液相色譜-原子熒光聯(lián)用法測(cè)定沙丁魚罐頭中甲基汞含量的不確定度評(píng)定

◎ 郭倩倩，李 新，康雪梅，李夢(mèng)雨，賈松濤，李 超，趙雪峰，趙林萍

（1.河南中標(biāo)檢測(cè)服務(wù)有限公司，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)，河南 鄭州 450000）

汞是一種對(duì)環(huán)境和人體有害的重金屬，隨著食物鏈傳遞和富集，在水生系統(tǒng)中尤其嚴(yán)重。MOHAN等人[1]發(fā)現(xiàn)汞的積累潛力沿著食物鏈增加，在魚類組織中有較高的汞濃度。朱文慧等人[2]發(fā)現(xiàn)魚體內(nèi)汞含量可能較生活環(huán)境中的汞含量高100萬倍。

汞以多種形態(tài)廣泛存在于環(huán)境中，其中甲基汞是具有較強(qiáng)生物有效性和毒性的有機(jī)汞形態(tài)，在所有汞化合物中毒性最強(qiáng)[3]，在我國(guó)各種環(huán)境介質(zhì)和生物體組織中都檢測(cè)到了甲基汞的存在[4]。甲基汞具有高神經(jīng)毒性、致癌性，且在生物體中造成累積和放大效應(yīng)，可對(duì)人類及食魚生物的健康造成嚴(yán)重影響[5]，PRINCE等人[6]發(fā)現(xiàn)甲基汞暴露選擇性地靶向腦和小腦皮質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)育不良，蘇海磊等人[7]發(fā)現(xiàn)甲基汞可以對(duì)脊椎動(dòng)物造成神經(jīng)蘇醒、內(nèi)分泌干擾和生殖毒性等。有研究數(shù)據(jù)表明，通過食物鏈的傳遞作用，魚類等水生生物可以將水體中ng·L-1級(jí)甲基汞富集達(dá)10～20萬倍[8]。對(duì)此，中國(guó)、歐盟、美國(guó)、日本、韓國(guó)及澳大利亞等均對(duì)水產(chǎn)品中甲基汞含量做了限制，且中國(guó)對(duì)甲基汞的限量要求相對(duì)偏嚴(yán)[9]，因此要求檢測(cè)人員準(zhǔn)確測(cè)定水產(chǎn)食品中的甲基汞含量。

本文選取基質(zhì)較為復(fù)雜的沙丁魚罐頭作為研究對(duì)象，依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[10]和《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS-GL006：2019）[11]，對(duì)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定》（GB 5009.17—2014）第二篇中甲基汞測(cè)定不確定度進(jìn)行分析和評(píng)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀（北京吉天SA20）；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；振蕩器（德國(guó)IKA）；電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；玻璃量器（北京玻璃廠）。

甲基汞溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（65.0 μg·g-1，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；硝酸（優(yōu)級(jí)純，蘇州晶瑞）；甲醇（色譜純）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純）；其余試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定》（GB 5009.17—2014）第二篇液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法，進(jìn)行測(cè)定。

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品1.0 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入5 mol·L-1的鹽酸溶液10 mL，放置過夜。室溫下超聲水浴提取60 min，期間數(shù)次震搖。4 ℃下以8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心15 min。準(zhǔn)確吸取2.0 mL上清液至5 mL容量瓶中，逐滴加入6 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，使pH為2～7。加入10 g·L-1的L-半胱氨酸0.1 mL，最后用水定容至刻度。用0.45 μm有機(jī)系濾膜過濾，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取甲基汞溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.384 6 g，用純水定容至25 mL容量瓶中，搖勻，得到甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 μg·mL-1。用10 mL單標(biāo)線移液管準(zhǔn)確量取10 mL甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL容量瓶中，得到100 μg·L-1甲基汞中間工作液；分別用移液管移取0 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL至25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，分別得到濃度為0 μg·L-1、1 μg·L-1、2 μg·L-1、4 μg·L-1、6 μg·L-1、8 μg·L-1和10 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 儀器條件

（1）液相色譜。色譜柱：C18色譜柱（柱長(zhǎng)150 mm，內(nèi)徑4.6 mm）；流動(dòng)相：5%甲醇+0.06 mol·L-1乙酸銨+0.1% L-半胱氨酸；流動(dòng)相洗脫方式：等度洗脫；流動(dòng)相流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積，100 μL。

（2）原子熒光光度計(jì)。負(fù)高壓：300 V；燈電流：30 mA；載氣流速：400 mL·min-1；輔助氣流速：400 mL·min-1；載流：10%鹽酸溶液；還原劑：2 g·L-1KHB4；氧化劑，2 g·L-1過硫酸鉀。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度評(píng)定數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)甲基汞含量計(jì)算公式以及測(cè)量不確定度的主要影響因素，建立沙丁魚罐頭中甲基汞含量的不確定度評(píng)定數(shù)學(xué)模型（1）：

式（1）中，X為試樣中甲基汞的含量，mg·kg-1；C為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的測(cè)定液中甲基汞的濃度，μg·L-1；C0為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的空白溶液中甲基汞的濃度，μg·L-1；V為加入提取試劑的體積，mL；m為試樣稱樣量，g；f為稀釋因子；1 000為換算系數(shù)。

2.2 不確定度來源與分析

從樣品前處理過程、測(cè)量過程和數(shù)學(xué)模型分析，用液相色譜-原子熒光聯(lián)用法測(cè)定沙丁魚罐頭中甲基汞不確定度來源，主要有以下幾個(gè)方面：樣品測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度、樣品稱量引入的不確定度、樣品前處理及定容過程引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度。

2.2.1 樣品測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(rep)

在重復(fù)性條件下，對(duì)同一樣本重復(fù)測(cè)量10次，測(cè)得樣品中甲基汞的含量分別為0.17 mg·kg-1、0.17 mg·kg-1、0.18 mg·kg-1、0.19 mg·kg-1、0.16 mg·kg-1、0.18 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.17 mg·kg-1、0.18 mg·kg-1和0.20 mg·kg-1，其平均值為0.18 mg·kg-1。

測(cè)量重復(fù)性以標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，10次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差按貝塞爾公式計(jì)算為：

以兩次測(cè)量的平均值作為最終測(cè)定結(jié)果，則本次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

本次測(cè)定兩個(gè)結(jié)果分別為X1=0.18 mg·kg-1，X2=0.19 mg·kg-1，其平均值為0.18 mg·kg-1，則測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

根據(jù)萬分之一電子天平校準(zhǔn)證書，其最大允許誤差為±0.000 5 g，稱量?jī)纱?，?次空燒杯，第2次空燒杯加樣品，因?yàn)槊恳淮畏Q量均為獨(dú)立的觀測(cè)結(jié)果，兩者的現(xiàn)行影響間是不相關(guān)的[11]。按照矩形分布其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

根據(jù)方法要求，稱取混合均勻的樣品1.0 g，則樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 樣品前處理及定容過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)

樣品前處理及定容過程中不確定度由玻璃量器引入。根據(jù)《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[12]要求的容量允差，假設(shè)其為矩形分布則可計(jì)算各量器由體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(a)，u(a)=容量允差由實(shí)驗(yàn)室溫度在（20±5）℃，得ΔT=5 ℃，水在20 ℃的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，按照矩形分布計(jì)算溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(b)，結(jié) 合 體 積 和 溫度引入的不確定度，各玻璃量器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為樣品前處理及定容過程，玻璃量器引入的不確定度具體計(jì)算見表1。

表1 樣品前處理及定容過程玻璃量器引入的不確定度表

樣品前處理及定容過程中，10 mL分度移液管、2 mL分度移液管、5 mL容量瓶各用到一次，綜上計(jì)算，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c)

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制引入的不確定度主要包括：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的不確定度（包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容）、標(biāo)準(zhǔn)中間工作液配制引入的不確定度以及標(biāo)準(zhǔn)曲線系列配制過程中引入的不確定度。

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c1)。甲基汞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書給出的濃度為（65.0±2.5）μg·g-1，k=2，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c2)。①標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c′2)。根據(jù)十萬分之一天平校準(zhǔn)證書，其最大允許誤差為±0.5 mg，按照均勻分布則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.384 6 g，則產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

②標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c′2)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容引入的不確定度由單標(biāo)線容量瓶的容量允差帶入。按矩形分布其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容過程玻璃量器引入的不確定度表

則由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）標(biāo)準(zhǔn)中間工作液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c3)。標(biāo)準(zhǔn)中間工作液配制引入的不確定度由移液管和容量瓶的容量允差帶入，假設(shè)其為矩形分布其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)中間工作液配制過程玻璃量器引入的不確定度表

則標(biāo)準(zhǔn)中間工作液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c4)。標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度由容量瓶和移液管容量允差帶入，假設(shè)其為矩形分布則標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程中25 mL容量瓶引入的不確定度計(jì)算同表2，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.000 92，分度移液管引入的不確定度計(jì)算見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程分度移液管引入的不確定度表

在甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中，25 mL容量瓶用到7次，則標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由此得出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(q)

標(biāo)準(zhǔn)曲線是采用最小二乘法對(duì)甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X與其對(duì)應(yīng)的峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得到甲基汞標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=bX+a，本實(shí)驗(yàn)對(duì)7個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別重復(fù)3次測(cè)定，根據(jù)其平均值擬合所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=10 882X-891.2（R2=0.999 0），標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定結(jié)果表

標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算公式為：

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為：

其中Ai為建立工作曲線用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中甲基汞的質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的峰面積；b為擬合曲線的斜率，b=10 882；a為擬合曲線的截距，a=-891.2；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液總測(cè)試次數(shù)，n=21；p為樣品的測(cè)試次數(shù)，p=2；c0為實(shí)測(cè)樣品的平均測(cè)試濃度，c0=7.505 7 μg·L-1；ci為標(biāo)準(zhǔn)溶液各校準(zhǔn)點(diǎn)的濃度，μg·L-1；為標(biāo)準(zhǔn)曲線各校準(zhǔn)點(diǎn)的平均濃度，c-=4.428 6 μg·L-1；i為濃度水平序號(hào)。

在不確定度的評(píng)定過程中，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行兩次測(cè)定，平均測(cè)試濃度為c0=7.505 7 μg·L-1，從上述數(shù)據(jù)和公式，可得S=720.92，u(q)=0.054 μg·L-1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 合成不確定度

各個(gè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量及量值，匯總見表6。

表6 各個(gè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度來源分量及量值表

對(duì)表中各分量進(jìn)行合成，得到合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

本次實(shí)驗(yàn)，沙丁魚罐頭中甲基汞含量測(cè)定的平均值為0.18 mg·kg-1，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 擴(kuò)展不確定度及不確定度結(jié)果報(bào)告

在95%的置信區(qū)間下，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度為U(X)=k×u(X)=0.022 mg·kg-1。

沙丁魚罐頭中甲基汞含量結(jié)果表示為（0.18±0.03）mg·kg-1。

3 結(jié)論

按照GB 5009.17—2014的檢測(cè)方法，對(duì)液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀測(cè)定丁魚罐頭中甲基汞含量進(jìn)行不確定度分析，不確定度結(jié)果表示為：X=（0.18±0.03）mg·kg-1，k=2。

從不確定度評(píng)定過程來看，影響實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果的因素主要有樣品測(cè)量的重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合，這就要求檢測(cè)人員在今后的檢測(cè)工作中，增加平行樣的檢測(cè)頻次、使用精度較高的計(jì)量器具、規(guī)范操作要求等，以降低不確定度帶來的影響，提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，為保障食品安全提供強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)支撐，為食品安全保駕護(hù)航。