構(gòu)建表達(dá)矩陣，評估組內(nèi)和組間差異，進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，獲得差異表達(dá)基因列表；基因分析納入標(biāo)準(zhǔn)raw read counts＞1，差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為：錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05，log CPM＞1 且|差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）|＞3。GEO數(shù)據(jù)分析首先根據(jù)ACLY表達(dá)值將樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，生存分析和Cox比例風(fēng)險模型分析過程采用R包“survival”；后者先進(jìn)行單因素Cox回歸分析，再將差異顯著的進(jìn)行多因素Cox回歸分析。其他數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行。兩組數(shù)據(jù)間統(tǒng)計差異的比較采用獨立樣本t檢驗；各個臨床因素與ACLY表達(dá)值組成差異采用χ2檢驗；P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSEA分析獲得與HCC代謝重編程相關(guān)的差異表達(dá)基因

通過構(gòu)建表達(dá)矩陣、基因ID轉(zhuǎn)基因名稱等步驟獲得全基因表達(dá)譜列表，包含27 915 個基因，該列表滿足GSEA的分析要求。本研究篩選差異最顯著的3條代謝通路進(jìn)行下一步研究（表1）。

表1 在HCC癌旁組中富集最顯著的代謝相關(guān)通路

2.2 GO分析獲得與HCC代謝重編程相關(guān)的差異表達(dá)基因

篩選全基因表達(dá)譜列表，獲得1 720個差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的基因1 052個，表達(dá)下調(diào)的基因668個（圖1）。經(jīng)GO分析，本研究選擇差異最顯著3個代謝相關(guān)生物學(xué)過程（表2）納入后續(xù)研究，共包含122個基因。

表2 腫瘤組織和癌旁組織差異最顯著的代謝相關(guān)生物學(xué)過程通路

圖1 腫瘤組織和癌旁組織差異表達(dá)基因的熱圖（A）和火山圖（B）

2.3 KEGG通路分析獲得與HCC代謝重編程相關(guān)的差異表達(dá)基因

在http://kobas.cbi.pku.edu.cn/網(wǎng)站輸入差異表達(dá)基因列表，參數(shù)選擇：Databases:KEGG pathway；Statistical test method:hypergeometric test/Fisher’s exact test；FDR correction method:Benjamini and Hochberg，差異最為顯著的KEGG通路見表3，其中metabolic pathways包含200個差異表達(dá)基因，用于后續(xù)研究。

表3 腫瘤組織和癌旁組織差異最顯著的KEGG通路

2.4 聯(lián)合分析篩選獲得HCC代謝重編程相關(guān)基因

單獨應(yīng)用GSEA、GO或者KEGG分析存在偏倚的可能性，我們將上述3 種富集分析方法獲得的代謝重編程相關(guān)的差異表達(dá)基因取交集，獲取共同的代謝重編程相關(guān)的差異表達(dá)基因，共有26個基因（圖2），其中表達(dá)上調(diào)的差異基因8個，表達(dá)下調(diào)的基因18個。

圖2 篩選獲得26個代謝重編程相關(guān)基因

2.5 HCC患者腫瘤組織與癌旁組織中ACLY基因表達(dá)

為了驗證ACLY在HCC臨床樣本中的表達(dá)豐度，我們采用qRT-PCR的方法檢測了15對HCC組織和癌旁組織的標(biāo)本，結(jié)果表明，HCC組織ACLY表達(dá)值顯著高于癌旁組織（P＜0.01）（圖3）。

圖3 qRT-PCR檢測15對HCC組織與癌旁組織表達(dá)情況（**P＜0.01）

2.6 GEO大樣本數(shù)據(jù)生存分析和臨床相關(guān)性研究驗證

為了明確ACLY高表達(dá)在HCC患者預(yù)后中的作用，我們納入GEO大樣本數(shù)據(jù)予以驗證，該組基線數(shù)據(jù)較完整（表4）。我們首先提取GEO組表達(dá)數(shù)據(jù)，顯示ACLY在HCC組織的表達(dá)值高于癌旁組織（P＜0.01）（圖4）。

圖4 HCC組織樣本ACLY表達(dá)量顯著高于癌旁組織（**P＜0.01）

根據(jù)ACLY表達(dá)中位數(shù)，將臨床HCC樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組（由于部分?jǐn)?shù)據(jù)缺失，每個的臨床指標(biāo)數(shù)目略有差異）。臨床相關(guān)分析因素包括：性別、年齡、乙肝狀態(tài)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平（＞50 U/L/≤50 U/L）、主瘤直徑（＞5 cm/≤5 cm）、多發(fā)病灶、肝硬化、TNM分期、BCLC分期、CLIP分期、AFP水平（＞300 ng/mL/≤300 ng/mL）。分別統(tǒng)計了與ACLY表達(dá)相關(guān)的因素（表4），及其在HCC生存預(yù)后中的作用（圖5，表5、6）。

表5 HCC總體生存率Cox回歸分析

圖5 ACLY高表達(dá)及低表達(dá)組患者總體生存率比較（A）與無復(fù)發(fā)生存率比較（B）

表4 HCC代謝重編程相關(guān)基因ACLY表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

HCC是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中均位居前列[8]。在臨床上通常采用病理指標(biāo)指導(dǎo)腫瘤分期，選擇治療方法和分析患者生存預(yù)后，其中腫瘤血管侵犯、分化程度、大小和數(shù)目、TNM分期、BCLC分期及CLIP分期等都是影響HCC預(yù)后的重要因素[9]。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，相關(guān)研究顯示HCC的發(fā)生和進(jìn)展實質(zhì)上是一個動態(tài)變化的過程，包括抑癌基因失活、原癌基因激活、基因突變效應(yīng)積累等[10-11]。因此，許多研究者試圖運用特定基因表達(dá)變化來進(jìn)行腫瘤的分型和預(yù)后評估，預(yù)測腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等。許多癌癥相關(guān)分子的異常表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)，是腫瘤預(yù)后的

獨立危險因素[12-13]，這些分子同樣包括了部分代謝相關(guān)基因。代謝相關(guān)基因在腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，廣泛參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，并可能是癌癥患者生存預(yù)后的指標(biāo)和治療靶點。

表6 HCC無復(fù)發(fā)生存率Cox回歸分析

目前，已有大量分析腫瘤差異表達(dá)基因的高水平研究發(fā)表，幾乎涵蓋了所有腫瘤類型，但是這些研究并不限定于特定的腫瘤表型，尤其是分析HCC代謝重編程相關(guān)基因本研究是屬首次。另外，在以往類似的研究中，往往通過分析基于基因芯片的表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選差異候選分子，難以保證1:1 的配對，從而影響了數(shù)據(jù)的完整性和可信度。此外，基因芯片等來源的表達(dá)數(shù)據(jù)通常需要進(jìn)行大規(guī)模的qRT-PCR來驗證候選分子的表達(dá)值。而已有研究報道，高通量測序技術(shù)的結(jié)果相比于高通量基因芯片結(jié)果，定量的可信程度更高，靈敏度更強(qiáng)，可以作為基因表達(dá)豐度的定量方法。因而，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫的大樣本生物信息測序數(shù)據(jù)，篩選HCC差異表達(dá)基因列表，并通過差異表達(dá)基因的聚類分析，富集代謝相關(guān)的信號通路，篩選最有顯著價值的共同代謝重編程相關(guān)基因。我們下載TCGA數(shù)據(jù)庫內(nèi)現(xiàn)存所有的374例HCC相關(guān)樣本的詳實數(shù)據(jù)，其中腫瘤與癌旁配對的50對標(biāo)本納入差異表達(dá)基因分析。由于總體低表達(dá)基因（low read counts）通常不是差異分析的目的基因，對研究結(jié)果意義不大；因此，我們只將每個基因平均raw read counts＞1 者納入分析。并設(shè)置最終差異表達(dá)分子納入標(biāo)準(zhǔn)為：FDR＜0.05，log CPM＞1且|FC|＞3。在篩選過程中，既往文獻(xiàn)報道一般將差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為|FC|＞1.25～2.00，P＜0.05，對表達(dá)量log CPM沒有要求。本研究中設(shè)定的差異表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)篩選出的差異表達(dá)分子在標(biāo)本中既達(dá)到一定的表達(dá)量，又同時保證了腫瘤組織與癌旁組織表達(dá)值之間具有統(tǒng)計學(xué)差異，結(jié)果的可信度更強(qiáng)，也更加具有臨床意義。為了更加精確篩選和全面評估參與HCC代謝重編程的基因，減少應(yīng)用單一通路富集分析方法存在偏倚的可能性，本研究采用GSEA、GO和KEGG共3種通路富集方法，最終我們篩選了26個代謝重編程相關(guān)基因。

ACLY是26 個代謝重編程相關(guān)基因之一，是脂質(zhì)代謝通路上游的關(guān)鍵酶[14]，在腫瘤細(xì)胞的脂肪酸從頭合成中發(fā)揮著重要作用，催化內(nèi)源性脂質(zhì)從頭合成的第一步反應(yīng)，即線粒體來源的輔酶A和檸檬酸經(jīng)其催化轉(zhuǎn)變?yōu)椴蒗Ｒ宜峒耙阴oA。在腫瘤的代謝重編程中，脂肪酸合成代謝具有特殊重要的作用[15]。脂肪酸來源可分為外源性吸收和內(nèi)源性從頭合成，大多數(shù)正常細(xì)胞通過外源性途徑獲取，然而在腫瘤細(xì)胞中超過90%的脂肪酸來源于內(nèi)源性從頭合成[16]。脂肪酸從頭合成速率增加可顯著促進(jìn)細(xì)胞膜物質(zhì)的生物合成。脂肪酸合成增加，尤其是從頭合成增加，是惡性腫瘤細(xì)胞的重要特征之一[17-18]。抑制腫瘤細(xì)胞的內(nèi)源性脂肪酸合成，可誘導(dǎo)腫瘤的退化[19]。ACLY在癌細(xì)胞中常見上調(diào)表達(dá)，在多種腫瘤中，ACLY的活化和表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤生長，比如膀胱癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌等[20-23]。在結(jié)直腸癌中，ACLY的過表達(dá)可以誘導(dǎo)伊利替康的耐藥，但敲減ACLY可以逆轉(zhuǎn)該結(jié)果[20]。在許多永生化細(xì)胞系中，ACLY異常上調(diào)表達(dá)也普遍存在[24]。此外，通過抑制ACLY可以阻斷MAPK和PI3K/Akt通路，從而抑制癌細(xì)胞的生長和增殖[25]。但在HCC中ACLY表達(dá)水平尚未見報道。我們的臨床標(biāo)本檢測結(jié)果和來源于GEO的數(shù)據(jù)均表明ACLY在HCC組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，與其他癌癥類型類似。

為了進(jìn)一步明確ACLY過表達(dá)在HCC預(yù)后中的意義，我們納入GEO數(shù)據(jù)進(jìn)行臨床相關(guān)性研究。分析結(jié)果表明：ACLY的異常表達(dá)與TNM分期、CLIP分期、AFP相關(guān)（P＜0.05）；ACLY的異常高表達(dá)與HCC患者總生存率相關(guān)（P=0.023），而且與無復(fù)發(fā)生存率存在相關(guān)性的趨勢（P=0.052）。總體生存單因素Cox回歸和多因素Cox回歸分析表明，僅ACLY的表達(dá)水平與總體生存顯著相關(guān)（P=0.041）。無復(fù)發(fā)生存單因素Cox回歸和多因素Cox回歸分析表明：僅ACLY表達(dá)水平與患者術(shù)后無復(fù)發(fā)生存顯著相關(guān)（P=0.008）。ACLY表達(dá)水平與患者預(yù)后生存時間具有顯著的相關(guān)性，可以作為HCC生存預(yù)后的一個獨立風(fēng)險預(yù)測指標(biāo)，其效能可能優(yōu)于常見的臨床病理指標(biāo)。

總體而言，ACLY的表達(dá)上調(diào)是HCC患者預(yù)后的獨立危險因素。代謝重編程相關(guān)基因的功能相對明確，可作為腫瘤靶向治療的靶點，逆轉(zhuǎn)代謝重編程過程，進(jìn)而有助于控制HCC的進(jìn)展，這可能是今后HCC的有效治療策略。