miR-15b靶向ABCC5對K562/A02細(xì)胞增殖、凋亡及阿霉素耐藥性的影響

劉牧，王巧文，薄海美

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，河北 唐山 063000； 2.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院辦公室，河北 唐山 063000)

白血病是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以無法控制的未成熟骨髓細(xì)胞增殖和存活為特征。腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致治療不理想的重要因素，故研究其耐藥機制十分必要[1-2]。研究表明，白血病化療耐藥機制與包括微RNA(microRNA，miRNA/miR)在內(nèi)的多種基因的異常表達(dá)有關(guān)[3-5]。miRNA可在白血病中充當(dāng)腫瘤促進(jìn)因子或抑制因子，影響其病理過程及化療耐藥[3-5]。miR-15b作為miR-15/16家族成員，在胰腺癌、白血病等腫瘤中異常表達(dá)，并參與細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡，與腫瘤耐藥密切相關(guān)[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b表達(dá)下調(diào)是大多數(shù)人類慢性淋巴細(xì)胞性白血病的標(biāo)志，但目前miR-15b在白血病阿霉素耐藥性中研究的報道較少[8]。本研究通過觀察人白血病K562細(xì)胞和阿霉素耐藥K562/A02細(xì)胞中miR-15b表達(dá)情況，分析miR-15b表達(dá)對K562/A02細(xì)胞增殖、凋亡和阿霉素耐藥性的影響及其機制，以初步揭示miR-15b與白血病阿霉素耐藥的關(guān)系，以期為白血病耐藥機制以及新的靶向治療機制的研究提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 人白血病阿霉素耐藥細(xì)胞系K562/A02和親本細(xì)胞系K562(天津血液研究所)，RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗、胎牛血清(美國Gibco公司生產(chǎn)，批號：200612、200905、200207、201019)；Trizol和脂質(zhì)體2000(美國Invitrogen公司生產(chǎn)，批號：200723、200916)，二甲基亞砜和噻唑藍(lán)[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT](美國Sigma公司生產(chǎn)，批號：200813、200802)；互補DNA第一鏈合成試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號：201103)，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(ATP binding cassette transporters，ABC)C5多克隆抗體、β-肌動蛋白單克隆抗體、全蛋白提取試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶凋亡檢測試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京索萊寶公司生產(chǎn)，批號：201103、201030、200930、200815、200621)，pmirGLO熒光素酶報告基因載體(中國BioVector NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心生產(chǎn)，批號：200918，貨號：3577193)。流式細(xì)胞儀(美國BD公司生產(chǎn)，型號：FACSCanto Ⅱ )，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀(美國ABI公司生產(chǎn)，型號：7900)，全自動酶標(biāo)儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一儀器廠生產(chǎn)，型號：WD-2102B、WD-9413C)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將K562細(xì)胞和K562/A02細(xì)胞接種于RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃條件下、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，其中培養(yǎng)K562/A02細(xì)胞時，加入1 mg/L阿霉素維持細(xì)胞耐藥性，實驗前2周停藥培養(yǎng)。

1.3實驗分組與處理 將K562/A02細(xì)胞隨機分為對照組(正常培養(yǎng))、miRNA對照(microRNA-NC，miR-NC)組(轉(zhuǎn)染模擬物陰性對照)、miR-15b組(轉(zhuǎn)染miR-15b模擬物)，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將K562/A02細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，按每孔5×105個接種于6孔板常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%時，再參照脂質(zhì)體2000說明書將miR-15b模擬物及其陰性對照轉(zhuǎn)染至相應(yīng)組K562/A02細(xì)胞中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4檢測miR-15b、ABCC5信使RNA(messenger RNA，mRNA)表達(dá)水平 采用Trizol法提取K562細(xì)胞或K562/A02細(xì)胞總RNA，隨后將其逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA，并以其為模板在20 μL反應(yīng)體系下上熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀進(jìn)行擴增；將U6和β-肌動蛋白分別作為miR-15b和ABCC5的內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算兩者表達(dá)水平[9]。實驗重復(fù)3次。引物(大連寶生物公司合成)序列見表1。

表1 引物序列

1.5MTT檢測 ①檢測細(xì)胞增殖：按照每孔2×105個將已培養(yǎng)至對數(shù)生長期的K562/A02細(xì)胞種植到96孔板上，而后培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%，根據(jù)1.3中分組轉(zhuǎn)染24、48和72 h后棄培養(yǎng)液；添加20 μL MTT(5 g/L)試劑孵育4 h后棄培養(yǎng)液，再加入150 μL二甲基亞砜震蕩反應(yīng)至結(jié)晶溶解后在450 nm處檢測細(xì)胞吸光度值，K562/A02細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-(實驗組吸光值/對照組吸光值)×100%，重復(fù)3次。②檢測細(xì)胞耐藥性：胰蛋白酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h后的miR-15b、miR-NC組和對照組的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度后按照每孔105個種植到96孔板上。常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，加入終濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4 mg/mL阿霉素，其中每個梯度設(shè)3個復(fù)孔；置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，先后加入MTT試劑和二甲基亞砜；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)酶標(biāo)儀檢測吸光度值計算細(xì)胞增殖抑制率及其對阿霉素半抑制濃度(half-inhibitory concentration，IC50)，重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞儀檢測 收集轉(zhuǎn)染48 h后的miR-15b組、miR-NC組和對照組的細(xì)胞，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌后，以300 μL上樣緩沖液懸浮細(xì)胞并添加5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶后15 min避光孵育檢測細(xì)胞凋亡率，重復(fù)3次。

1.7免疫印跡法檢測 按照總蛋白提取試劑盒說明書提取miR-15b組、miR-NC組和對照組K562/A02細(xì)胞總蛋白并將變性后的蛋白樣品電泳分離、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉后，以ABCC5和β-肌動蛋白一抗(1∶1 000)和二抗(1∶2 000)室溫孵育后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析K562/A02細(xì)胞中ABCC5蛋白表達(dá)情況，重復(fù)3次。

1.8雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?將包含miR-15b和ABCC5結(jié)合位點的序列片段克隆重組至pmirGLO熒光素酶報告基因載體上，作為野生型ABCC5(ABCC5-WT)載體質(zhì)粒；另外，將miR-15b和ABCC5結(jié)合位點定點突變后克隆重組至pmirGLO載體上，作為突變型ABCC5(ABCC5-MUT)載體質(zhì)粒，將構(gòu)建的ABCC5-MUT和ABCC5-WT載體質(zhì)粒分別與miR-15b模擬物及其陰性對照轉(zhuǎn)染至K562/A02細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，按試劑盒說明書檢測K562/A02細(xì)胞熒光素酶活性，重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1miR-15b在K562/A02細(xì)胞中的表達(dá) 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示，K562細(xì)胞和K562/A02細(xì)胞中miR-15b的相對表達(dá)量分別為(0.97±0.05)和(0.25±0.03)，與K562細(xì)胞比較，K562/A02細(xì)胞中miR-15b表達(dá)水平明顯降低(t=37.044，P<0.001)。

2.2miR-15b對K562/A02細(xì)胞增殖的影響 各組miR-15b表達(dá)水平和不同時點間細(xì)胞增殖抑制率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，miR-15b組細(xì)胞中miR-15b表達(dá)水平及24、48、72 h的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于對照組和miR-NC組(P<0.05)，而miR-NC組與對照組細(xì)胞中miR-15b表達(dá)水平以及24、48、72 h的細(xì)胞增殖抑制率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞中miR-15b表達(dá)水平和細(xì)胞增殖抑制率比較

2.3miR-15b對K562/A02細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組、miR-NC組、miR-15b組K562/A02細(xì)胞凋亡率分別為(13.64±2.12)%、(11.58±1.48)%、(23.05±2.85)%，各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=68.182,P<0.001)。miR-15b組K562/A02細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組和miR-NC組(P<0.05)，而miR-NC組與對照組K562/A02細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

Annexin V-FITC：膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素；PI：碘化丙啶；1a：對照組；1b：miR-NC組；1c：miR-15b組

2.4miR-15b對K562/A02細(xì)胞阿霉素耐藥性的影響 各組不同劑量阿霉素作用下細(xì)胞增殖抑制率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，miR-15b組K562/A02細(xì)胞增殖抑制率明顯高于對照組及miR-NC組(P<0.05)，而miR-NC組與對照組K562/A02細(xì)胞增殖抑制率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。對照組、miR-NC組、miR-15b組K562/A02細(xì)胞對阿霉素的IC50值分別為[(5.07±0.50) mg/mL]、[(5.22±0.48) mg/mL]、[(1.81±0.26) mg/mL]，各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=60.980,P<0.001)，miR-NC組與對照組K562/A02細(xì)胞對阿霉素的IC50值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；miR-15b組K562/A02細(xì)胞對阿霉素的IC50值明顯低于對照組及miR-NC組(P<0.05)，其相對于對照組和miR-NC組的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.70倍和2.88倍。

表3 各組不同劑量阿霉素作用下K562/A02細(xì)胞增殖抑制率比較

2.5miR-15b可靶向結(jié)合ABCC5 通過生物信息學(xué)軟件microRNA.org和miRcode預(yù)測發(fā)現(xiàn)，ABCC5可能是miR-15b的潛在靶基因。各組細(xì)胞熒光素酶活性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),miR-15b+ABCC5-WT組細(xì)胞熒光素酶活性明顯低于miR-NC+ABCC5-WT組(P<0.05)；miR-NC+ABCC5-WT組與miR-NC+ABCC5-MUT組和miR-15b+ABCC5-MUT組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；且miR-NC+ABCC5-MUT組與miR-15b+ABCC5-MUT組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表4。

miR：微RNA；ABCC5：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白C5

表4 各組細(xì)胞熒光素酶活性比較

2.6miR-15b對K562/A02細(xì)胞中ABCC5蛋白和mRNA表達(dá)的影響 各組細(xì)胞中ABCC5蛋白和mRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，miR-NC組與對照組細(xì)胞中ABCC5蛋白和mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；miR-15b組細(xì)胞中ABCC5蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯低于對照組和miR-NC組(P<0.05)。見圖3和表5。

miR：微RNA；ABCC5：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白C5

表5 各組細(xì)胞中ABCC5蛋白和mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

白血病作為一類血液癌癥，由于白血病細(xì)胞的過度增殖導(dǎo)致正常造血細(xì)胞功能及排出異常，進(jìn)一步導(dǎo)致血小板減少、免疫缺陷等癥狀，嚴(yán)重威脅患者的生命健康安全。由于治療耐藥性的產(chǎn)生影響患者的治愈率，深入研究白血病耐藥形成的機制并尋找有效逆轉(zhuǎn)耐藥靶點的方法具有重要意義[10-11]。miRNA是一類長約22個核苷酸且不具有編碼功能的內(nèi)源性短鏈RNA，通過與靶基因mRNA互補配對結(jié)合使mRNA降解或翻譯受阻，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)，從而參與調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與白血病等腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2,12-14]。鄧益民等[2]報道指出，miR-125b在阿霉素耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而其表達(dá)下調(diào)可逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對阿霉素的耐藥性。miR-15b是miRNA的一員，定位于3q25.33染色體上，有研究指出，miR-15b在口腔鱗癌組織中表達(dá)顯著降低，其表達(dá)上調(diào)有抑癌作用[15]。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b可通過靶向調(diào)控三重基序蛋白14抑制口腔鱗癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性。本研究結(jié)果顯示，miR-15b在白血病阿霉素耐藥細(xì)胞株K562/A02中呈低表達(dá)，提示miR-15b可能在白血病阿霉素耐藥形成過程中發(fā)揮重要作用；miR-15b過表達(dá)后，K562/A02細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞凋亡率均顯著升高，表明miR-15b具有抑制白血病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，提示miR-15b在白血病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的作用；以不同濃度阿霉素處理后，miR-15b過表達(dá)可提高K562/A02細(xì)胞對阿霉素的敏感性，提示miR-15b有逆轉(zhuǎn)白血病阿霉素耐藥的潛能。上述結(jié)果表明，miR-15b過表達(dá)可抑制K562/A02細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡及阿霉素敏感性，miR-15b有作為白血病耐藥性治療靶點的潛能。

ABCC5又稱多藥耐藥相關(guān)蛋白5，是體內(nèi)廣泛分布的ABCC蛋白轉(zhuǎn)運體家族成員，在外源性藥物從細(xì)胞向外轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用，與腫瘤耐藥密切相關(guān)[17]。楊尚霖等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ABCC5與人肝癌細(xì)胞的多藥耐藥性相關(guān)，沉默其表達(dá)不僅可以促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，還可以增強細(xì)胞對阿霉素、5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑藥物的敏感性。Dharmapuri等[19]研究發(fā)現(xiàn)，ABCC5與白血病伊馬替尼耐藥有關(guān)，而抑制ABCC5表達(dá)是塞來昔布增強白血病細(xì)胞對伊馬替尼敏感的重要機制；陳霽暉等[20]指出，ABCC5與白血病阿霉素耐藥密切相關(guān)，其在阿霉素耐藥白血病K562細(xì)胞中呈高表達(dá)。本研究雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，miR-15b可與ABCC5靶向結(jié)合；上調(diào)miR-15b表達(dá)后ABCC5 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明ABCC5是miR-15b的靶基因，miR-15b可負(fù)向調(diào)控ABCC5的表達(dá)，且miR-15b可能通過靶向調(diào)控ABCC5抑制K562/A02細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡并逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞對阿霉素耐藥，為白血病化療耐藥性作用機制的研究及新的耐藥靶點研究提供了參考依據(jù)。但本研究僅從細(xì)胞水平上初步闡述了miR-15b與白血病阿霉素耐藥的關(guān)系，后期將從體內(nèi)動物實驗進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-15b可抑制K562/A02增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡并降低細(xì)胞對阿霉素耐藥性，其作用機制可能與靶向抑制ABCC5有關(guān)。