超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中金剛烷胺的殘留量

◎ 刁玉華，張加穩(wěn)

（昆明市食品藥品檢驗所，云南 昆明 650032）

金剛烷胺是飽和三環(huán)癸烷的氨基衍生物，屬于三環(huán)胺類。1966年，人類首次研究發(fā)現(xiàn)金剛烷胺具有抗病毒的功效，其于1976年成為美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）首次批準的抗病毒藥物，主要用于預(yù)防亞洲甲型流感病毒的感染，臨床上還被用于治療帕金森綜合征、丙型肝炎和多發(fā)性硬化癥[1-2]。大型流感的爆發(fā)會造成畜禽動物極高的發(fā)病率和死亡率，養(yǎng)殖戶為降低經(jīng)濟損失，將金剛烷胺類藥物添加至飼料中用于畜禽流感的預(yù)防和治療，然而非法使用金剛烷胺類藥物會造成動物體內(nèi)藥物殘留，加大病毒的耐藥性和變異性，人體食用后會損傷生殖系統(tǒng)[3-4]。因此，包括我國在內(nèi)的多個國家已將金剛烷胺列為禁用藥物，且2017年原農(nóng)業(yè)部印發(fā)的《關(guān)于動物及動物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計劃的通知》將其定為首個監(jiān)控項目[5]。

目前，金剛烷胺的檢測方法有高效液相色譜法[6-7]、氣相色譜法[8]、酶聯(lián)免疫法[9]、電化學法[10]、微流控芯片法[11]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]等。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法已經(jīng)成為近年獸藥殘留檢測分析的主要方法，具有靈敏度高、基質(zhì)干擾小、高通量及定性定量更準確等優(yōu)點。查閱文獻可知，關(guān)于肉制品中金剛烷胺殘留量檢測的相關(guān)報道較多[14-16]，提取溶劑多采用甲醇或乙腈與有機酸混合提取，而進出口行業(yè)標準《出口動物組織中抗病毒類藥物殘留的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 4253—2015）[17]僅以三氯乙酸作為提取溶劑，提取液均用混合陽離子固相萃取柱凈化，實驗驗證后發(fā)現(xiàn)上述方法的提取效率和重現(xiàn)性均不理想，而關(guān)于其他提取溶劑和固相萃取柱的相關(guān)研究報道又較少。故本實驗選取市售雞蛋為基質(zhì)樣品，分別對提取溶劑、固相萃取柱進行優(yōu)化研究，最終建立了系統(tǒng)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，可為雞蛋中金剛烷胺殘留量的檢測分析提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯及異丙醇，均為色譜純，購自默克股份兩合公司；甲酸、乙酸、三氯乙酸、鹽酸、氨水、乙酸銨，均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

材料：金剛烷胺標準品（中國食品藥品檢定研究院），Cleanert C18、Oasis HLB、PCX、MCX、SCX、WCX共6種固相萃取柱（均為天津博納艾杰爾科技有限公司），BHE Amide色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm，美國沃特世公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP 4500超高效液相-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源ESI及MultiQuant3.0.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國AB SCIEX公司）、JJ500電子天平（常熟市雙杰測試儀器）、SK8210HP超聲波清洗儀（上?？茖В?、Reacti-Therm氮吹儀（美國賽默飛世爾公司）、arium? comfort II超純水機（德國賽多利斯公司）、S220K精密pH計（梅特勒-托利多公司）。

1.3 方法與過程

1.3.1 標準溶液的配制

精確稱取金剛烷胺標準品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度配制成100 μg·mL-1的標準儲備液，4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

取100 μg·mL-1的 標 準 儲 備 液 用 乙 腈 配 制 成1 μg·mL-1標準使用液，用30%乙腈稀釋標準使用液為5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、25.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、80.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1的系列標準溶液，待用。

1.3.2 樣品前處理

（1）實驗樣品制備。選取市售雞蛋去殼用組織搗碎機搗碎，裝入自封袋中，冷藏、避光保存，備用。

（2）提取。準確稱取均勻試樣5 g，于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈-2.0%三氯乙酸溶液（1∶1，V/V），漩渦混勻3 min，再超聲提取10 min，8 000 r·min-1離心5 min，取出上清液，再重復提取一次，離心后合并上清液至25 mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度待凈化。

（3）凈化。依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 2%甲酸活化混合陽離子交換固相萃取小柱，準確移取5 mL稀釋液過柱，依次用5 mL甲酸溶液、3 mL1%甲酸乙腈淋洗，棄去全部流出液；用2×2 mL甲醇-氨水-乙酸銨（95+2.5+2.5）洗脫至10 mL試管中，在40 ℃下用氮吹儀吹至近干。準確加入1.0 mL乙腈-甲醇-水（70+10+20）溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

（1）液相條件。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相A為含0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈，洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫條件表

（2）質(zhì)譜條件。ESI-MS/MS條件：正離子掃描；MRM多反應(yīng)監(jiān)測；氣簾氣流速為38 L·h-1，離子源霧化氣流速為55 L·h-1，離子源輔助加熱氣流速為55 L·h-1，噴霧電壓5 500 V，加熱器溫度為550 ℃；優(yōu)化后的相關(guān)參數(shù)見表2。

表2 金剛烷胺保留時間及質(zhì)譜參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

金剛烷胺分子結(jié)構(gòu)中含有胺基基團，在質(zhì)譜檢測離子化過程中，容易形成穩(wěn)定的[M+H]+離子，故采用電噴霧正離子（ESI+）掃描模式。正離子掃描模式下，在液相色譜流動相中加入少量的甲酸會增強待測化合物的響應(yīng)強度，原因是甲酸會電離出更多的H+，因此本實驗選用0.1%的甲酸水溶液與乙腈為流動相，由于金剛烷胺含有胺基基團，極性較強，故采用BHE Amide色 譜 柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm，Waters）進行梯度洗脫，保證有較好的峰形和響應(yīng)強度。建立優(yōu)化后的液相色譜參數(shù)和質(zhì)譜參數(shù)后對加標樣品溶液采集的離子色譜峰圖分別如圖1所示。

圖1 金剛烷胺加標溶液的MRM離子色譜圖

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

金剛烷胺分子結(jié)構(gòu)含有胺基，極性較強，根據(jù)相似相溶原理，易溶于強極性有機溶劑中，故本實驗分別比較甲醇、乙腈、異丙醇、二氯甲烷以及乙酸乙酯等不同極性的有機溶劑分別與2.0%的甲酸、乙酸、鹽酸和三氯乙酸等以1∶1體積混合進行提取。其中，異丙醇-2.0%三氯乙酸（1∶1，V/V）作為提取溶劑的提取效果最好，原因可能是金剛烷胺的極性與異丙醇相似，且三氯乙酸可沉淀蛋白，減少基質(zhì)干擾，因此本實驗選用異丙醇-2.0%三氯乙酸（1∶1，V/V）作為提取溶劑。

2.2.2 凈化柱的優(yōu)化

金剛烷胺分子結(jié)構(gòu)中含有胺基，在酸性條件下呈陽離子狀態(tài)，故目前實驗室多采用陽離子交換固相萃取柱對提取液進行凈化。本實驗分別比較了MCX、PCX、SCX、WCX、HLB和C18固相萃取柱對目標物提取液的凈化效果，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同固相萃取柱凈化下金剛烷胺的提取回收率圖

由圖2可知，采用Oasis MCX比其他5種固相萃取柱凈化回收率高，原因可能是其填料對金剛烷胺所形成的[M+H]+離子吸附作用較強，且易于洗脫，因此本實驗選擇Oasis MCX作為固相凈化柱。

2.3 校準曲線、檢出限和定量限

金剛烷胺的質(zhì)量濃度在5.0～100.0 ng·mL-1時，其目標物定量離子對的峰面積與其質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 1，線性回歸方程為y=48 324x +174 820。以信噪比S/N=3時對應(yīng)的濃度作為方法的檢出限，信噪比S/N=10時對應(yīng)的濃度為定量限，得到金剛烷胺的檢出限為0.3 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。

2.4 回收率和精密度

在空白樣品中分別添加1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-13個濃度水平的金剛烷胺標準溶液，每個水平進行6次平行實驗，按照優(yōu)化的實驗方法測定，計算其加標回收率及精密度。

實驗結(jié)果見表3，加標樣品中金剛烷胺的平均回收率為87.5%～97.6%，相對標準偏差均小于6%，GB/T 27404—2008規(guī)定被測組分含量小于100 μg·kg-1，回收率為60%～120%、精密度21%～30%[18]，可見本方法加標回收率和精密度較好。

表3 樣品加標回收率實驗結(jié)果表（n=6）

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中金剛烷胺殘留量的分析方法。分別對提取溶劑、固相萃取柱、儀器條件做了優(yōu)化研究，優(yōu)化后的實驗方法為以異丙醇-2.0%三氯乙酸（1∶1，V/V）為提取溶劑、以O(shè)asis MCX為固相萃取凈化柱對樣品進行前處理，再以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相，采用ESI正離子模式電離，多級反應(yīng)監(jiān)測（MRM）進行檢測。實驗結(jié)果顯示，本方法相關(guān)系數(shù)為0.999 1，檢出限為0.3 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1，回收率為87.5%～97.6%，相對標準偏差均小于6%?？梢娫摲椒ú僮骱啽恪⒖焖?，前處理干凈，基質(zhì)干擾小，回收率高、重復性好，滿足大批量禽蛋中金剛烷胺殘留量的檢測分析。