高危型人乳頭瘤病毒基因分型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)技術(shù)在宮頸癌篩查中的應(yīng)用分析

蔡江義，崔旭，秦嶺，康媛媛，白煥煥

作者單位：1西安航天醫(yī)院病理科，陜西 西安710000；2渭南市中心醫(yī)院病理科，陜西 渭南714000；3西安鳳城醫(yī)院病理科，陜西 西安710000；4靖邊縣人民醫(yī)院病理科，陜西 榆林719000；5榆林市中醫(yī)醫(yī)院病理科，陜西 榆林719000

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性身心健康和生命安全的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，僅次于乳腺癌。2018年，女性宮頸癌的發(fā)病率約占全球腫瘤病人的6.6%，約有50萬(wàn)的新增病例和20萬(wàn)的死亡病例，年輕女性的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。人乳頭瘤病毒（HPV）是全世界最常見(jiàn)的性傳播病毒，研究已經(jīng)證實(shí)，幾乎所有宮頸癌都是由高危型HPV持續(xù)感染引起的。隨著人們對(duì)HPV各亞型與宮頸癌發(fā)病機(jī)制的深入研究，HPV分型檢測(cè)技術(shù)在宮頸癌篩查中的作用越來(lái)越受到大家的關(guān)注，有研究學(xué)者提出將高危型HPV的分型檢測(cè)作為宮頸癌的篩查方法之一。因此，本研究通過(guò)使用不同的篩查方法分析高危型HPV分型檢測(cè)在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值，為高危型HPV分型檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年6月至2019年6月西安航天醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的疑似宮頸病變病人628例，年齡（38±8）歲，范圍為21～64歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合美國(guó)癌癥中心推薦的宮頸癌篩查指南；無(wú)子宮頸切除；無(wú)急性生殖道炎癥；1個(gè)月內(nèi)無(wú)陰道用藥。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并患有其他系統(tǒng)的惡性疾??；妊娠期婦女；患有精神疾病。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，所有病人均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1

HR-HPV DNA PCR檢測(cè)（1）取樣：首先暴露病人的宮頸，用無(wú)菌生理鹽水棉球洗去病人的宮頸分泌液，再用特制的采樣刷置于宮頸口順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5周，以采集足夠?qū)m頸脫落細(xì)胞，然后將宮頸刷置于預(yù)先放有1 mL洗脫液的無(wú)菌離心管中送檢或暫放于4℃冰箱中保存待檢。（2）檢測(cè)方法：采用ABI公司生產(chǎn)的7500型熒光定量分析檢測(cè)儀對(duì)高危型HPV進(jìn)行分型檢測(cè)，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海之江生物有限公司，可檢測(cè)包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59及68型在內(nèi)的13種HPV亞型。（3）操作方法：嚴(yán)格按照試劑盒和儀器使用說(shuō)明書進(jìn)行規(guī)范操作。

1.2.2

液基薄層細(xì)胞（TCT）檢測(cè)樣品采集方法同

上，采用特制采樣刷在宮頸口按同一方向旋轉(zhuǎn)5～8圈，將刷取的宮頸細(xì)胞保存于細(xì)胞保存液中。使用美國(guó)TriPath Imaging公司生產(chǎn)的Prep 2000型自動(dòng)制片染色機(jī)制成薄層細(xì)胞涂片，在顯微鏡下鏡檢觀察。細(xì)胞學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2001年國(guó)際癌癥協(xié)會(huì)推薦的子宮頸細(xì)胞學(xué)分類系統(tǒng)（TBS），鏡檢的結(jié)果分為5個(gè)層次，分別是未見(jiàn)上皮內(nèi)病變或惡性病變（NILM）、不典型鱗狀細(xì)胞（ASCH）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）、宮頸癌。所有的TCT涂片結(jié)果均由兩名專業(yè)的病理學(xué)醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立閱片和診斷報(bào)告。

1.2.3

組織病理檢查將陰道鏡下組織病理學(xué)診斷的最終結(jié)果視為宮頸病變的“金標(biāo)準(zhǔn)”。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第4版《WHO女性生殖器官腫瘤分類》，將診斷結(jié)果分為：正?；蚵宰訉m頸炎癥，宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）I級(jí)，CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)和宮頸癌。所有標(biāo)本的病理診斷均由兩名專業(yè)的病理學(xué)醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立閱片和診斷報(bào)告。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

HR-HPV DNA PCR檢測(cè)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算方法，將結(jié)果中RLU/CO＞1視為陽(yáng)性。TCT檢測(cè)中將病變程度為ASCH及以上視為陽(yáng)性。組織病理檢查結(jié)果將病變程度為CINⅠ級(jí)及以上視為陽(yáng)性。以組織病理檢查結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，計(jì)算和比較HR-HPV DNA PCR檢測(cè)和TCT檢測(cè)兩種方法的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用百分比表示計(jì)數(shù)資料，采用

χ

檢驗(yàn)，以

P

＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理檢測(cè)結(jié)果

對(duì)628例疑似子宮頸病變病人進(jìn)行病理組織檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正?；蜓装Y的病人有264例，子宮頸鱗狀上皮異常的病人364例，其中CINⅠ級(jí)117例，CINⅡ級(jí)128例，CINⅢ級(jí)81例，宮頸癌38例，陽(yáng)性率為57.96%。

2.2 高危型HPV分型檢測(cè)結(jié)果

高危型HPV分型檢測(cè)出陽(yáng)性病例357例，與病理診斷結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，真陽(yáng)性為334例，檢出率為53.18%（334/628）。見(jiàn)表1。

表1 疑似子宮頸病變628例高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）分型檢測(cè)結(jié)果/例

2.3 TCT篩查結(jié)果

TCT檢測(cè)出陽(yáng)性病例387例，與病理診斷結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，真陽(yáng)性病例244例，其中ASCH病人73例，LSIL病人82例，HSIL病人57例，宮頸癌病人32例，檢出率為38.85%（244/628）。見(jiàn)表2。

表2 疑似子宮頸病變628例TCT篩查結(jié)果/例

2.4 高危型HPV分型檢測(cè)和TCT診斷效能比較

高危型HPV分型檢測(cè)在宮頸癌及癌前病變篩查中的靈敏度，特異度，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，陰性預(yù)測(cè)值，符合率均顯著高于TCT檢測(cè)方法（

P

＜0.001）。見(jiàn)表3。

表3 疑似子宮頸病變628例高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）分型檢測(cè)和液基薄層細(xì)胞（TCT）診斷效能比較/%（n/N）

2.5 高危型HPV各亞型與宮頸癌及癌前病變的相關(guān)性

將13種HPV亞型與宮頸癌及癌前病變進(jìn)行相關(guān)性回歸分析，結(jié)果表明，16、18型HPV在宮頸癌病變中的感染率最高，33、52及58型HPV也與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)（

P

＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）各亞型與宮頸癌及癌前病變的相關(guān)性分析

2.6 比較不同年齡階段HPV感染情況

在接受檢測(cè)的628例病人中，有357例病人出現(xiàn)高危型HPV感染，總感染率為56.85%。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)病人的HPV感染率隨年齡的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，而且40歲及以上病人的HPV感染率顯著高于20～29歲的年輕病人（

P

＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 疑似子宮頸病變628例不同年齡階段人乳頭瘤病毒（HPV）感染情況的比較/例（%）

3 討論

宮頸癌是發(fā)展中國(guó)家最常見(jiàn)的婦科癌癥之一。在我國(guó)女性常見(jiàn)的惡性腫瘤中，宮頸癌發(fā)病率也僅次于乳腺癌，每年有超過(guò)13萬(wàn)的新增宮頸癌病例和5.3萬(wàn)的死亡人數(shù)。近年來(lái)，宮頸癌的發(fā)病率有逐漸上升的趨勢(shì)，這可能由于各種原因如不安全性行為，初次性交年齡提前，不使用避孕套以及HIV免疫抑制導(dǎo)致的HPV感染有關(guān)。在過(guò)去研究中發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的宮頸癌都是由特定類型的HPV感染引起的。目前已分離的HPV亞型達(dá)100多種，其中最常見(jiàn)的是高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59以及68型。盡管通過(guò)對(duì)不同HPV亞型的研究已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了能夠預(yù)防宮頸癌的HPV疫苗，但由于HPV疫苗不能預(yù)防既定感染，也不能預(yù)防所有類型的HPV，同時(shí)，考慮到發(fā)展中國(guó)家經(jīng)濟(jì)和疫苗普及率等因素，預(yù)防和篩查HPV感染仍是防治宮頸癌的主要策略。

目前，宮頸癌及癌前病變篩查診斷主要有3種方法，即子宮頸細(xì)胞學(xué)檢查，陰道鏡檢查及組織病理學(xué)檢查。TCT法與傳統(tǒng)的宮頸刮片巴氏涂片相比，排除了血液、黏液和炎癥等因素的干擾，明顯提高了標(biāo)本的質(zhì)量及宮頸異常細(xì)胞檢出率。但由于TCT制片及鏡檢過(guò)程都需要憑借專業(yè)操作人員的經(jīng)驗(yàn)，因此，人為因素的干預(yù)可能會(huì)導(dǎo)致TCT檢測(cè)結(jié)果與病理檢測(cè)結(jié)果的不一致。另外，宮頸癌及癌前病變是多中心的局灶性病變，不同部位病變程度可能不一致，取材不同亦會(huì)導(dǎo)致診斷結(jié)果的差異性。

宮頸癌是目前唯一確定病因的惡性腫瘤，在HPV慢性感染早期，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展緩慢，多數(shù)宮頸癌始終處于不典型增生狀態(tài)，多數(shù)情況下，癌前病變可穩(wěn)定存在7～10年。研究表明，在宮頸癌及癌前病變?cè)缙跓o(wú)病癥狀態(tài)時(shí)，即可檢測(cè)到HPV的感染，而隨著病程的不斷進(jìn)展，不同階段的宮頸癌前病變中HPV的病毒載量也會(huì)發(fā)生改變。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，高靈敏度和高特異度的HPV分型診斷試劑及相關(guān)儀器被發(fā)明。2003年，HC2檢測(cè)獲得FDA批準(zhǔn)，它是一種定量檢測(cè)HPV亞型的核酸雜交檢測(cè)方法，確定了13種高危HPV類型的存在。2009年批準(zhǔn)的高危型HPV分型檢測(cè)除了檢測(cè)到HC2檢測(cè)到的13種亞型外，還可檢測(cè)到HPV-66等其他亞型。高危型HPV分型檢測(cè)技術(shù)在預(yù)防和診斷HPV感染的子宮頸癌及癌前病變中扮演著越來(lái)越重要的作用。

我們的研究表明，組織病理學(xué)檢測(cè)出628例就診病人中有364例發(fā)生宮頸癌及癌前病變，陽(yáng)性率為57.96%。將病理診斷結(jié)果視為“金標(biāo)準(zhǔn)”發(fā)現(xiàn)，高危型HPV分型法檢測(cè)出真陽(yáng)性病人334例，檢出率為53.18%，顯著高于TCT法的38.85%。然后我們通過(guò)比較TCT法和高危型HPV分型檢測(cè)的診斷效能，發(fā)現(xiàn)高危型HPV分型檢測(cè)在宮頸癌及癌前病變篩查中的靈敏度，特異度，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，陰性預(yù)測(cè)值，符合率均顯著高于TCT檢測(cè)方法（

P

＜0.001）。這由于兩種檢測(cè)方法的原理不同，TCT通過(guò)檢測(cè)當(dāng)前宮頸脫落細(xì)胞的病理狀態(tài)，而HPV分型檢測(cè)從基因組上檢測(cè)宮頸細(xì)胞中HPV的分型及病毒載量。研究表明，15種高危型HPV是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要因素，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82，其中16型和18型是致瘤性最強(qiáng)的病毒菌株，導(dǎo)致超過(guò)75%的宮頸癌病例和大多數(shù)其他生殖器癌癥。我們的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)16、18型HPV感染與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，33、52及58型HPV次之。接下來(lái)，我們研究了不同年齡階段HPV感染情況，由于年齡的增長(zhǎng)，人體的免疫力不斷降低，對(duì)病毒的抵抗力和抑制力顯著下降，我們發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)，HPV感染率也逐漸升高。

綜上所述，高危型HPV分型檢測(cè)優(yōu)于TCT法，應(yīng)用高危型HPV分型檢測(cè)不僅對(duì)當(dāng)前宮頸病變的診斷具有指導(dǎo)意義，而且與單獨(dú)的細(xì)胞學(xué)相比更好地預(yù)測(cè)了未來(lái)5～10年宮頸癌變前的發(fā)展，對(duì)宮頸癌預(yù)防和治療具有重要意義，值得在臨床中做進(jìn)一步推廣。