毒害艾美耳球蟲河南分離株早熟系選育及生物學特性研究

董 青

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)藥學院 ， 河南 鄭州 450011)

雞球蟲病是由一種或幾種雞艾美耳球蟲引起的以腸道病變?yōu)橹饕卣鞯?、危害極為嚴重的全球性寄生蟲病[1]。目前，本病的防治主要依賴藥物，但是隨著藥物的廣泛使用，抗球蟲藥藥物殘留問題和對生態(tài)環(huán)境的污染日趨嚴重，因此，疫苗免疫將成為預防球蟲病的主流[2-3]?，F(xiàn)有研究認為，雞發(fā)生球蟲病后可獲得針對同種球蟲的較強的免疫力，這也正是雞球蟲病活卵囊疫苗研究的基本原理。球蟲的自然分離株感染雞后均會不同程度地對雞的生長性能產(chǎn)生影響，而具有良好免疫原性的減毒株可以克服這一缺點。目前，雞球蟲的致弱方法包括早熟選育、雞胚適應及輻射致弱等，但其中早熟選育被認為是最成功的，且獲得的早熟系在遺傳上也相對最為穩(wěn)定[4-6]。此技術(shù)在國內(nèi)外被先后采用，英國Houghton Lab研制出由柔嫩艾美耳球蟲(Eimerianecatrix,E.tenella)、堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)、 和緩艾美耳球蟲(E.mitis)、早熟艾美耳球蟲(E.praecox)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)、布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)和毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)共7種早熟致弱蟲株組成的球蟲苗Paracox，該球蟲苗在英國、荷蘭和愛爾蘭等國家投入市場使用，對防治雞球蟲病發(fā)揮了積極的作用[7-9]。

球蟲在免疫保護力上存在著蟲株差異，因此有必要對不同的蟲株進行早熟選育。本試驗對河南地區(qū)純種E.necatrix進行早熟選育，選育成功后對E.necatrix早熟減毒株與母株的基本生物學特性進行比較研究，為早熟減毒株的早熟機理、早熟減毒株疫苗研制和研究雞球蟲病球蟲種間和株間的分子生物學差異提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 剛出殼后的1日齡SPF雞放入專用雞盒運回實驗室，在進行嚴格消毒的無球蟲的育雛室內(nèi)飼養(yǎng)至2～4周齡；禽舍的最初溫度控制在30～35 ℃，每周遞減2 ℃，直至室溫，濕度控制在55%～65%；24 h光照；飼喂經(jīng)高壓滅菌的、無任何藥物添加的SPF雞全價育雛顆粒飼料；飲水引自天然泉水，采用純凈水設(shè)備經(jīng)過三重反滲透凈化處理，且加入紫外線和臭氧消毒，確保飲水無球蟲。

1.2 蟲株E.necatrix純種蟲株分離自河南省洛陽市某雞場，分離、鑒定、純化后保存，試驗前經(jīng)雞體傳代復壯。

1.3 早熟減毒株選育和潛隱期的研究 參照Jeffers等[7]建立的艾美耳屬球蟲早熟系選育法，將E.necatrix蟲株孢子化卵囊用水離心洗滌(轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，時間為10 min)3～5次，以5×104個/羽的劑量經(jīng)口接種SPF雛雞，接種卵囊后的第4天起，收集雛雞的新鮮糞便(1 次/h)，光學顯微鏡檢測有無卵囊。第1次檢測到卵囊的時間為潛隱期，收集卵囊進行孢子化培養(yǎng)，培養(yǎng)后的卵囊，以5×104個/羽 的劑量再次經(jīng)口接種SPF雛雞，直到潛隱期時間縮短，并至少連續(xù)3代穩(wěn)定。

1.4 形態(tài)學研究 在光學顯微鏡下對選取的第30代E.necatrix早熟減毒株和母株各30個孢子化大小進行測量長、寬，并計算其形狀指數(shù)和大小。

1.5 致病性研究 將3日齡SPF雞隨機分為8組，每組10只，隔離飼養(yǎng)，其中第1組為空白對照組，第2～4組 試驗雞經(jīng)口灌服E.necatrix母株卵囊，劑量分別為1.0×104、5.0×104個/羽和10.0×104個/羽；第5～8組接種E.necatrix早熟減毒株卵囊，劑量分別為1.0×104、5.0×104、10.0×104個/羽和15.0×104個/羽。 期間觀察試驗雞的死亡、寄生部位、對雞的致病性，計算相對增重情況，并進行毒害艾美耳球蟲病變記分[10]。

1.6 免疫原性研究 3日齡SPF雞隨機分為11組，每組10只，隔離飼養(yǎng)，其中第1組為空白對照組，不攻蟲不免疫；第2組和第7組為攻蟲對照組，只攻蟲不免疫；第3～6組分別經(jīng)口灌服免疫不同劑量的E.necatrix母株孢子化卵囊，劑量分別為200、500、1 000個/羽 和2 000個/羽，第8～11組接種E.necatrix早熟減毒株孢子化卵囊，劑量分別與母株相同。免疫后21 d各免疫組和攻蟲對照組感染同種E.necatrix母株孢子化卵囊，劑量為5.0×104個/羽；攻蟲感染后7 d 處死全部試驗雞，以死亡、相對增重及小腸病變評價E.necatrix母株和早熟減毒株免疫原性。

3日齡SPF雞隨機分為4組，每組10只，隔離飼養(yǎng)，其中第1組為空白對照組，不攻蟲不免疫；第2組為攻蟲對照組，只攻蟲不免疫；第3組口服500個/羽 劑量的E.necatrix母株孢子化卵囊；第4組 口服500個/羽劑量的E.necatri早熟減毒株孢子化卵囊。除第1組外，第2～4組3 d后感染同種E.necatrix母株孢子化卵囊，劑量為5.0×104個/羽；并每天分別收集各組所有糞便，稱重，進行每克糞便中卵囊記數(shù)，用麥克馬斯特板計數(shù)法計算每克糞便卵囊數(shù)(OPG)，直到糞便中無球蟲卵囊為止，計算排卵囊期內(nèi)各組中每羽雞排卵囊總量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計 所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 20.0 軟件中單因素方差分析(One-way ANVOA)進行統(tǒng)計，P≤0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著，均值采用Duncan法進行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 早熟系選育 經(jīng)過連續(xù)30代的早熟選育后，E.necatrix早熟減毒株的潛隱期縮短了23 h，由母株的144 h縮短至121 h，并且連續(xù)3代的潛隱期穩(wěn)定在121 h，達到選育目標，各代次蟲株均寄生于雞體小腸中段。

2.2 形態(tài)學研究 經(jīng)10×40倍顯微鏡觀察顯示，第30代E.necatrix早熟減毒株和母株的孢子化卵囊各30個，結(jié)果見表1。從表1可知，E.necatrix早熟減毒株卵囊的長、寬以及大小均比母株的小，但差異不顯著(P>0.05)；早熟減毒株(1.24)的卵囊指數(shù)比母株(1.21)的稍大或者相等。

表1 30個隨意挑選出的E. necatrix早熟減毒株和母株孢子化卵囊各度量值之間的對比Table 1 Comparison of the size of 30 haphazardly selected parent and precocious attenuated strain of E. necatrix

2.3 致病性研究 3日齡試驗雞在感染1.0×104個E.necatrix母株孢子化卵囊劑量(第2組)時，病變記分均1～2分，而感染同劑量的E.necatrix早熟減毒株孢子化卵囊(第5組)時，試驗雞無球蟲臨床癥狀，病變記分均≤+1分，母株和早熟減毒株組均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；感染5.0×104個E.necatrix母株孢子化卵囊劑量以上(第3組)時均不同程度的表現(xiàn)出食欲不振、精神委頓、羽毛逆立、縮脖呆立、扎堆、排血便的癥狀，且相對增重率明顯降低，小腸病變記分均≥+3分，試驗雞有10%的死亡，相對增重率為92.25%，而感染同劑量的E.necatrix早熟減毒株孢子化卵囊(第6組)時，試驗雞小腸病變記分為1～2分，存活率100%，相對增重率為95.53%；感染10.0×104個母株孢子化卵囊劑量(第4組)的試驗雞有40%的死亡，且相對增重率明顯降低，為85.32%，雞病變記分為3～4分，而感染同劑量的E.necatrix早熟減毒株組(第7組)毒力明顯減弱，試驗雞小腸病變記分為2～3分，存活率仍為100%，相對增重率為93.42%；直至感染15.0×104個E.necatrix早熟減毒株孢子化卵囊(第8組)時，試驗雞有10%的死亡。感染E.necatrix早熟減毒與母株各劑量組試驗雞，剖檢后顯示均寄生于雞體小腸中段。結(jié)果見表2。

表2 E.necatrix母株以及早熟減毒株孢子化卵囊對雞的致病性試驗結(jié)果Table 2 Virulence test results of parent and precocious attenuated strain of E.necatrix

用E.necatrix母株單卵囊后代感染10只雞(5.0×104個/羽)，結(jié)果接種后第4、5天試驗雞開始出現(xiàn)臨床褐色血便，第5天處死全部試驗雞后，剖檢可見典型的小腸病變，小腸腔內(nèi)有大量出血，漿膜面有紅色或白色斑點。消化道其他部位沒有雞球蟲病的病變(中插彩版圖1)。

圖1 E.necatrix母株感染雞病變Fig.1 Lesions in chickens after infection by parent strain of E.necatrixA：黏膜層； B：漿膜層A：Mucous layer； B：Serosa layer

用E.necatrix早熟減毒株單卵囊后代感染10只雞(5.0×104個/羽)，結(jié)果接種后發(fā)現(xiàn)其毒力較母株卵囊明顯減弱(P<0.05)，試驗雞小腸病變記分≤+2分(中插彩版圖2)。

圖2 E.necatrix早熟減毒株感染雞病變Fig.2 Lesions in chickens after infection by precocious attenuated strain of E.necatrixA：B：漿膜層； 黏膜層A：B：Serosa layer； Mucous layer

2.4 免疫原性研究 所有空白組的試驗雞均健康存活，腸道無病變(第1組)；攻蟲對照組(第2組和第7組)存活率均為90%，所有試驗雞的小腸病變記分均≥+3分；免疫攻蟲組(第3～6組和第8～11組)各試驗雞均健康存活，各劑量組試驗雞的腸道病變記分均≤+1分，200個/羽劑量的E.necatr免疫組即能產(chǎn)生較好的免疫保護力，說明E.necatrix母株和早熟減毒株均具有良好的免疫原性。結(jié)果見表3。

表3 E.necatrix母株以及早熟減毒株免疫原性試驗結(jié)果Table 3 Immunogenicity test results of parent and precocious attenuated strain of E.necatrix

感染后第2天開始收集雞糞，10只雞糞混勻，按麥克馬斯特板計數(shù)法計數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7～10 d雞糞中OPG最高，排卵囊期內(nèi)各組中每羽雞排卵囊總量結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，第1組未檢測出E.necatrix卵囊，第3組和第4組及攻蟲對照組均檢測出球蟲卵囊，且第1組與其他組差異性顯著(P<0.05)；第3組(母株免疫組)排卵囊高峰期在接種后的第9天，第7～9天每羽雞排卵囊總量分別為135×104、687×104個/羽和799×104個/羽；第4組(早熟減毒株免疫組)排卵囊高峰期在接種后的第8天，較母株提前了1 d，第7～9天每羽雞排卵囊總量分別為486×104、623×104個/羽和110×104個/羽；兩組免疫組極顯著低于攻蟲對照組(P<0.01)。說明免疫組均產(chǎn)生免疫作用，抑制了球蟲卵囊的繁殖。

表4 接種后7～10 d的排卵囊總量 (×104個/羽)Table 4 Total amaunt of ovulatory sac 7-10 days after inoculation

3 討論

3.1 早熟減毒株選育 球蟲具有地區(qū)適應性，所以，本地區(qū)選育出的球蟲早熟致弱蟲株只能用于本地區(qū)的免疫預防，用在其他地區(qū)時，常未達到理想效果。本試驗經(jīng)過連續(xù)30代的早熟選育后，E.necatrix潛隱期縮短了23 h，并且連續(xù)3代傳代潛隱期穩(wěn)定。經(jīng)研究表明，早熟減毒株潛隱期縮短的原因是其裂殖體發(fā)育快，裂殖生殖不完全，提前進入配子生殖[8-9]。要證明本試驗所選育的早熟減毒株潛隱期縮短、發(fā)育加快的可能原因，以及所選育的早熟減毒株是否具有基因突變，還需做進一步的內(nèi)生性發(fā)育以及遺傳穩(wěn)定性的研究。

3.2 卵囊大小測量 本試驗經(jīng)過連續(xù)30代早熟選育得到的E.necatrix早熟減毒株，E.necatrix早熟減毒株的孢子化卵囊大小為20.50 μm×16.55 μm，相對應的母株大小為21.50 μm×18.00 μm，早熟減毒株比母株略小。韓靜芳等[6]和張志敏等[11]的研究結(jié)果表明，球蟲卵囊的大小可能與其潛隱期及致病性有關(guān)系。造成早熟減毒株卵囊大小相對于母株偏小的原因可能是由于潛隱期縮短，最后一代裂殖體發(fā)育快，裂殖生殖不完全，提前進入配子生殖影響到蟲體在體內(nèi)的發(fā)育。

3.3 毒力及致病性測定 本試驗的毒力性試驗可以看出，雞感染E.necatrix早熟減毒株時3個劑量組(1×104、5×104個/羽和10×104個/羽)死亡率分別為0、0、0，而母株在感染同劑量時死亡率分別為0、10%、40%；3日齡試驗雞在感染1.0×104個E.necatrix母株孢子化卵囊劑量時，病變記分均1～2分，而感染同劑量的E.necatrix早熟減毒株孢子化卵囊時，試驗雞無球蟲臨床癥狀，病變記分均≤1分。這些指標表明，E.necatrix早熟減毒株的致病性明顯低于母株。這與之前劉群等研究早熟柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)的結(jié)果相似。劉群等[12]對E.tenella的研究結(jié)果顯示，感染0.1×104個/羽母株卵囊的致病力相當于感染10×104個/羽早熟減毒株卵囊的致病力。導致早熟減毒株毒力減弱的可能原因：在球蟲生活史當中，最后一代裂殖生殖階段是致病性最強的階段，由于早熟減毒株裂殖體發(fā)育快，裂殖生殖不完全，提前進入配子生殖，導致了早熟減毒株繁殖力有所減弱。由于早熟減毒株裂殖體變小所以對雞腸道組織的損傷減輕，只有在超高劑量的早熟減毒株感染時才會產(chǎn)生血便，但血便量不僅少而且持續(xù)時間短，所以早熟減毒株致病性降低，臨床癥狀不明顯，可作為球蟲疫苗的候選蟲株。

3.4 免疫原性測定 球蟲感染宿主后可在體內(nèi)誘導產(chǎn)生保護性免疫反應。自然感染球蟲中，球蟲生活史早期的無性階段是誘導保護性免疫的最重要的階段[13]。E.necatrix早熟減毒株在球蟲發(fā)育史中缺失了1或2代裂殖生殖，因而不影響其免疫原性。本試驗的免疫原性試驗可以看出，200個/羽劑量的E.necatrix早熟減毒株和母株即能產(chǎn)生較好的免疫保護力，免疫組增重和病變記分與母株的相當，說明E.necatrix早熟減毒株保持了母株良好的免疫原性。這與Davies、Hein、Shirley等、Montes等得出的早熟減毒株的免疫原性與母株相比較無明顯變化結(jié)果一致[14-17]。但李建梅等、Chapman等認為毒害艾美耳球蟲的免疫原性在雞的7種球蟲中最弱，并說明雞球蟲的免疫研究中，不同種球蟲的抗原存在差異，同種不同株間的抗原也存在差異，同一個體的不同發(fā)育階段抗原也不盡相同[18-19]。

本試驗獲得了河南省E.necatrix早熟減毒株，發(fā)現(xiàn)其具有潛在期明顯縮短、致病性較母株弱、保持了母株免疫原性等球蟲早熟減毒株的獨特特點，為河南省雞球蟲活卵囊疫苗的研制提供了科學依據(jù)。