廣州市雞肉中科瓦利斯沙門菌的耐藥性及分子分型研究

劉海霞 ， 鄔雨倩 ， 詹澤強 ， 黃雪歡 ， 瞿孝云 ， 馬葉本 ， 葉存棟 ， 廖 明 ， 張建民

(1.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱帶農(nóng)林學(xué)院 ， 廣東 廣州 511365 ； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人畜共患病重點實驗室 廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室 ， 廣東 廣州 510642)

沙門菌(Salmonella)是一種寄生在腸道的革蘭陰性菌，在國內(nèi)是引起細菌性食源性疾病的主要病原菌。據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)數(shù)據(jù)顯示，沙門菌每年造成美國大約120萬人感染患病，超過400人死亡[1]。在我國每年大概有3億人因沙門菌感染而患病，占我國病原菌型食源性疾病總數(shù)的70%～80%[2]。腸炎和鼠傷寒沙門菌是造成人源感染和食品污染的沙門菌中的優(yōu)勢血清型[3]?？仆呃股抽T菌(Salmonellacorvallis)在過去比較少見，但近幾年逐漸成為優(yōu)勢血清型之一。2016年，廖興廣等[4]發(fā)現(xiàn)科瓦利斯血清型在河南省市售生禽肉中成為優(yōu)勢菌型。2018年，Zhang等[5]對廣東省農(nóng)貿(mào)市場畜禽肉中的沙門菌分離鑒定的檢測數(shù)據(jù)表明，雞肉中共鑒定出27種血清型，其中科瓦利斯血清型排名第二。門診腹瀉病例監(jiān)測中，科瓦利斯沙門菌感染比例逐年上升[6]。禽類在養(yǎng)殖過程中，由于自身特點極易受到沙門菌的感染，所以禽類成為沙門菌食源性疾病的重要傳染源[7]。廣州市作為雞肉的消費和生產(chǎn)大市，雞肉產(chǎn)品的供應(yīng)和安全性直接關(guān)系到人民群眾的健康和社會穩(wěn)定。但目前，有關(guān)雞肉中科瓦利斯沙門菌的相關(guān)報道較少，缺乏相關(guān)的數(shù)據(jù)和信息。

因此，本試驗通過藥敏試驗、耐藥基因攜帶情況及脈沖場凝膠電泳(Pulsed field gel electrophoresis, PFGE)分子分型等試驗方法，探究廣州市農(nóng)貿(mào)市場所售的雞肉中科瓦利斯沙門菌的分子流行病學(xué)特征，為雞肉中科瓦利斯沙門菌的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 21株科瓦利斯沙門菌分離于2016年5—7月廣州市農(nóng)貿(mào)市場的現(xiàn)屠宰生鮮雞檔口樣品。大腸埃希菌質(zhì)控菌株ATCC25922和標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 藥敏紙片，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液、緩沖蛋白胨水(BPW)和氯化鎂-孔雀綠(RVS)增菌液，均購自美國Becton公司；MH瓊脂、LB瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；沙門菌屬診斷血清，購自S&A公司；PFGE專用瓊脂糖(SeaKem gold agarose)，購自美國Bio-Rad公司；細胞裂解緩沖液(Cell lysis buffer,CLB)、細胞懸浮緩沖液(Cell suspension buffer, CSB)、0.5×TBE電泳緩沖液、TE緩沖液、蛋白酶K緩沖液、Gelred染色液、蛋白酶K、限制性內(nèi)切酶XbaI、DNA marker DL1 000、rTaqDNA聚合酶(PremixTaq)，均購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂稀釋法測定科瓦利斯沙門菌的藥物敏感性 采用瓊脂稀釋法對21株科瓦利斯沙門菌進行14種臨床常用抗菌藥的藥物敏感性試驗，藥敏測定過程中的質(zhì)控菌株選擇由實驗室保存的大腸埃希菌ATCC25922，測定最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)值，根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[8]對結(jié)果進行判讀。

1.2.2 多重耐藥科瓦利斯沙門菌耐藥基因的PCR檢測 制備DNA模板，對DNA模板進行擴增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性7 min，94 ℃變性60 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s。擴增后產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，將 PCR結(jié)果送往廣州艾基生物技術(shù)有限公司進行序列測定。測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對，確定突變點和突變種類。具體信息參照表1、表2，引物合成參照文獻[9]。

表1 喹諾酮類耐藥決定區(qū)(QRDR)基因的PCR擴增序列Table 1 PCR amplification sequences of quinolone resistantce determination zone (QRDR) genes

表2 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥(PMQR)基因的PCR檢測序列Table 2 PCR detection sequences of plasmid mediated quinolone resistant (PMQR) genes

1.2.3 PFGE分子分型 PFGE標(biāo)準(zhǔn)化分型方法參照文獻[9]進行,沙門菌地方菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812(Marker)的分型檢測步驟包括“制樣、包埋、裂解、洗滌、酶切、加樣、電泳、染色、讀膠”。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗 根據(jù)藥敏試驗的判定結(jié)果可知：21株 科瓦利斯沙門菌對磺胺異噁唑(95.2%)耐藥率最高，其次為萘啶酸(90.5%),然后依次為四環(huán)素(66.7%)、氟苯尼考(61.9%)、氯霉素(52.4%)、鏈霉素(28.6%)、環(huán)丙沙星(19.0%)、氨芐西林(9.5%)，對頭孢噻肟、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星、多黏菌素B完全敏感，對亞胺培南的敏感性為90.5%，見表3。

表3 21株科瓦利斯沙門菌藥敏試驗結(jié)果Table 3 Results of drug susceptibility test of 21 Salmonella corvallis (%)

2.2 科瓦利斯沙門菌的多重耐藥情況 基于21株科瓦利斯沙門菌的藥敏結(jié)果得出多重耐藥情況，通過計算得到21株科瓦利斯沙門菌中多重耐藥菌檢出率為81%(耐3類及其以上的抗菌藥)，6株(28.6%)可抗1～3種抗菌藥，15株(71.4%)可抗4～7種抗菌藥。耐藥種數(shù)最多有7種，耐藥譜為SUL+NA+FFC+C+TE+STR最多(28.6%)，其次是SUL+NA+FFC+C(14.3%)、SUL+NA+FFC+TE (9.5%)、SUL+NA+CIP+TE(9.5%)、AMP+SUL+NA+CIP+FFC+C+TE(4.8%)，見表4。

表4 21株科瓦利斯沙門菌多重耐藥情況Table 4 Multidrug resistance of 21 strains of Salmonella corvallis

2.3 喹諾酮類耐藥決定區(qū)(QRDR)與質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥(PMQR)基因的測定 21株科瓦利斯沙門菌都存在parC突變，第57位氨基酸蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸(Thr57→Ser)，并且在質(zhì)粒中檢出了qnrS、aac(6′)-Ib-cr和qnrB，檢出率分別為90.5%、23.8%和9.5%，見表6。分析存在QRDRparC單突變同時攜帶PMQR對環(huán)丙沙星和萘啶酸耐藥性影響，結(jié)果顯示，所有parC氨基酸突變菌株中，不攜帶PMQR和攜帶2個PMQR的菌株對CIP不存在耐藥性，攜帶1個 和3個PMQR的CIP耐藥菌株分別占75%和25%。不攜帶PMQR的菌株對NAL不存在耐藥性，攜帶PMQR的菌株對NAL都耐藥。見表5。

表5 21株科瓦利斯沙門菌耐藥情況與基因檢測情況Table 5 Drug resistance and gene testing of 21 strains of Salmonella corvallis

2.4 多重耐藥科瓦利斯沙門菌PFGE分型 21株科瓦利斯沙門菌經(jīng)PFGE分型后,結(jié)果顯示其可分為7個血清型，5個基因簇分別是C簇、D簇、E簇、F簇和G簇，分別包含菌株數(shù)為2株、11株、2株、2株 和2株。C簇2株菌含有1個基因型，D簇11株菌含有6個基因型，E簇2株菌含有2個基因型，F(xiàn)簇 2株菌含有2個基因型，G簇2株菌含有2個基因型。2個單一的基因型分別是A型和B型，僅包含了1株菌(圖1)。在基因簇中優(yōu)勢基因簇是D簇。 試驗結(jié)果顯示，編號為25、257和37這3個菌株分別來自廣州市白云區(qū)、越秀區(qū)和海珠區(qū)3個不同區(qū)域，但同源性100%。

圖1 科瓦利斯沙門菌PFGE分型結(jié)果Fig.1 The result of Salmonella corvallis PFGE typing

3 討論

沙門菌廣泛存在于動物體本身、動物養(yǎng)殖環(huán)境和動物性食品中，在國內(nèi)是引起細菌性食源性疾病的主要病原菌。我國70%～80%的細菌性食物中毒是由沙門菌引起的[10]。科瓦利斯這個血清型在過去比較少見，在國外，Dickinson最早于1949年從感染腸炎的家禽的盲腸內(nèi)容物中分離出科瓦利斯沙門菌[11]；在國內(nèi)，2012年劉杰等[12]首次在肉雞養(yǎng)殖和屠宰加工環(huán)節(jié)分離到該型菌株。但是近幾年科瓦利斯逐漸成為優(yōu)勢血清型[4]，因此需要加強對流行菌株的監(jiān)測。通過對21株科瓦利斯沙門菌進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)其對磺胺類、四環(huán)素類、氯霉素類藥物耐藥嚴(yán)重，這與國內(nèi)外有關(guān)報道基本一致[13-14]，由此推測可能在長期的畜禽養(yǎng)殖中，這些傳統(tǒng)抗菌藥物長期以來被廣泛應(yīng)用和不規(guī)范的用藥方法有密切關(guān)系。喹諾酮類作為目前臨床上治療沙門菌感染的一線藥物[15]，具有較好的治療效果，可本試驗結(jié)果顯示，分離株中已出現(xiàn)對喹諾酮類藥物的耐藥菌株，對環(huán)丙沙星、萘啶酸的耐藥率分別為19%和90.5%。但分離株對頭孢類、多黏菌素B和亞胺培南都不耐藥，與以往的研究報告結(jié)果相一致[16]。本次試驗的菌株多重耐藥菌檢出率達81%，耐藥譜型繁多，多重耐藥株的主要耐藥表型為SUL+NA+FFC+C+TE+STR。結(jié)果表明，廣州地區(qū)肉雞沙門菌耐藥情況比較嚴(yán)重，提示在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中要科學(xué)合理地使用抗菌藥物。

沙門菌對喹諾酮類藥物的耐藥性主要與其細胞中喹諾酮類耐藥決定區(qū)(QRDR)的parC和gyrA基因突變和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥(PMQR)基因有關(guān)[9]。本試驗中，通過對QRDR基因的檢測，所有的菌株在parC基因上都發(fā)生了第57位氨基酸蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸(Thr57→Ser)，QRDR突變結(jié)果與菌株對萘啶酸的耐藥率均為90.5%，結(jié)果具有一致性。有研究表明，基因parC的QRDR中的點突變可以減少對喹諾酮類的易感性[17-18]。PMQR被認(rèn)為可通過外排泵等機制介導(dǎo)細菌對喹諾酮類藥物的耐藥[19]，試驗中攜帶PMQR基因[qnrS、aac(6′)-Ib-cr、qnrB]的菌株對NAL都耐藥。以上結(jié)果表明，QRDRparC單突變菌株攜帶PMQR基因與沙門菌對萘啶酸耐藥之間存在一定的聯(lián)系，PMQR基因可增強菌株對喹諾酮類藥物的耐藥性。

目前PFGE是國內(nèi)外常用的分子分型及溯源技術(shù)，本試驗的21株科瓦利斯沙門菌PFGE分子分型分為7個血清型，呈現(xiàn)遺傳多樣性。超過一半的菌株分布在D簇，說明D簇是1個優(yōu)勢基因簇，D簇菌株25、257、37來源于同一采樣市不同采樣點，但帶型相似度卻達到了100%，提示肉雞間可能存在共同來源或者交叉污染，若存在共同來源，本次試驗的樣本可能來源于同一養(yǎng)殖場；若存在交叉污染，則需要加強衛(wèi)生管理和污染監(jiān)測，降低食源致病菌污染，減少食源性致病菌的發(fā)生。

本試驗結(jié)果表明，廣州市各大農(nóng)貿(mào)市場肉雞中科瓦利斯沙門菌高耐藥性，多重耐藥嚴(yán)重，喹諾酮耐藥決定區(qū)基因(QRDR)普遍存在parC突變，PFGE 分子型別呈多態(tài)性,有同源菌株的存在,提示存在共同來源或者交叉污染，提示為降低沙門菌引起的食品安全風(fēng)險，應(yīng)加強市場衛(wèi)生管理以及重視養(yǎng)殖場沙門菌的凈化工作。