甘薯與海邊近緣野生種（厚藤）雜交親和性測試和分析

張雄堅 黃立飛 房伯平 陳景益 王章英 羅忠霞 楊義伶

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省作物遺傳改良重點實驗室 廣東廣州 510640)

野生種質(zhì)資源在甘薯育種中，具有重要作用，主要是利用其抗病蟲及抗逆特性，并能達(dá)到一定的效果［1-2］。在抗逆性方面，利用海邊灘涂近緣野生種厚藤的特異性，培育耐鹽甘薯品種，是非常有益的探討研究。海邊近緣野生種厚藤，中文學(xué)名馬鞍藤，拉丁文名Ipomoea pes-caprae（L.）R.Br.subsp.Brasiliensis，別名厚藤、鱟藤、二葉紅薯、獅藤、馬蹄金、馬蹄草、海茹藤，染色體2n＝2x＝30［3］，生長在海灘，屬于沿海地區(qū)廣泛分布的固沙綠化植物。研究表明，鹽脅迫下，隨著鹽濃度的升高，可溶性糖、游離脯氨酸、厚藤可溶性蛋白以及Na+/K+升高，膜透性增加，說明厚藤是一種耐高鹽植物［4］；鹽脅迫下，馬鞍藤MDA、Pro、可溶性糖、總蛋白含量與凈光合速率等5項指標(biāo)均呈現(xiàn)出規(guī)律性變化，可作為馬鞍藤鹽脅迫的響應(yīng)指標(biāo)，能夠迅速和有效地通過自身調(diào)節(jié)來抵御鹽脅迫帶來的影響，具有較強(qiáng)的耐鹽能力，為耐鹽甘薯種質(zhì)資源創(chuàng)新和耐鹽基因挖掘提供了理論依據(jù)［5］。厚藤作為甘薯的近緣海邊野生種，除具有極強(qiáng)的耐鹽耐旱性外，也是海洋植物藥材，是中國南方沿海地區(qū)民間常用海洋中藥和京族習(xí)用植物藥材，同時也是澳大利亞、墨西哥、泰國、巴西、巴基斯坦等多個熱帶及亞熱帶國家的傳統(tǒng)藥用植物，其化學(xué)成分主要包括樹脂糖苷類、萜類、黃酮類、酚酸類、揮發(fā)性成分、甾體類等?，F(xiàn)代藥理研究表明，厚藤具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗膠原酶、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性［6］。為探究甘薯近緣海邊野生種厚藤的抗逆、藥效基因，以便利用其潛在的基因資源，已在基因和分子水平方面開展了相關(guān)研究。先是測定基因組大小及收集特征信息，為馬鞍藤進(jìn)一步的全基因組深度測序和甘薯耐鹽基因挖掘奠定基礎(chǔ)［7］。通過對厚藤ASR（ABA-stressripening）基因IpASR的克隆和序列分析，明確該基因的生物學(xué)功能是作為厚藤體內(nèi)的重要脅迫應(yīng)答基因，在適應(yīng)濱海高鹽干旱環(huán)境的過程中發(fā)揮重要作用，為作物的抗逆分子育種提供理論依據(jù)［8］。已成功克隆厚藤的Actin基因IpActin1，為后續(xù)克隆厚藤的抗逆功能基因和分析基因表達(dá)模式提供了內(nèi)參基因，同時也為進(jìn)一步研究厚藤的抗逆分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)［9］。利用厚藤與甘薯進(jìn)行常規(guī)雜交，通過分子標(biāo)記輔助育種，可達(dá)到提高甘薯抗逆性和增強(qiáng)其保健功效的目的，這也是可行的研究和必要的探討。但無論是有性雜交還是體細(xì)胞雜交，能夠與甘薯雜交并成功獲得種間雜種的野生資源有限，目前僅報道4個種：I.trifida（2X，4X，6X）、I.1triloba、I.1lacunosa、I.cairica［2］，尚未見有關(guān)近緣野生種厚藤與甘薯雜交的研究報道。因此，本研究擬測定近緣野生種厚藤與甘薯有性雜交的親和性，為進(jìn)一步嘗試厚藤與甘薯的有性雜交、結(jié)實和種子收獲提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

耐鹽的海邊近緣野生種厚藤（Ipomoea pescaprae），采自廣東省陽江市沿海地區(qū)，甘薯［Ipomoea batatas（L.）Lam，2n＝6X＝90］品種共有14個，包括廣薯87、廣薯79、廣紫薯2號、廣紫薯10號、三色甘薯、黔菜2號、廣薯12-87、越南紫薯、綿紫薯9號、心香、廣薯菜9號、廣薯69、廣薯205、普薯32，均來自廣東省農(nóng)科院作物所甘薯研究室，作為甘薯雜交親本。

1.2 方法

為了使雜交期間能夠開花，甘薯親本和厚藤都用嫁接誘導(dǎo)。以另一個近緣野生種樹牽牛（Ipomoea carneasubsp.fistulosa）作砧木，分別以甘薯親本和厚藤苗6～8 cm長的頂芽為接穗；用15 mg/L奈乙酸（NAA）蘸浸接穗楔尖，然后用保鮮尼龍膜包扎嫁接；嫁接后用大棚遮光網(wǎng)遮陰。待親本正常生長后，于2017年至2020年開花期間（從10月份至次年6月份），根據(jù)開花情況，將甘薯品種與厚藤配對組合，進(jìn)行授粉雜交；采用雌蕊染色速測法［10］觀察花粉萌發(fā)情況。上午將甘薯品種與近緣野生種進(jìn)行授粉雜交，4 h后，取雌蕊染色壓片，在倒署置顯微鏡（型號Olympus CX X41）下觀察花粉萌發(fā)，計算親和指數(shù)，評價親和強(qiáng)弱，確定親和性。染料制備：將苯酚、甘油、乳酸、蒸餾水按體積比例為1∶1∶1∶1.5混合，加曙紅染色劑，經(jīng)加熱溶解過濾制成；于2020年3月27日上午，觀察3個組合授粉雜交后的結(jié)實掛果情況。

雜交授粉時，若花粉粒不萌發(fā)，看不到花粉管，表示完全不親和；若萌發(fā)的花粉管清晰、數(shù)量多、發(fā)育正常且穩(wěn)定，則表示完全親和。但多數(shù)處于這兩者的中間狀態(tài)，即花粉管有的模糊不清，有的少，有的多，有的不正常，表明親和性有所差異，據(jù)此估算親和指數(shù)，評價親和性程度。甘薯品種與近緣野生種厚藤雜交的親和指數(shù)按以下公式計算。

式中：N，花數(shù)；N0，無花粉粒萌發(fā)的花數(shù)；N1，萌發(fā)花粉管模糊的花數(shù)；N2，萌發(fā)花粉管數(shù)少（1-3條）的花數(shù)；N3，萌發(fā)花粉管數(shù)中但花粉管不正常的花數(shù)；N4，萌發(fā)花粉管數(shù)中（4～7條）的花數(shù)；N5，萌發(fā)花粉管數(shù)多但花粉管不正常的花數(shù)；N6，萌發(fā)花粉管數(shù)多（8～10條）的花數(shù)；N7，萌發(fā)花粉管數(shù)極多（＞11條）的花數(shù)；N8，萌發(fā)花粉管伸入花柱的花數(shù)

根據(jù)親和指數(shù)確定各甘薯品種與近緣野生種厚藤雜交的親和性強(qiáng)弱：極弱，親和指數(shù)≤20.0）；弱，20.0＜親和指數(shù)≤40.0）；中，40.0＜親和指數(shù)≤60.0）；強(qiáng)，60.0＜親和指數(shù)≤90.0）；極強(qiáng)，親和指數(shù)＞90.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種差異

將14個甘薯品種與近緣野生種進(jìn)行授粉雜交，結(jié)果顯示，有6個親本品種可觀察到花粉萌發(fā)，具有一定的親和性，占總數(shù)42.9%；另有8個親本品種未觀察到花粉萌發(fā)，即表現(xiàn)為不親和性，占總數(shù)57.1%。因此，甘薯品種與海邊近緣野生種厚藤（Ipomoea pescaprae）雜交，有些品種具有親和的表現(xiàn)，但多數(shù)品種表現(xiàn)不親和。甘薯與近緣野生種（厚藤）雜交的正交6個組合全部表現(xiàn)為親和；反交中，有3個組合不親和，3個組合有少量的萌發(fā)，表現(xiàn)出極弱的親和性，即甘薯與近緣野生種雜交，正交親和的多，反交親和的少，表明近緣野生種作父本，容易親和；而甘薯作父本，親和性比較低。近緣野生種無明顯的甘薯雜交群別屬性，同一甘薯群別中，既有親和，也有不親和，因此，不屬于甘薯當(dāng)中的雜交群別［11］（表1），親和性只跟甘薯品種有關(guān)。

表1 甘薯和海邊近緣野生種雜交親和情況

2.2 花粉粒萌發(fā)類型

不同的品種組合，萌發(fā)的花粉管有差異，表明與近緣野生種厚藤雜交親和的甘薯品種，親和性有一定的差異。花粉萌發(fā)的差異，可分為5種類型。無花粉萌發(fā)：由圖1可知，普薯32與海邊近緣野生種雜交，只見花粉粒（箭頭所指），無萌發(fā)的花粉管，說明雜交不親和。花粉管模糊：花粉粒萌發(fā)的花粉管似是而非（圖2），模棱兩可（箭頭所指）?；ǚ酃芗?xì)長：廣薯87與海邊近緣野生種雜交，花粉粒萌發(fā)的花粉管細(xì)長（圖3），無膨大的花粉管頭，不正常（箭頭所指）?；ǚ酃苷＃汉＿吔壱吧N與廣薯79雜交，花粉粒萌發(fā)的花粉管略粗，花粉管頭膨大（圖4），花粉管多且正常（箭頭所示），親和性好?；ǚ酃苓M(jìn)入花柱：海邊近緣野生種與廣薯79雜交（圖5），花粉管進(jìn)入花柱（箭頭所示）。

圖1 普薯32×海邊近緣野生種

圖2 花粉管模棱兩可

圖4 海邊近緣野生種×廣薯79（一）

圖5 海邊近緣野生種×廣薯79（二）

2.3 親和指數(shù)及差異

根據(jù)萌發(fā)的花粉管不同，計算親和指數(shù)，親和強(qiáng)弱。結(jié)果表明，廣薯79×海邊近級野生種組合親和指數(shù)最高，為50.7，能達(dá)中等親和；5個組合弱，3個組合極弱，沒有強(qiáng)或極強(qiáng)組合（表2）；說明目前的測試中，與海邊近緣野生種（厚藤）雜交，并未發(fā)現(xiàn)親和性較好的甘薯品種。

表2 親和雜交組合親和指數(shù)計算和親和性評價

2.4 不同時期親和性差異

親和組合中，不同時期親和性強(qiáng)弱亦有差異。從圖6可知，親和指數(shù)出現(xiàn)明顯峰值。親和性較典型的品種廣薯87、廣薯79及廣紫薯2號親和指數(shù)出現(xiàn)雙高峰值趨勢，分別出現(xiàn)在11月上旬、11月中旬和次年4月的下旬，但不同的親和組合或有一定的差異，有的偏強(qiáng)，有的偏弱；在最適合的親和期雜交，容易結(jié)實，可收到雜交種子。因此，在親和指數(shù)較低的情況下，需選擇親和指數(shù)高峰期進(jìn)行雜交，才更有望達(dá)到結(jié)實效果。

圖6 雜交親和指數(shù)曲線圖

2.5 雜交掛果

在與海邊近緣野生種（厚藤）的雜交組合中，作母本的廣薯87、廣紫薯2號，和廣薯79的親和指數(shù)相對較高，分別為39.0、44.8和50.7；雜交授粉（2020年3月27日）后，第一次（4月7日，即10日后）調(diào)查顯示，掉果率分別是77.8%、41.7%和10.0%。由此可見，親和指數(shù)越低，越容易掉果，且掉果率高；親和指數(shù)相對高的品種，掉果率也低，掛果率高，差異趨勢明顯；說明測定親和指數(shù)，對實際雜交有一定的指導(dǎo)作用，可避免無效雜交。第二次（4月10日，即13日后）調(diào)查顯示，弱親和性組合已全部掉果，而中度親和性組合還有40.0%的掛果率，表明親和性弱易掉果，親和性強(qiáng)則可延長掛果期（表3）。

表3 親和指數(shù)高組合掛果測試

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

研究表明，廣州甘薯開花制種季節(jié)（10—12月），甘薯與海邊近緣野生種雜交，多數(shù)品種無花粉萌發(fā)，表現(xiàn)為不親和，可能是由于胼胝質(zhì)［12］隨著溫度下降而增多所至；隨著次年春季高溫來臨，漸見花粉萌發(fā)，此時較適宜授粉雜交，可見結(jié)實，但此時正值高溫高濕期，親本苗老化，不利于進(jìn)一步結(jié)實觀察試驗。據(jù)報道，不同甘薯栽培種與四倍體近緣野生種海濱野牽牛（I.littoralis）雜交后的結(jié)實率有明顯差異。雜交結(jié)實率比較高的組合，其親本栽培歷史長，遺傳基礎(chǔ)穩(wěn)定；而結(jié)實率較低或根本不結(jié)實的組合，多半為播種1—2年的雜種后代品系，遺傳基礎(chǔ)特別是減數(shù)分裂行為不穩(wěn)定，有可能影響其與四倍體野生種雜交的結(jié)實率［13］，這與本研究的雜交親和結(jié)果相似。同時，從形態(tài)特征看，試驗用的海邊近緣野生種（厚藤）與甘薯親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，授粉雜交測試過程有很多品種無花粉萌發(fā)；而萌發(fā)的組合，正反交差異也很大，且花粉萌發(fā)效果不穩(wěn)定。測定親和性，從中篩選高親和指數(shù)的強(qiáng)親和組合，在適宜的親和期進(jìn)行雜交授粉，雜交組合可結(jié)實，同時可收獲種子。在強(qiáng)親和組合中，可進(jìn)一步將甘薯與野生種雜交的胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)，提高種間雜交成苗的成功率，解決甘薯與近緣野生種雜交后胚發(fā)育中止的問題［14］，有望培育出甘薯與海邊近緣野生種厚藤的雜交苗，充分利用海邊近緣野生種厚藤的耐鹽基因、藥效及其抗逆性強(qiáng)的優(yōu)勢。

3.2 結(jié)論

本研究測定了甘薯與海邊耐鹽近緣野生種（厚藤）的雜交親和性，結(jié)果顯示，可觀察到花粉萌發(fā)，但親和性強(qiáng)弱與品種、開花時期有關(guān)。因此，測定親和性，并估算親和指數(shù)，篩選強(qiáng)親和組合，對指導(dǎo)厚藤和甘薯品種配組雜交具有一定意義，也便于收獲雜交種子，避免無效雜交。