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    黑木耳中粗多糖檢測前處理?xiàng)l件的研究

    2021-09-01 13:32:40吳家玲龔曉瑩陳曉嘉麥慧甜
    現(xiàn)代食品 2021年12期
    關(guān)鍵詞:水浴黑木耳乙醇

    ◎ 吳家玲,龔曉瑩,陳曉嘉,麥慧甜

    (1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 511442;2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司,廣東 廣州 511442;3.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站,廣東 廣州 511442)

    黑木耳又名黑菜,屬于層菌綱木耳科,可藥食兩用[1]。黑木耳具有很高的營養(yǎng)價(jià)值,富含蛋白質(zhì)及8種人體必需的氨基酸,還含有多種糖類、維生素和微量元素等營養(yǎng)成分[2]。黑木耳富含多種活性成分,如膠原、多糖、木耳黑色素、卵磷脂、植物堿和發(fā)酵素等[1]。其中,多糖是黑木耳的主要活性成分[3-4],具有預(yù)防高血壓、高血脂、冠心病、抗血栓及抗衰老等作用[5],廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品中。

    多糖在植物、動物與微生物體內(nèi)廣泛存在,是天然高分子中的一大類。目前,食品中多糖的測定方法主要是堿性酒石酸銅滴定法和比色法(苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法)兩種。一般來說,比色法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高(可達(dá)μg·mL-1,滴定法為mg·mL-1),樣品用量少;缺點(diǎn)是做常規(guī)測定時(shí)用葡萄糖作為對照品,誤差較大。其中,苯酚-硫酸分光法是粗多糖測定最常用的方法,其原理是多糖經(jīng)乙醇沉淀分離后,去除其他可溶性糖及雜質(zhì)的干擾,再與苯酚-硫酸作用生成橙紅色化合物,其呈色強(qiáng)度與溶液中糖的濃度成正比[6]。

    本文使用苯酚-硫酸法測定黑木耳中粗多糖含量,針對黑木耳中粗多糖進(jìn)行檢測前處理?xiàng)l件優(yōu)化的研究,分別對樣品水浴時(shí)間、乙醇濃度、離心速度、乙醇洗滌次數(shù)4個(gè)前處理?xiàng)l件進(jìn)行單因素試驗(yàn),并采取4因素4水平正交試驗(yàn)進(jìn)行條件優(yōu)化,對檢測結(jié)果進(jìn)行分析,得出合理穩(wěn)定的檢測前處理?xiàng)l件。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    市售黑木耳,葡萄糖(99.9%,Aladdin公司),無水乙醇、硫酸和苯酚均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ME204E/02型電子天平,METTLER TOLEDO;EX125DZH型電子天平,奧豪斯儀器(常州)有限公司;HWS-26型水浴鍋,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;KQ-500DE型超聲清洗機(jī),昆山市超聲儀器有限公司;3K15型離心機(jī),北京博勵(lì)行儀器有限公司;T9型雙光束紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 工作曲線繪制

    稱取0.100 0 g葡萄糖于1 L容量瓶中加水溶解并定容,即得到濃度為100 mg·L-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液[6]。

    分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL于25 mL比色管中,用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL。向試液中加入1.0 mL 5%苯酚溶液,然后快速加入5.0 mL硫酸,靜置10 min。使用渦旋振蕩器使反應(yīng)液充分混合,然后將比色管放置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min,于490 nm處測吸光度。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程由紫外分光光度計(jì)自帶軟件UVWin6.1軟件得出,回歸方程為y=91.583 75x+1.800 6,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3,標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

    圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

    1.3.2 樣品前處理

    將準(zhǔn)備好的樣品置于200 mL容量瓶中,加蒸餾水100 mL左右,沸水浴回流提取1 h,冷卻至室溫后補(bǔ)水至刻度,混勻后過濾,棄去初濾液,收集剩余濾液供沉淀粗多糖。取樣液5 mL加入20 mL無水乙醇,同時(shí)使用渦旋振蕩器振搖,超聲提取30 min[7]。提取結(jié)束后,于4 000 r·min-1條件下離心10 min,棄去上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇溶液洗滌、離心。用蒸餾水將上述不溶物轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并搖勻,取1 mL樣品溶液于25 mL比色管中,并做空白試驗(yàn),樣品和空白與標(biāo)曲顯色步驟一致,最后比色并代入回歸方程進(jìn)行計(jì)算[6]。

    1.3.3 粗多糖的含量計(jì)算

    按照式(1)計(jì)算黑木耳中粗多糖的含量:

    式(1)中:X-試樣中粗多糖的含量,g/100 g;C-由標(biāo)準(zhǔn)曲線算得被測液中試樣中粗多糖的質(zhì)量,μg;m-試 樣 質(zhì) 量,g;V1-試 樣 定 容 體 積,mL;V2-試樣提取體積,mL;V3-提取總多糖后定容體積,mL;V4-測定用試樣體積,mL;0.9-葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

    1.3.4 單因素試驗(yàn)

    分別對水浴時(shí)間(1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h)、乙醇濃度(75%、80%、85%和90%)、離心速度(5 000 r·min-1、6 000 r·min-1、7 000 r·min-1和8 000 r·min-1)、洗滌次數(shù)(2次、3次、4和5次)4種處理?xiàng)l件進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

    1.3.5 正交試驗(yàn)

    根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果,進(jìn)行正交試驗(yàn),以粗多糖提取率來確定黑木粗中粗多糖檢測前處理最佳條件組合。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 水浴時(shí)間對檢測結(jié)果的影響

    分別水浴1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h進(jìn)行試驗(yàn),分析水浴時(shí)間對檢測結(jié)果的影響,結(jié)果如圖2所示。從圖2看出,水浴時(shí)間對粗多糖的檢測結(jié)果影響明顯,水浴時(shí)間延長粗多糖含量呈先遞增后趨于平穩(wěn)的趨勢。在1.5~2.0 h粗多糖提取率增加趨勢明顯,2.0~3.0 h趨于平穩(wěn),3.0 h提取率達(dá)到最高。由此得出,粗多糖溶出率隨水浴時(shí)間延長而提高。

    圖2 不同水浴時(shí)間對粗多糖檢測結(jié)果的影響圖

    2.2 乙醇濃度對檢測結(jié)果的影響

    分別使用75%、80%、85%和90%的乙醇濃度進(jìn)行試驗(yàn),分析乙醇濃度對檢測結(jié)果的影響,結(jié)果如圖3所示。從圖3可得出,隨著乙醇濃度的提高,檢測得到的粗多糖含量呈先遞增后遞減的規(guī)律,當(dāng)乙醇濃度從75%提高至85%時(shí)檢測得到的粗多糖含量逐漸增大,當(dāng)乙醇濃度由85%提高至90%時(shí)檢測含量出現(xiàn)下降。由此得出乙醇濃度85%時(shí)黑木耳粗多糖沉淀更完全。

    圖3 不同乙醇濃度對粗多糖檢測結(jié)果的影響圖

    2.3 離心速度對檢測結(jié)果的影響

    分別使用5 000 r·min-1、6 000 r·min-1、7 000 r·min-1和8 000 r·min-1的離心速度進(jìn)行試驗(yàn),分析離心速度對檢測結(jié)果的影響,結(jié)果如圖4所示。從圖4可得出,在離心速度為5 000~8 000 r·min-1時(shí),檢測得到的粗多糖含量呈先遞增后趨于平穩(wěn)的規(guī)律。在離心速度為5 000~6 000 r·min-1時(shí),檢測結(jié)果上升較慢;在6 000~7 000 r·min-1時(shí),檢測結(jié)果增速比較快;在離心速度為7 000~8 000 r·min-1時(shí),檢測得到的粗多糖含量呈趨于平穩(wěn)的規(guī)律。由此得出,離心速度達(dá)到7000 r·min-1及以上時(shí)粗多糖沉淀較為完全。

    圖4 不同離心速度對粗多糖檢測結(jié)果的影響圖

    2.4 乙醇洗滌次數(shù)對檢測結(jié)果的影響

    分別按照2、3、4和5次的洗滌次數(shù)進(jìn)行試驗(yàn),分析乙醇洗滌次數(shù)對檢測結(jié)果的影響,結(jié)果如圖5所示。從圖5可得出,洗滌次數(shù)由2次增加到3次時(shí),檢測得到的粗多糖含量快速降低;洗滌次數(shù)為3次和4次時(shí),檢測結(jié)果差別不大;在洗滌次數(shù)達(dá)到5次時(shí),檢測結(jié)果再次出現(xiàn)微量下降。由此得到,乙醇洗滌次數(shù)的增加會導(dǎo)致黑木耳粗多糖檢測含量的降低。

    圖5 不同乙醇洗滌次數(shù)對粗多糖檢測結(jié)果的影響圖

    2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

    根據(jù)4因素4水平正交實(shí)驗(yàn)L16(44)的試驗(yàn)結(jié)果,以“測定值與平均值相對偏差”為指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,獲取最佳實(shí)驗(yàn)條件組合,結(jié)果見表1。

    根據(jù)表1中4個(gè)因素的極差值R可知,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大的前處理是水浴時(shí)間,次之是乙醇濃度,再之是乙醇洗滌次數(shù),離心速度是影響最小的條件。

    表1 L16(44)正交實(shí)驗(yàn)分析表

    根據(jù)表中K1~K4與平均值的相對偏差分析得出,最佳實(shí)驗(yàn)條件組合為A2B2C3D3,即檢測前處理?xiàng)l件為水浴時(shí)間2 h、乙醇濃度80%、離心速度7 000 r·min-1、乙醇洗滌次數(shù)4次。

    3 結(jié)論

    根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)分析得出:在4個(gè)因素中,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大的前處理是水浴時(shí)間,次之是乙醇濃度,再之是乙醇洗滌次數(shù),而離心速度是影響最小的條件;其最佳實(shí)驗(yàn)條件組合為水浴時(shí)間2 h、乙醇濃度80%、離心速度7 000 r·min-1、乙醇洗滌次數(shù)4次。

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