阿苯達(dá)唑?qū)?種金絲猴毛首線蟲驅(qū)蟲效果試驗(yàn)

賈 婷 ， 趙素芬 ， 羅 靜 ， 劉連貴 ， 韓姝伊 ， 孫冬婷 ， 馮勝勇 ， 夏茂華 ， 黃菁晶 ， 張軼卓 ， 何宏軒 ， 張成林

(1.北京動(dòng)物園 圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 北京 西城 100044 ； 2.中國科學(xué)院動(dòng)物研究所 ， 北京 朝陽 100101)

毛首線蟲(Trichurussp.)，亦稱鞭蟲，屬毛首目(Trichurata)，毛首科(Trichuridae)，毛首屬(Trichuris)線蟲[1]。在全球分布，能感染多種動(dòng)物，是常見且危害嚴(yán)重的胃腸道寄生蟲[2]。臨床上，圈養(yǎng)靈長類動(dòng)物對胃腸道寄生蟲敏感，尤其以毛首線蟲感染率高[3]。金絲猴對毛首線蟲極為敏感，感染率高達(dá)80%以上，并可引起發(fā)病與死亡[4]。輕度感染時(shí)，動(dòng)物出現(xiàn)間歇性腹瀉、貧血 ； 嚴(yán)重感染時(shí)，動(dòng)物出現(xiàn)精神沉郁、食欲減退、體溫升高、劇烈腹瀉、排血色水樣糞便并附有黏液，消瘦、貧血，甚至引起動(dòng)物死亡[5-8]。金絲猴又名仰鼻猴，國家一級重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，現(xiàn)存5個(gè)種，其中川金絲猴(R.roxellana)、黔金絲猴(R.brelichi)和滇金絲猴(R.bieti)3個(gè)種為我國特有種。金絲猴的人工飼養(yǎng)始于1955年北京動(dòng)物園，在我國已有60年的飼養(yǎng)展出歷史[9-11]。目前，北京動(dòng)物園是全國唯一一家同時(shí)飼養(yǎng)川、黔、滇3種金絲猴，且這3種金絲猴均能進(jìn)行繁殖的單位。為保障動(dòng)物健康，北京動(dòng)物園獸醫(yī)工作者每年春、秋進(jìn)行寄生蟲普查，結(jié)果顯示，金絲猴糞便中存在大量寄生蟲蟲卵，對蟲卵結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)以毛首線蟲卵為主。雖然北京動(dòng)物園未出現(xiàn)毛首線蟲致死金絲猴病例，但病原長期存在于動(dòng)物體內(nèi)，不僅會對動(dòng)物機(jī)體造成損傷，蟲卵隨糞便排出體外，也會污染動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，感染其他動(dòng)物。為此，本試驗(yàn)開展北京動(dòng)物園飼養(yǎng)的川、黔、滇3種金絲猴毛首線蟲驅(qū)蟲試驗(yàn)研究，探索毛首線蟲在金絲猴體內(nèi)的消長規(guī)律，以期為金絲猴飼養(yǎng)管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 3只川金絲猴、4只黔金絲猴和4只滇金絲猴，資料信息見表1。11只受試動(dòng)物均飼養(yǎng)于北京動(dòng)物園金絲猴館內(nèi)，其飼養(yǎng)環(huán)境及食物結(jié)構(gòu)基本一致。試驗(yàn)過程中動(dòng)物自由采食和飲水，食物為北京動(dòng)物園金絲猴飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)餐，飲水為清潔涼開水。

表1 試驗(yàn)金絲猴信息表Table 1 Information of experimental golden monkeys

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)藥物及給藥方法 阿苯達(dá)唑(國藥準(zhǔn)字H12020496，中美天津史克制藥有限公司)。獸醫(yī)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)及前期測量數(shù)據(jù)評估動(dòng)物體重，按照10 mg/(kg·bw) 劑量將阿苯達(dá)唑拌入主食內(nèi)，由飼養(yǎng)員逐只投喂給動(dòng)物，確保用藥劑量，連續(xù)投喂3 d。

1.2.2 毛首線蟲蟲卵檢查 本試驗(yàn)分別于投喂阿苯達(dá)唑前3 d，投喂后3、6、9、15、20、25 d和30 d，采集受試動(dòng)物新鮮糞便，稱取1.0 g，采用飽和食鹽水漂浮法漂浮蟲卵，光學(xué)顯微鏡(Olympus BX51顯微成像系統(tǒng)，日本)下觀察，麥克馬斯特氏法(McMaster’s method)進(jìn)行蟲卵計(jì)數(shù)，計(jì)算每克糞便蟲卵數(shù) (Eggs per gram of feces，EPG)[12]、蟲卵轉(zhuǎn)陰率及平均蟲卵數(shù)，分析金絲猴體內(nèi)毛首線蟲的消長規(guī)律。

蟲卵轉(zhuǎn)陰率(%)=

1.2.3 PCR檢測 稱取糞便樣品中心無污染處0.5 g，按糞便DNA提取試劑盒(D5625-01，OmegaBio-Tek,Inc.,Norcross,USA)說明書提取DNA。采用巢式PCR擴(kuò)增毛首線蟲核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔I(rDNA ITS1)基因片段。第1輪擴(kuò)增體系25 μL：2×Taq酶混合溶液(B639295，Life Biotech，India Delhi)12.5 μL，正反向引物(表2)各1 μL，ddH2O 9.5 μL，模版DNA 1 μL；擴(kuò)增第1輪反應(yīng)程序：Stage 1：95 ℃ 10 min；Stage 2：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s(35個(gè)循環(huán))，最后72 ℃延伸10 min。第2輪擴(kuò)增體系25 μL：2×Taq酶混合溶液12.5 μL，正反向引物(表2)各1 μL，ddH2O 9.5 μL，模版DNA 1 μL，模板DNA為第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物；第2輪擴(kuò)增反應(yīng)程序：Stage 1：95 ℃ 10 min；Stage 2：95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s(35個(gè)循環(huán))，最后72 ℃延伸10 min。2輪擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為1 088 bp和895 bp[13]。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物，4S Green核酸凝膠染液染色，凝膠成像儀中觀察。電泳檢測陽性且與目標(biāo)條帶大小一致者，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。所有樣品均重復(fù)檢測3次。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST模塊進(jìn)行序列比對，確定毛首線蟲所屬類群，選取GenBank中川金絲猴毛首線蟲(MN447324.1Trichurissp.-Rhinopithecusroxellana)、黑葉猴毛首線蟲(MN447321.1Trichurissp.-Trachypithecusfrancoisi)、人毛首線蟲(KJ588071.1Trichurissp.-Homosapiens、GQ352553.1Trichuristrichiura-Homosapiens、GQ301555.1Trichuristrichiura-Homosapi-ens、JN181860.1Trichuristrichiura-Homosapiens)、食蟹猴毛首線蟲(MK192054.1Trichuristrichiura-Macacafascicularis)、黑白疣猴毛首線蟲(KJ588077.1Trichuristrichiura-black-and-white colobus)、長臂猿毛首線蟲(GM991955.1Trichuriscolobae-Nomascusgabriellae)、葉猴毛首線蟲(KT186232.1Trichurissp. -leaf-monkeys)、日本獼猴毛首線蟲(KP336476.1Trichuristrichiura-Macacafuscata)已有序列和本試驗(yàn)測得的序列，共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。選擇Trichurissp.-Sundamysmuelleri(MN428391.1)序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外群。在Jukes-Cantor方法中使用鄰近連接算法在MEGA 6.0中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，使用1 000次 重復(fù)的Bootstrap進(jìn)行分支可靠性分析[14]。

表2 擴(kuò)增毛首線蟲內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)引物名稱及序列信息Table 2 Primers and sequence information of Trichurus ITS

2 結(jié)果

2.1 圈養(yǎng)金絲猴毛首線蟲形態(tài)學(xué)鑒定 采用飽和鹽水漂浮法和離心沉淀法富集3種金絲猴糞便中的寄生蟲蟲卵，光學(xué)顯微鏡下觀察，3種金絲猴糞便內(nèi)蟲卵均呈棕黃色，外形為腰鼓狀，卵殼厚，兩端有卵塞，依據(jù)形態(tài)判定為毛首線蟲蟲卵(中插彩版圖1)。

圖1 毛首線蟲蟲卵(400×)Fig.1 Eggs of Trichuris sp.(400×)

2.2 圈養(yǎng)金絲猴毛首線蟲分子生物學(xué)鑒定 提取金絲猴糞便基因組，使用巢式PCR 法擴(kuò)增毛首線蟲ITS1基因片段，使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，目的條帶測序，測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析，結(jié)果表明，北京動(dòng)物園川(序列編碼：12、29)、滇(序列編碼：6、23、25、33、42)、黔(序列編碼：35)3種金絲猴糞便中檢測到的毛首線蟲與秦嶺川金絲猴毛首線蟲聚為同一分支，屬于毛首線蟲屬(圖2)。

圖2 圈養(yǎng)金絲猴毛首線蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Trichuris sp. of captive golden monkeys▲: 試驗(yàn)動(dòng)物名稱，其中序列編碼12、29為川金絲猴，序列編碼6、23、25、33、42為滇金絲猴,序列編碼35為黔金絲猴▲: Name of the experiment animals. Among them,12,29 is the sequence code of R. roxellana, 6,23,25,33,42 is R. bieti,and 35 is R. brelichi

2.3 圈養(yǎng)金絲猴體內(nèi)毛首線蟲驅(qū)蟲效果觀察 統(tǒng)計(jì)檢測期內(nèi)11只受試動(dòng)物的轉(zhuǎn)陰率及平均蟲卵數(shù)，結(jié)果顯示，給藥后第6天平均蟲卵數(shù)降到最低水平，轉(zhuǎn)陰率達(dá)到64%，其后24 d內(nèi)，轉(zhuǎn)陰率及平均蟲卵數(shù)雖有上下波動(dòng)，但均未到達(dá)驅(qū)蟲前水平(表3)，可見，阿苯達(dá)唑?qū)鸾z猴毛首線蟲有明顯的驅(qū)蟲效果。

表3 阿苯達(dá)唑?qū)θ︷B(yǎng)金絲猴體內(nèi)毛首線蟲轉(zhuǎn)陰率及平均蟲卵數(shù)的影響Table 3 Effects of albendazole on negative conversion rate and average egg number of Trichuris sp. of captive golden monkeys

進(jìn)一步對比阿苯達(dá)唑?qū)?種金絲猴驅(qū)蟲效果，川金絲猴和黔金絲猴的驅(qū)蟲效果較好，除川金絲猴在驅(qū)蟲后第10天EPG波動(dòng)較大外，這2種金絲猴在檢測期糞便內(nèi)蟲卵始終維持在較低水平(圖3A和3B)；滇金絲猴樣品雖在給藥后第3天和第6天EPG迅速降低，但在給藥后第10～30天，EPG高水平范圍波動(dòng)，雖有驅(qū)蟲效果，但不如前2種金絲猴理想(圖3C)。

圖3 驅(qū)蟲前、后金絲猴EPG隨時(shí)間的變化Fig.3 Changes of EPG of golden monkeys before and after administrationA： 川金絲猴； B： 黔金絲猴； C： 滇金絲猴A: R. roxellana; B: R. brelichi; C: R. bieti

進(jìn)一步分析11只受試金絲猴體內(nèi)毛首線蟲消長規(guī)律，結(jié)果顯示：投藥前后3只川金絲猴和4只黔金絲猴體內(nèi)毛首線蟲EPG雖然在投藥后存在反彈和波動(dòng)，但阿苯達(dá)唑?qū)@2種共7只金絲猴的驅(qū)蟲效果均較為理想；分析4只滇金絲猴體內(nèi)毛首線蟲消長規(guī)律，發(fā)現(xiàn)R.bieti-1和R.bieti-2體內(nèi)毛首線蟲消長規(guī)律與川、黔2種金絲猴體內(nèi)毛首線蟲EPG變化規(guī)律相似，而R.bieti-3和R.bieti-4體內(nèi)毛首線蟲雖在投藥后第6天迅速下降，但隨著時(shí)間推移，其EPG迅速上升，在給藥后15～20 d，達(dá)到甚至高于2只動(dòng)物在投藥前毛首線蟲本底水平，之后二者EPG雖有下降，至投藥后第30天，EPG仍維持在3 950 和6 200(中插彩版圖4)。

圖4 投藥前、后11只受試金絲猴體內(nèi)毛首線蟲消長曲線Fig.4 The perishing and growing curve of Trichuris sp. of 11 golden monkeys before and after administration

3 討論

圈養(yǎng)川金絲猴感染毛首線蟲的概率極高，且存在重復(fù)感染的現(xiàn)象[8]。根據(jù)北京動(dòng)物園寄生蟲普查結(jié)果，圈養(yǎng)川、黔、滇3種金絲猴糞便樣品中存在大量毛首線蟲蟲卵，雖然每年定期進(jìn)行驅(qū)蟲，普查仍然存在大量蟲卵。雖然目前尚未有直接因感染毛首線蟲致死的報(bào)道[15]，一旦發(fā)生混合感染，金絲猴也會發(fā)生死亡，如安徽省某動(dòng)物園曾發(fā)生1例川金絲猴金黃色葡萄球菌與毛首線蟲混合感染致死的病例[8]，臨床上毛首線蟲仍然是危害圈養(yǎng)川金絲猴種群健康的重要病原[16]。目前對圈養(yǎng)川金絲猴毛首線蟲的研究報(bào)道相對較多，但由于圈養(yǎng)金絲猴種群數(shù)量相對較少，尤其川、黔、滇3種金絲猴都有飼養(yǎng)的單位全國僅有北京動(dòng)物園，對比分析這3種金絲猴毛首線蟲感染及治療的報(bào)道甚少。因此，本試驗(yàn)可為臨床用藥和飼養(yǎng)管理提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

形態(tài)學(xué)鑒定是毛首線蟲屬重要的定種方法[17-18]，但在形態(tài)相似近緣種鑒定時(shí)，常出現(xiàn)混淆甚至錯(cuò)誤，造成寄生蟲同種異名和異種同名現(xiàn)象；形態(tài)學(xué)鑒定方法結(jié)合rDNA ITS序列分析可為毛首線蟲屬物種分類體系提供依據(jù)[19]。本試驗(yàn)結(jié)合形態(tài)學(xué)及毛首線蟲ITS1序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，北京動(dòng)物園圈養(yǎng)川、黔、滇3種金絲猴感染的毛首線蟲與秦嶺川金絲猴毛首線蟲聚為同一分支，屬毛首線蟲屬。據(jù)Xie等報(bào)道，通過比對分析毛首線蟲屬ITS和cox1基因序列，發(fā)現(xiàn)白頰長臂猿、阿拉伯狒狒、長尾猴、東非狒狒、北方豚尾猴和人毛首線蟲聚類為一個(gè)亞群，川金絲猴和滇金絲猴獨(dú)立于上述靈長類，形成一個(gè)新亞群，提示金絲猴可能存在著不同的毛首線蟲物種[20]。

根據(jù)北京動(dòng)物園獸醫(yī)工作者臨床經(jīng)驗(yàn)，3種金絲猴存在毛首線蟲反復(fù)感染的現(xiàn)象。本試驗(yàn)給3種金絲猴投喂經(jīng)典毛首線蟲驅(qū)殺藥物阿苯達(dá)唑，結(jié)果顯示，阿苯達(dá)唑?qū)鸾z猴毛首線蟲具有良好的驅(qū)蟲效果，尤其是對川金絲猴和黔金絲猴的驅(qū)蟲效果理想，除川金絲猴在驅(qū)蟲后第10天EPG波動(dòng)較大外，這2種金絲猴在檢測期糞便內(nèi)蟲卵始終維持在較低水平?？梢?，臨床上阿苯達(dá)唑可有效驅(qū)除3種金絲猴體內(nèi)毛首線蟲蟲卵。然而，毛首線蟲的發(fā)育不需要中間宿主，在普通環(huán)境中3周左右就可以發(fā)育成為侵襲性幼蟲，高溫高濕環(huán)境下發(fā)育速度更快[21]。加之，金絲猴時(shí)而地面取食，環(huán)境中的蟲卵若未能及時(shí)清除，很容易在驅(qū)蟲后28 d左右就發(fā)生重復(fù)感染，驅(qū)蟲后采用火焰消毒可控制環(huán)境中的蟲卵[4]。為提高動(dòng)物福利、優(yōu)化游客觀覽體驗(yàn)，北京動(dòng)物園飼養(yǎng)和園藝工作者在金絲猴館舍內(nèi)種植大量綠植，圈舍內(nèi)不宜進(jìn)行火焰消毒。本試驗(yàn)雖未在驅(qū)蟲后30 d的檢測期出現(xiàn)所有個(gè)體重復(fù)感染事件，但部分個(gè)體蟲卵數(shù)存在波動(dòng)，這種驅(qū)蟲效果波動(dòng)可能與環(huán)境中蟲卵存在密切相關(guān)，可見使用阿苯達(dá)唑驅(qū)蟲后1個(gè)月可以維持動(dòng)物體內(nèi)蟲體寄生量在一個(gè)較低水平。王榮瓊等建議金絲猴群每月投服1次驅(qū)蟲藥[6]，而顧永熙等建議金絲猴毛首線蟲的驅(qū)蟲時(shí)間間隔應(yīng)為2.5個(gè)月[1]，未來開展北京動(dòng)物園毛首線蟲消長規(guī)律，優(yōu)化藥物驅(qū)蟲程序，開展長效驅(qū)蟲研究勢在必行。

對于滇金絲猴，雖在給藥后第3天和第6天EPG迅速降低，但在給藥后第10～30天，EPG波動(dòng)較大，雖有驅(qū)蟲效果，但不如川、黔2種金絲猴理想。進(jìn)一步分析阿苯達(dá)唑?qū)Φ峤鸾z猴毛首線蟲驅(qū)殺效果的差異，可能受試的4只滇金絲猴年齡跨度大，尤其是R.bieti-3和R.bieti-4分別為19歲和21歲，投喂阿苯達(dá)唑后，由于藥物作用在短時(shí)間內(nèi)驅(qū)殺毛首線蟲，高齡動(dòng)物由于年齡增長而致全身器官功能減退和組織細(xì)胞退行性改變等生理病理的變化[22]，機(jī)體抵抗力相對較弱，局部藥物濃度下降后，寄生蟲會逐漸繁殖，重新定植所致。針對高齡動(dòng)物需要更換其他驅(qū)蟲藥物，或者在驅(qū)蟲的同時(shí)，給予適當(dāng)補(bǔ)充免疫營養(yǎng)素，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，可以間接提高驅(qū)蟲藥的驅(qū)蟲效果，還可以緩解寄生蟲引起的機(jī)體應(yīng)激，修復(fù)寄生蟲分泌引起的機(jī)體損傷[23]。因此，高齡金絲猴驅(qū)蟲方案及效果有待進(jìn)一步研究。