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    無菌接產(chǎn)培育 SPF 級比格犬

    2021-09-01 01:41:48王可洲李方正王冬冬郭中坤楊宗統(tǒng)齊昊南原昆鵬齊佳欣胡靜雷時(shí)啟琳王建琳尹燕博
    中國獸醫(yī)雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:隔離器比格母犬

    王 旭 , 王可洲 , 胡 軍 , 李方正 , 王冬冬 , 郭中坤 , 雷 戰(zhàn) , 楊宗統(tǒng) , 齊昊南 , 原昆鵬 , 齊佳欣 , 胡靜雷 , 時(shí)啟琳 , 尹 月 , 王建琳 , 尹燕博

    (1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 , 山東 青島 266109 ; 2. 山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 , 山東 濟(jì)南 250002 ; 3. 上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 , 上海 楊浦 201699 ; 4. 青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司 , 山東 青島 266200 ; 5. 山東省中醫(yī)藥研究院 , 山東 濟(jì)南 250031 ; 6.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 , 吉林 延吉 133000)

    無特定病原(Specific pathogen free,SPF)犬是指除普通級實(shí)驗(yàn)犬應(yīng)排除的病原外,還不攜帶主要潛在感染或條件致病和對科學(xué)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原的實(shí)驗(yàn)犬,是生物醫(yī)學(xué)特別是獸醫(yī)學(xué)研究的重要基礎(chǔ)支撐。1946年,Glimstedt 首次培育成無菌犬,隨后 Reece 等在 1968年培育并建立了SPF犬種群[1]。1992年,上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部利用剖腹產(chǎn)技術(shù)培育出6只 SPF 級比格犬[2],此后未見相關(guān)報(bào)道。到目前為止,我國尚無SPF犬核心種群,未能實(shí)現(xiàn) SPF 級實(shí)驗(yàn)用比格犬的持續(xù)、批量生產(chǎn)。本研究參照培育 SPF 豬所用的無菌接產(chǎn)技術(shù),獲得仔犬轉(zhuǎn)移至無菌隔離器繼續(xù)飼養(yǎng),成功培育出3批共128 只 SPF 級比格犬。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級種母比格犬24只,年齡2~6歲, 來源于青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(魯)20170006]。實(shí)驗(yàn)犬飼養(yǎng)在青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司 SPF 動(dòng)物房內(nèi)[SYXK(魯)20180026],溫度:23~25 ℃,濕度:50%~65%,12 h 光照 12 h 黑暗。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利要求,并給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷。

    1.2 試劑、物品與儀器 犬細(xì)小病毒抗體(CPV-Ab)、犬瘟熱病毒抗體(CDV-Ab)、犬腺病毒抗體(CAV-Ab)、犬冠狀病毒抗體(CCV-Ab)、犬副流感病毒抗體(CPIV-Ab)、犬皰疹病毒抗體(CHV-Ab)ELISA 檢測試劑盒,均購自美國 XpressBio 公司;狂犬病毒抗體(RV-Ab)、弓形蟲抗體(TOX-Ab)ELISA 檢測試劑盒,均購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司;鉤端螺旋體抗體(LEP-Ab)ELISA 抗體檢測試劑盒,購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;布魯氏菌試管凝集抗原,購自中國疾病預(yù)防控制中心。HT-1505A 型正壓隔離器為深圳市泓騰生物科技有限公司產(chǎn)品;LDZM-80L-Ⅲ型高壓蒸汽滅菌器為上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。復(fù)合微生物 B 粉、維生素 C 粉為濟(jì)南新星飼料有限公司產(chǎn)品;全價(jià)配方奶粉為美國PetAg 公司產(chǎn)品。

    1.3 種犬選擇、病原微生物檢測及孕期管理 種犬的選擇標(biāo)準(zhǔn):備選種犬遺傳背景清楚,母犬年齡2~6歲,公犬年齡2~7歲,中小體型,無難產(chǎn)史。歷史平均窩產(chǎn)仔數(shù)不少于 6 只,且健康成活。通過檢測,不攜帶《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 微生物學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.2—2011)和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.1—2001)中規(guī)定的病原[3-4],臨床健康且品相較好。

    種犬采用碩騰公司生產(chǎn)的衛(wèi)佳捌?疫苗進(jìn)行免疫,通過自然交配進(jìn)行配種,種母犬轉(zhuǎn)入屏障環(huán)境之前檢測病原。檢測合格的種母犬懷孕后,轉(zhuǎn)到經(jīng)過徹底消毒的欄舍單獨(dú)飼養(yǎng),并保持嚴(yán)格消毒。預(yù)產(chǎn)期前5天,轉(zhuǎn)移至屏障環(huán)境中適應(yīng)環(huán)境。

    1.4 隔離器、屏障環(huán)境及用具消毒 由青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司與深圳市泓騰生物科技有限公司聯(lián)合研制的新型 SPF 犬專用飼養(yǎng)隔離器,為雙箱體構(gòu)造,每個(gè)箱體可飼養(yǎng) 4~8 只幼犬,且箱體之間互不連通。隔離器上、下連接部分采用水封的方式密閉,內(nèi)置網(wǎng)床、料盆,四周帶有長臂軟質(zhì)膠手套。使用前先清潔各組件,按照正確的順序組裝隔離器。采用甲醛高錳酸鉀熏蒸方式對隔離器及屏障環(huán)境進(jìn)行消毒,消毒之前先對隔離器的密閉性進(jìn)行檢查[5]。將所需物品全部放入屏障環(huán)境后,每立方米用甲醛42 mL、高錳酸鉀21 g混勻熏蒸24 h后通風(fēng)3 d備用[6]。保溫轉(zhuǎn)運(yùn)箱用1%過氧乙酸溶液噴霧消毒60 min,奶瓶、料盆、手套、洗耳球、手術(shù)剪等用2%過氧乙酸浸泡消毒30 min后通風(fēng)24 h備用[7]。所需墊布和衣物等經(jīng)121 ℃、110 kPa高壓滅菌20 min后烘干備用。

    1.5 無菌接產(chǎn) 母犬轉(zhuǎn)入屏障環(huán)境之前,用0.2%新潔爾滅對其進(jìn)行全身清洗消毒。母犬轉(zhuǎn)移到屏障環(huán)境后每天用1%聚維酮碘帶犬消毒欄舍1次。母犬有分娩預(yù)兆前再次對母犬進(jìn)行消毒,尤其注意會(huì)陰部及后軀、口腔消毒。用開殖器打開母犬陰道,再用麥?zhǔn)香Q夾住經(jīng)0.1%新潔爾滅浸泡過的海棉反復(fù)幾次消毒陰道。用硫酸卡那霉素噴鼻,每側(cè)鼻孔3 mL[8]。接產(chǎn)人員事先用消毒液浸泡雙手,待母犬分娩時(shí)迅速將仔犬放置在消毒好的墊巾上,用洗耳球吸出仔犬口腔及鼻腔內(nèi)液體并結(jié)扎、消毒臍帶,隨后將仔犬浸泡在 0.1%新潔爾滅溶液中浸泡消毒。仔犬消毒體表后用滅菌墊布擦干,涂布接生粉后即放入保溫轉(zhuǎn)運(yùn)箱中并盡快通過氣閘轉(zhuǎn)移到無菌隔離器中[9-11],每個(gè)隔離器飼養(yǎng) 4~8 只,不同母犬所生仔犬不能混合放置。

    1.6 仔犬的飼養(yǎng)管理 隔離器內(nèi)溫度第1周為34~35 ℃, 以后每周降低 2 ℃,到 24~26 ℃為止[12]。隔離器內(nèi)壓力維持在 100~120 Pa,濕度在 40%~70%,換氣次數(shù)為30次/h。采用全人工哺乳的方式喂養(yǎng)仔犬,奶粉濃度按照說明書調(diào)配。仔犬自出生6 h后開始哺乳,哺乳量根據(jù)仔犬的食欲及腹圍確定,不能喂至全飽。仔犬不同日齡每日哺乳次數(shù)及哺乳量見表1。哺乳期內(nèi)每次哺乳后用滅菌棉球擦拭犬的肛門及外陰,促使其排便、排尿,并且每日稱重,測量體長。仔犬 30 日齡開始飼喂高壓滅菌的全價(jià)顆粒犬糧,飼喂時(shí)將犬糧搗碎并配合適量復(fù)合維生素 B 及維生素 C。仔犬 35 日齡開始斷奶,之后每日飼喂 4 次,同時(shí)給予煮沸滅菌的溫水。仔犬飼喂過程嚴(yán)格按照程序操作,飼喂結(jié)束后對傳遞倉、奶瓶等物品進(jìn)行消毒,切斷病原傳播途徑,確保仔犬健康成活。

    表1 SPF 仔犬不同日齡哺乳次數(shù)及每次哺乳量Table 1 Breastfeeding frequency and breastfeeding volume of SPF puppies at different ages

    1.7 病原檢測種類及方法 除《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 微生物學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.2—2011)和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.1—2001)中規(guī)定的 SPF 犬需凈化的15種病原之外[3-4],對規(guī)?;B(yǎng)殖犬廠危害較大的犬冠狀病毒、犬皰疹病毒、犬副流感病毒、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌、肺炎鏈球菌、支氣管敗血波氏桿菌進(jìn)行檢測。

    采集24只所選種母犬的毛發(fā)、糞便拭子及口鼻拭子,無菌采集種母犬血清。于仔犬 2月齡時(shí)采集毛發(fā)、糞便拭子及口鼻拭子,無菌采集仔犬血清[2]。將待檢樣本送至山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 微生物學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.2—2011)和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.1—2001)中規(guī)定的檢測方法進(jìn)行檢測[3-4],對于國標(biāo)規(guī)定之外的病原自行檢測。病原檢測方法見表2。病毒檢測引物見表3。

    表2 SPF 仔犬和種母犬病原及抗體檢測方法Table 2 Pathogens and antibody detection methods of SPF puppies and breeding dogs

    表3 病毒檢測引物Table 3 Primers for virus detection

    2 結(jié)果

    2.1 種母犬及SPF犬病原檢測 對符合標(biāo)準(zhǔn)的24只 種母犬進(jìn)行無菌接產(chǎn),共獲得仔犬 141 只,1月齡仔犬成活個(gè)數(shù)為 128 只,成活率為 90.78%。種母犬及仔犬病原檢測結(jié)果均為陰性,見表4。

    表4 種母犬及 SPF 仔犬抗原檢測結(jié)果Table 4 Pathogen test results of breeding female dogs and SPF puppies

    2.2 隔離器飼養(yǎng)與普通飼養(yǎng)比格犬生長指標(biāo)對比分析 分別測量 20 只普通環(huán)境飼養(yǎng)的與128只無菌接產(chǎn)隔離器飼養(yǎng)的比格犬 0、10、20、30、40、50、60日齡 生長發(fā)育各項(xiàng)指標(biāo),結(jié)果如表5所示。

    表5 隔離器飼養(yǎng)與普通飼養(yǎng)的比格犬生長指標(biāo)對比Table 5 Comparison of growth indicators of beagle dogs fed in isolators and in ordinary environment

    3 討論

    早在 20 世紀(jì) 60年代,人們就普遍認(rèn)識(shí)到 SPF 動(dòng)物對于生物醫(yī)學(xué)研究的重要性[20],美國、日本、荷蘭等國家先后培育出 SPF 犬核心種群[21-23]。我國 SPF 犬培育工作起步較晚,直到 1992年才開始探索[2]。目前國際上獲得初代 SPF 犬的方法,僅見剖腹取胎法。而初代SPF 豬的獲取方法,則有自然分娩、早期隔離式斷奶技術(shù)(SEW)、子宮切開、子宮切除、胚胎移植、無菌接產(chǎn)等[11,24]。自然分娩和早期隔離式斷奶方式操作簡單,對母犬損傷小,但是不能完全切斷來自母犬的污染。子宮切開、子宮切除可以較好地控制來自環(huán)境和母犬的污染,但是對母犬損傷太大,不符合動(dòng)物福利要求,且切除子宮的母犬不能再利用,成本較高。無菌接產(chǎn)法操作相對簡單,對母犬損傷小,且母犬可以重復(fù)利用,更加符合動(dòng)物福利要求。無菌接產(chǎn)操作過程需注意以下兩點(diǎn):一是母犬分娩的時(shí)間不易準(zhǔn)確判斷,一旦接產(chǎn)人員錯(cuò)過接產(chǎn)時(shí)間,母犬所產(chǎn)仔犬則不能利用;二是母犬產(chǎn)程較長,對母犬和屏障環(huán)境的消毒及接產(chǎn)人員素質(zhì)要求較高。一旦消毒不徹底,容易造成來自環(huán)境和母犬的污染。本研究最終選擇無菌接產(chǎn)方式獲得 SPF 仔犬。研究結(jié)果表明,無菌接產(chǎn)隔離飼養(yǎng)的比格犬可以排除國標(biāo)規(guī)定的15種病原,以及犬冠狀病毒、犬皰疹病毒、犬副流感病毒、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌、肺炎鏈球菌、支氣管敗血波氏桿菌等本研究項(xiàng)目規(guī)定的病原。

    SPF級動(dòng)物生產(chǎn)過程中,質(zhì)量控制最為關(guān)鍵。本研究采用新型研制的 SPF 犬專用飼養(yǎng)隔離器,隔離器內(nèi)各項(xiàng)參數(shù)由電腦自動(dòng)監(jiān)控。隔離器外部亦為屏障環(huán)境,其建造要求和參數(shù)符合GB50447—2008《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施建設(shè)技術(shù)規(guī)范》及 GBl4925—2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》的規(guī)定[25-26]。設(shè)施設(shè)備啟用前進(jìn)行嚴(yán)格的消毒,檢測合格之后方可投入使用。日常生產(chǎn)管理中需要建立、健全各項(xiàng)管理制度和操作規(guī)程,進(jìn)入設(shè)施內(nèi)物品須嚴(yán)格消毒,定期對內(nèi)外屏障環(huán)境進(jìn)行消毒。此外,還要對動(dòng)物定期進(jìn)行檢測,及時(shí)淘汰病原或抗體陽性犬只。

    仔犬的生長發(fā)育與生產(chǎn)方式、乳品質(zhì)量、斷奶日齡、飼養(yǎng)管理、飼料營養(yǎng)成分、生活環(huán)境等諸多因素有關(guān)。本研究通過無菌接產(chǎn)獲得仔犬,由于缺乏初乳及哺乳時(shí)間較長,加之仔犬生活在潔凈環(huán)境中,難以建立起普通環(huán)境中的腸道菌群,導(dǎo)致SPF仔犬生長發(fā)育各項(xiàng)指標(biāo)均低于普通環(huán)境下飼養(yǎng)的仔犬。此外,SPF仔犬生活空間狹小,缺乏有效的鍛煉,這也是其較之普通環(huán)境下飼養(yǎng)的仔犬體型小的原因。

    目前為止,我國尚無一家單位可穩(wěn)定、批量提供SPF級比格犬,這種狀況嚴(yán)重影響了犬疫病研究、疫苗研發(fā)及評價(jià)工作,對人獸共患病的防制極為不利。本研究通過對母犬進(jìn)行高強(qiáng)度免疫凈化病原,通過無菌接產(chǎn)獲得SPF仔犬,將其飼養(yǎng)在正壓屏障系統(tǒng)中的無菌隔離器中,同時(shí)對環(huán)境、用具、飼料、飲水等進(jìn)行嚴(yán)格的控制。病原及抗體檢測結(jié)果表明,本方法生產(chǎn)的SPF仔犬,完全達(dá)到并優(yōu)于國標(biāo)要求,可用于SPF犬的批量生產(chǎn)及SPF犬核心種群的建立。本研究所建立的配套技術(shù)及生產(chǎn)的產(chǎn)品,不僅為我國重大動(dòng)物疫病防控所急需,還將在人類醫(yī)學(xué)研究特別是新藥研發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。

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