蒲公英提取物調控程序化死亡基因5對骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖、凋亡的影響及其機制研究

卿海輝，張小舟，胡敏

作者單位：武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院骨科三病區(qū)，湖北孝感432000

骨關節(jié)炎是一種退行性關節(jié)疾病，常發(fā)生于中老年人群。軟骨損傷是骨關節(jié)炎發(fā)病的主要因素，軟骨細胞增殖能力減弱、凋亡增加是軟骨退變的主要原因，因此，促進軟骨細胞的增殖并抑制其凋亡可減輕軟骨損傷，對骨關節(jié)炎的治療具有積極意義。蒲公英是一種多年生草本植物，具有清熱解毒、抗炎消腫、利尿通淋等藥理作用。研究顯示，蒲公英總黃酮可降低阿爾茨海默病大鼠神經元細胞凋亡，改善大鼠記憶功能；蒲公英提取物可通過提高磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）蛋白表達水平促進大鼠骨骼肌細胞的增殖，降低脂多糖誘導的大鼠骨骼肌細胞炎癥反應。目前，蒲公英提取物對軟骨細胞增殖、凋亡的影響還未知。程序化死亡基因5（programmed death gene 5，PDCD5）是一種促進細胞凋亡的基因，其在骨關節(jié)炎軟骨和滑膜中的表達明顯高于健康組織，與骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究主要探討了蒲公英提取物對骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖和凋亡的影響及其是否可通過調控PDCD5表達發(fā)揮作用，以期為骨關節(jié)炎的治療藥物的研發(fā)提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

試劑與儀器蒲公英提取物由華中農業(yè)大學實驗室提取，主要成分為黃酮。DMEM培養(yǎng)基（批號SH30022.01B）、胰蛋白酶（批號SH30243.01 B）、胎牛血清（批號SH30066.02）購自美國Hyclone公司，Trizol（批號50300413）、lipofectamine2000試劑盒（11668-019）購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒（批號：K1622）為購自美國Thermo公司，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（批號20170707054）購自Millipore公司，MTT法試劑盒（批號20170623）購自武漢博士德公司，熒光定量PCR試劑盒（批號LB3597）購自美國Thermo公司，PDCD5（批號ab3219）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）（批號GR92375-1）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（P21）（批號ab37168）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）（批號ab136285）、Bcl-2相關X（Bax）（批號ab7977）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（批號GR1001123）一抗購自美國Abcam公司，膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin VFITC/PI）試劑盒（批號20180617）購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.1.2

標本來源從武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院2018年1月至2019年6月獲得接受關節(jié)置換的5例骨關節(jié)炎病人的關節(jié)軟骨，所有病人影像學變化及病理特征均符合中華醫(yī)學會骨科分會《骨關節(jié)炎診療指南（2018年版）》，以上標本的獲得均經武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院倫理委員會批準（XGLY2018-08-25）且病人知情同意。

1.2 實驗方法

1.2.1

軟骨細胞的分離與培養(yǎng)參考文獻分離軟骨細胞，無菌條件下用含有1%雙抗的磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）漂洗3次軟骨標本組織，切取軟骨層為軟骨薄片，用含有雙抗的PBS漂洗軟骨薄片3次，手術刀將軟骨組織切成1 mm的碎片并清洗，然后置于0.25%胰蛋白酶消化液中37℃消化30 min，棄去消化液；加入2～3倍的DMEM配制的0.2%Ⅱ型膠原酶37℃消化16 h，離心，棄上清；DMEM培養(yǎng)基洗滌3次，離心棄上清；加入20%胎牛血清/DMEM培養(yǎng)液5 mL，200目鋼網過濾收集軟骨細胞懸液，將細胞懸液稀釋成2.5×10個/毫升接種于培養(yǎng)瓶中，37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到90%時消化細胞進行傳代，本實驗采用2～3代細胞。

1.2.2

軟骨細胞轉染收集處于對數生長期的軟骨細胞，以每孔1×10個細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞融合至50%～70%時，利用lipofectamine2000轉染試劑盒分別轉染PDCD5過表達載體（pcDNA3.1-PDCD5組）及陰性對照（pcDNA3.1組）、PDCD5小干擾RNA（si-PDCD5）及陰性對照（si-NC組）。轉染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3

細胞分組未進行轉染的軟骨細胞分為對照組：不做任何處理，正常培養(yǎng)；不同濃度蒲公英提取物組：分別用2.5 g/L、5 g/L、10.0 g/L的蒲公英提取物干預。蒲公英濃度參考文獻［9］。pcDNA3.1-PDCD5組、pcDNA3.1組軟骨細胞均采用5 g/L的蒲公英提取物干預，分別記為蒲公英提取物5 g/L+pcDNA3.1-PDCD5組、蒲公英提取物5 g/L+pcDNA3.1組。

1.2.4

MTT法檢測細胞增殖情況分別將對數生長期未進行轉染的軟骨細胞、pcDNA3.1-PDCD5組、pcDNA3.1組軟骨細胞制備成單細胞懸液，調整濃度為2×10個/毫升，每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板中。按照“1.2.3”分組進行處理，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 g/L的噻唑藍（MTT），培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。取出培養(yǎng)板，每孔加入150 μL二甲基亞砜，待結晶紫溶解后，振蕩混合均勻，于酶標儀490 nm波長處檢測吸光度，每組3個復孔求平均值。

1.2.5

流式細胞儀檢測細胞凋亡分別將對數生長期未進行轉染的軟骨細胞、pcDNA3.1-PDCD5組、pcDNA3.1組軟骨細胞制備成單細胞懸液，調整濃度為2×10個/毫升，每孔1 mL接種于24孔板中，按照“1.2.3”分組處理。培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化，收集細胞。1 500 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗。取1×10個細胞，加入500 μL 1×結合緩沖液，避光加入10 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光放置15 min。然后加入5 μL PI，輕輕混勻，避光放置5 min后流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，計算凋亡細胞率。

1.2.6

蛋白質印跡法檢測蛋白表達情況收集處理后細胞，加入含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解液，4℃提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度；聚丙烯凝膠電泳分離目的蛋白，濕轉至PVDF膜，5%牛血清蛋白室溫封閉1.5 h；一抗（PDCD5、cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2、GAPDH）稀釋后4℃孵育過夜，Tris-Hcl緩沖液（TBST）漂洗；二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗；電化學發(fā)光顯影液顯色，采集圖片，Image J處理系統(tǒng)分析吸光度，GAPDH為內參進行灰度值比較。

1.2.7

實時熒光定量PCR檢測細胞PDCD5 mRNA表達水平Trizol試劑提取細胞中總RNA，微量核酸儀檢測提取的RNA的純度和濃度。參照逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為互補DNA（cDNA）。以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增條件：95℃10 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共進行35個循環(huán)。引物序列：PDCD5正向5'-CGGAATTCACCATGGCGGACGAGGAGC-3'，反向5'-CGGAATTCAATAATCGTCATCTTCATC-3'；GAPDH正 向5'-ACATCGCTCAGAGACCATGG-3'，反向5'-GAAGTTGAGGTCAATGAAGGC-3'。采用2法計算PDCD5 mRNA的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

SPSS 22.0軟件進行數據分析。兩組間比較采用成組

t

檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，采用GraphPad Prism對實驗數據進行圖片的制作。

P

＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蒲公英提取物對骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖的影響

與對照組比較，不同濃度蒲公英提取物處理后，骨關節(jié)炎軟骨細胞48 h、72 h增殖水平顯著增加，cyclin D1水平增加，P21水平則降低，且隨濃度的增加呈劑量依賴性（

P

＜0.05）。具體情況見圖1、表1。

表1 蒲公英提取物對軟骨細胞活性和cyclin D1和P21蛋白表達的影響/±s

圖1 蒲公英提取物對細胞骨關節(jié)炎軟骨細胞中cyclin D1和P21蛋白表達的影響

2.2蒲公英提取物對骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡的影響

與對照組比較，不同濃度蒲公英提取物處理后，骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡率顯著降低，凋亡蛋白Bax水平降低，Bcl-2水平則升高，且隨濃度的增加呈劑量依賴性降低（

P

＜0.05）。見圖2、表2。

表2 蒲公英提取物對軟骨細胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表達的影響/±s

圖2 蒲公英提取物對骨關節(jié)炎軟骨細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

2.3 蒲公英提取物對骨關節(jié)炎軟骨細胞中PDCD5表達的影響

與對照組比較，不同濃度蒲公英提取物處理后，PDCD5 mRNA和蛋白水平隨濃度的增加呈劑量依賴性降低（

P

＜0.05）。見表3。

表3 蒲公英提取物對軟骨細胞中程序化死亡基因5（PDCD5）mRNA和蛋白表達的影響/±s

2.4 抑制PDCD5表達對骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖、凋亡的影響

與si-NC比較，抑制PDCD5的表達后，si-PDCD5組48 h、72 h增殖水平顯著增加，細胞凋亡率顯著降低，PDCD5、P21、Bax蛋白水平顯著降低，cyclin D1、Bcl-2蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05）。見表4，5。

表4 抑制程序化死亡基因5（PDCD5）對軟骨細胞活性和凋亡的影響/±s

2.5 過表達PDCD5能逆轉蒲公英提取物對骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖的作用

與對照組組比較，蒲公英提取物5 g/L處理后，軟骨細胞48 h、72 h增殖水平顯著增加，PDCD5、P21水平顯著降低，cyclin D1水平顯著升高（

P

＜0.05）；與蒲公英提取物5 g/L+pcDNA3.1組比較，蒲公英提取物5 g/L+pcDNA3.1-PDCD5組軟骨細胞增殖顯著降低，PDCD5、P21水平顯著增加，cyclin D1水平顯著降低（

P

＜0.05）。見表6，7。

表6 過表達程序化死亡基因5（PDCD5）能逆轉蒲公英提取物對軟骨細胞活性的影響/±s

2.6過表達PDCD5能逆轉蒲公英提取物對骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡的作用

與對照組比較，蒲公英提取物5 g/L處理后，軟骨細胞凋亡率顯著降低，Bax水平顯著降低，Bcl-2水平顯著升高（

P

＜0.05）；與蒲公英提取物5 g/L+pcDNA3.1組比較，轉染pcDNA3.1-PDCD5后，蒲公英提取物5 g/L+pcDNA3.1-PDCD5組軟骨細胞凋亡率顯著升高，Bax水平顯著升高，Bcl-2水平顯著降低（

P

＜0.05）。見表8。

表8 過表達程序化死亡基因5（PDCD5）能逆轉蒲公英提取物對軟骨細胞凋亡的凋亡蛋白表達的影響/±s

3 討論

骨關節(jié)炎是骨科常見的疾病，主要發(fā)生于老年人群。骨關節(jié)炎又被稱為退行性關節(jié)炎、增生性關節(jié)炎、骨關節(jié)病等，該病主要侵襲病人的關節(jié)軟骨、滑膜組織、骨組織，臨床常表現為關節(jié)疼痛，關節(jié)畸形，功能障礙，進而影響病人的活動能力。軟骨細胞是軟骨代謝活動的成分之一，參與軟骨基質的合成。目前大量研究證實，骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展與軟骨細胞的異常增殖和凋亡密切相關，促進軟骨細胞的增殖和抑制其凋亡是骨關節(jié)炎治療的主要途徑。

蒲公英屬于菊科植物，價格低廉、資源豐富。研究顯示，蒲公英提取物可抑制胃癌、乳腺癌、宮頸癌等腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。研究顯示，蒲公英提取物可減少葡聚糖硫酸鈉結腸中的炎癥狀況和氧化應激。目前，蒲公英提取物對軟骨細胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究結果顯示，蒲公英提取物處理軟骨細胞后，細胞增殖水平、cyclin D1、Bcl-2蛋白水平隨濃度的增加呈劑量依賴性增加，凋亡率、P21、Bax蛋白水平隨濃度的增加呈劑量依賴性降低，說明蒲公英提取物可促進軟骨細胞增殖，抑制細胞凋亡，提示蒲公英提取物可能是骨關節(jié)炎的治療的潛在藥物。

表5 抑制PDCD5對軟骨細胞中相關蛋白表達的影響/±s

表7 過表達程序化死亡基因5（PDCD5）能逆轉蒲公英提取物對軟骨細胞中相關蛋白表達的影響/±s

骨關節(jié)炎中軟骨基質的破壞、軟骨細胞異常喪失與疾病的發(fā)展密切相關，細胞凋亡在細胞喪失過程中發(fā)揮重要作用。PDCD5是北京大學疾病基因研究中心發(fā)現的凋亡相關基因，有研究顯示，活動性類風濕關節(jié)炎病人的血清及關節(jié)液中PDCD5的水平升高。本研究結果顯示，抑制PDCD5的表達后，si-PDCD5組骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖水平、cyclin D1、Bcl-2蛋白水平顯著增加，細胞凋亡率、PDCD5、P21、Bax蛋白水平顯著降低，提示PDCD5在骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用。本研究還顯示，蒲公英提取物作用軟骨細胞后，細胞中PDCD5表達降低，而過表達PDCD5逆轉了蒲公英提取物對軟骨細胞增殖和凋亡的影響，提示蒲公英提取物可能通過抑制軟骨細胞中PDCD5表達促進細胞的增殖和抑制細胞凋亡。

綜上所述，蒲公英提取物可促進骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖，抑制細胞凋亡，其可能通過調控PDCD5的表達發(fā)揮作用。但本研究還存在一定的不足之處，僅在細胞層面探討了蒲公英提取物對軟骨細胞增殖和凋亡的影響，接下來將通過動物模型實驗深入分析蒲公英提取物對膝骨關節(jié)炎模型小鼠的影響及其他可能的調控途徑，為蒲公英提取物用于臨床治療骨關節(jié)炎提供實驗依據。