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    高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定馬鈴薯中的α-茄堿和α-卡茄堿

    2021-09-01 12:35:24陳琳珊陳佩佩吳永坤
    現(xiàn)代食品 2021年14期
    關(guān)鍵詞:糖苷乙腈定量

    ◎ 陳琳珊,陳佩佩,陳 茹,吳永坤

    (1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 511442;2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司,廣東 廣州 511442;3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站,廣東 廣州 511442;4.中山市小欖鎮(zhèn)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心,廣東 中山 528400)

    茄堿是一種有害的生物堿類(lèi)物質(zhì),主要以糖苷的形式存在,一般出現(xiàn)在茄科類(lèi)作物中,尤其是腐敗的茄科蔬菜[1],是導(dǎo)致茄科蔬菜中毒中的常見(jiàn)毒素之一。其主要成分為α-茄堿和α-卡茄堿,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。茄堿抑制體內(nèi)膽堿酯酶的活性,從而使乙酰膽堿積聚,引起神經(jīng)興奮,胃腸肌肉痙攣,中毒時(shí)出現(xiàn)腹痛、腹瀉、惡心和嘔吐等癥狀,情況嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致脫水、發(fā)熱、昏迷,甚至呼吸衰竭[2-3]。盡管有研究表明,茄堿對(duì)前列腺、肝、乳腺等癌細(xì)胞有一定的抑制作用[4-6],但對(duì)消費(fèi)者日常飲食的危害也不容忽視。

    圖1 α-茄堿和α-卡茄堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖

    目前,針對(duì)茄堿的分析方法主要分為化學(xué)方法、成像技術(shù)和生物技術(shù)3大類(lèi)[7],由于分光光度法[8]、成像技術(shù)[9]、放射免疫[10]、酶聯(lián)免疫[11]和比色法[12]等方法存在定量不準(zhǔn)確、操作煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)和價(jià)格昂貴等缺點(diǎn),科研工作者的研究主要集中在高效液相色譜法[13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]。但高效液相色譜法需調(diào)節(jié)流動(dòng)相使目標(biāo)物有效分離,因此分析時(shí)間長(zhǎng),且α-茄堿和α-卡茄堿吸光度較弱,因此檢測(cè)波長(zhǎng)較低,容易受雜質(zhì)干擾,影響分析結(jié)果。質(zhì)譜法具有定性定量能力強(qiáng)、分析時(shí)間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的批量化檢測(cè)。本文建立的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,具有較高靈敏度,同時(shí)回收率高,重現(xiàn)性好,可為后續(xù)研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    API4000Q TRAP質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)、島津LC-20AD液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)、4k-15離心機(jī)(北京卓明貿(mào)易有限公司)、IKA Vortex4渦旋混勻器(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)、Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)(法國(guó)Merck Millipore公司)。

    α-茄堿、α-卡茄堿(純度大于98.5%,德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司,購(gòu)自上海安譜公司)、甲酸、甲醇、乙腈(LC-MS級(jí),美國(guó)Thermo Fisher公司)、C18、PSA、GCB、硅膠、NH2粉、中性氧化鋁、堿性氧化鋁(分析純,購(gòu)自上海安譜公司)。

    1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別稱(chēng)取兩種茄堿適量標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃下避光保存。

    混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:將標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈稀釋為10 mg·L-1的中間液,將馬鈴薯基質(zhì)溶液依次稀釋為10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1、500 μg·L-1、1 000 μg·L-1制作校準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)加入法定量。

    1.3 樣品前處理

    馬鈴薯樣品均質(zhì)。稱(chēng)取2.5 g樣品于50 mL離心管中,加5 mL 水和20 mL 0.5%甲酸乙腈溶液(V/V),渦旋混勻,加4.0 g無(wú)水硫酸鎂和1.5 g醋酸鈉粉末,渦旋提取10 min。后置于離心機(jī)中,以10 000 r·min-1離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中,并定容混勻。取1 mL提取液用50 mg C18凈化,過(guò)膜上機(jī)。

    1.4 色譜條件

    色譜柱:Xbridge BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:35 ℃;流動(dòng)相A(乙腈)-B(0.1%甲酸水溶液)(V/V);流速:0.35 mL·min-1;梯度洗脫程序:0.0~0.5 min:40%A,0.5~3.0 min:40%~90%A,3.0~3.5 min:90%A,3.5~4.0 min:90%~40%A,4.0~5.0 min:40%A。

    1.5 質(zhì)譜條件

    離子源電離方式:正模式;氣簾氣壓力:25 psi;電離電壓(IS):5 500 V;離子源溫度(TEM):550 ℃;霧化氣(GAS1):50 psi;加熱輔助氣(GAS2):50 psi;碰撞氣(CAD):medium;采集模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 質(zhì)譜條件的確定

    α-茄堿和α-卡茄堿均為糖苷,由于其主體結(jié)構(gòu)上含有一個(gè)叔胺堿的N原子,在ESI源正負(fù)離子模式均有響應(yīng)。經(jīng)兩種模式對(duì)相應(yīng)的母離子掃描后發(fā)現(xiàn),正離子模式下母離子[M+H]+比負(fù)離子模式下的[M-H]-的響應(yīng)更強(qiáng),可能是因?yàn)橹黧w結(jié)構(gòu)上的N原子或糖苷上的O原子獲取H原子的能力比糖苷上羥基-OH失去H原子更容易發(fā)生。確定母離子后,通過(guò)調(diào)節(jié)碰撞電壓(Collision Energy,CE)獲得盡可能多的二級(jí)子離子,以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式分別對(duì)去簇電壓(Declustering Potential,DP)及子離子對(duì)應(yīng)的碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化,α-茄堿和α-卡茄堿的MS/MS參數(shù)見(jiàn)表1。

    表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法測(cè)定α-茄堿和α-卡茄堿的MS/MS參數(shù)表

    2.2 色譜柱的選擇

    α-茄堿和α-卡茄堿結(jié)構(gòu)十分相似,其差異僅為糖苷位置不同和糖苷上的羥基數(shù)量不同,在化學(xué)式上的差異也僅有一個(gè)O原子的質(zhì)量數(shù),因此其色譜行為也十分相似,在色譜中難以分離,盡管對(duì)于三重四極桿結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō),可不作細(xì)致的色譜分離,但由于化學(xué)式相似,為避免α-茄堿在離子源內(nèi)裂解出m/z852.9,影響定量結(jié)果,實(shí)驗(yàn)使用了安捷倫、Waters和菲羅門(mén)公司的3款色譜柱,對(duì)2種目標(biāo)物進(jìn)行分離。如圖2所示,只有Waters公司的Xbridge BEH C18色譜柱有良好分離效果,原因可能是色譜柱的粒徑大小對(duì)分離效果有較大影響,因此選擇Xbridge BEH C18色譜柱。

    2.3 固相萃取劑種類(lèi)的選擇

    在實(shí)驗(yàn)初期發(fā)現(xiàn),在乙腈中加入甲酸能提高回收率,但體積在20 mL以上時(shí),回收率變化不大,因此在此基礎(chǔ)上對(duì)固相萃取劑種類(lèi)進(jìn)行探究。使用量為50 mg時(shí),結(jié)果顯示C18的回收率最高,GCB和堿性氧化鋁對(duì)目標(biāo)物吸附嚴(yán)重,回收率極低。盡管PSA和硅膠能吸附糖類(lèi)或其他大極性雜質(zhì),但回收率也低于50%,綜合考慮,選擇C18對(duì)提取液進(jìn)行凈化,詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖3。

    圖3 固相萃取劑種類(lèi)對(duì)回收率的影響圖

    2.4 基質(zhì)效應(yīng)

    樣品含有淀粉較多,若使用針對(duì)淀粉進(jìn)行凈化的固相萃取劑,對(duì)目標(biāo)物也有嚴(yán)重吸附,因此可能存在一定的基質(zhì)效應(yīng)。為進(jìn)一步考察,實(shí)驗(yàn)使用乙腈溶液配制濃度為100 μg·L-1的單點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液,取2份馬鈴薯基質(zhì)液,1份直接測(cè)定本底值,1份用于配制基質(zhì)單點(diǎn),濃度為100 μg·L-1。以乙腈溶液配制的單點(diǎn)計(jì)算,扣除本底值后,基質(zhì)單點(diǎn)中α-茄堿和α-卡茄堿的濃度分別為43.5 μg·L-1和48.1 μg·L-1,說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)抑制響應(yīng)值比例為原來(lái)的45%,小于80%,需用基質(zhì)曲線進(jìn)行校正,由于沒(méi)有找到空白的基質(zhì)樣品,因此校正濃度截距后定量。

    2.5 定量方程及準(zhǔn)確性

    使用馬鈴薯基質(zhì)液配制曲線后測(cè)定,以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸,得到的曲線的X軸截距的絕對(duì)值為該樣品含量,若要使用此曲線對(duì)其他馬鈴薯樣品進(jìn)行定量,需將X軸截距校正至原點(diǎn)。在1.2的線性范圍內(nèi)(10~1 000 μg·L-1),測(cè)定α-茄堿和α-卡茄堿的曲線方程分別為Y=88.5X+3 800和Y=157X+2 970,相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6和0.999 4。按照信噪比的3倍和10倍不斷稀釋樣品濃度后,方法檢出限均為0.1 mg·kg-1,定量限均為0.3 mg·kg-1。線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限均滿(mǎn)足一般樣品中α-茄堿和α-卡茄堿含量的測(cè)定,達(dá)到準(zhǔn)確定量。

    2.6 方法學(xué)結(jié)果評(píng)價(jià)

    按1.3對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定,選擇含量最低的樣品平均測(cè)定6次,取其平均含量作為本底值。按照本底值附近的1倍、2倍和5倍3個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)。每個(gè)水平測(cè)定6次,α-茄堿和α-卡茄堿的3個(gè)添加水平的平均回收率范圍在85.7%~99.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在1.89%~3.31%?;厥章始熬芏染苓_(dá)到定量要求,結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 α-茄堿和α-卡茄堿的回收率和精密度表(n=6)

    3 結(jié)論

    建立HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定馬鈴薯中α-茄堿和α-卡茄堿,使用甲酸-乙腈萃取后,鹽析離心,進(jìn)一步使用C18固相萃取劑凈化,回收率達(dá)85%以上;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)母離子和子離子進(jìn)行掃描,優(yōu)化了質(zhì)譜參數(shù),使方法整體檢出限和定量限達(dá)到分析定量要求;使用不同色譜柱進(jìn)行對(duì)比,在優(yōu)化的色譜條件下,α-茄堿和α-卡茄堿2 min內(nèi)完全分離,且分離度高;3水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果表明,該方法可作為日常馬鈴薯品質(zhì)監(jiān)控的有效手段。

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