病毒異戊二烯化修飾及生物學(xué)功能研究進(jìn)展

王 俊，吳海燕，宋影影，劉英楠，陳鴻軍

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

1 概述

蛋白質(zhì)異戊二烯化修飾是將15個(gè)碳原子的法尼基（C15H25）或20個(gè)碳原子的香葉基（C15H23）不可逆地共價(jià)連接到蛋白質(zhì)的C基末端半胱氨酸上的一種翻譯后修飾[1]。被修飾的蛋白質(zhì)其C基末端都含有一個(gè)保守的CAAX模體，其中C為半胱氨酸，A為疏水性氨基酸，X為任意氨基酸。最近研究證明：C基末端含有延伸的CXXXX和縮短的CXX模體的蛋白也可能是非經(jīng)典的異戊二烯化修飾酶的底物[2-3]。一般而言，連接異戊烯基的蛋白，其羧基端的CAAX結(jié)構(gòu)中的AAX可以被CAAX蛋白內(nèi)切酶切割，隨后羧基被甲基化修飾（GGTase-2修飾的蛋白不被切割和甲基化）。甲羥戊酸途徑和蛋白質(zhì)異戊二烯化修飾通路如圖1所示。

圖1 甲羥戊酸途徑和蛋白質(zhì)異戊二烯化修飾通路Fig.1 Mevalonate pathway and protein prenylation

蛋白質(zhì)的異戊二烯化修飾分別由相應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶FTase和GGTase（GGTase-1、GGTase-2和GGTase3）催化完成[4]。FTase和GGTase-1均為異二聚體，由α亞基和β亞基構(gòu)成，α亞基由同一個(gè)基因FNTA編碼，β亞基分別由FNTB和PGGT1B編碼。這兩種酶識(shí)別C末端含有CAAX基序的蛋白質(zhì)，其中C為半胱氨酸，A為脂肪族氨基酸，X為任意氨基酸。X殘基決定了底物蛋白質(zhì)被法尼基化還是香葉基化。當(dāng)X為絲氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生法尼基化。當(dāng)X為亮氨酸或異亮氨酸時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生香葉基化。究竟發(fā)生哪種修飾，并不是絕對(duì)的。例如：當(dāng)X為苯丙氨酸時(shí)，蛋白質(zhì)既能發(fā)生法尼基化，也能發(fā)生香葉基化。當(dāng)某種異戊二烯含量有限時(shí)，兩種修飾也可能發(fā)生互換。例如：當(dāng)用FTI抑制FTase時(shí)，K-Ras蛋白可以發(fā)生香葉基化修飾。

發(fā)生典型法尼基化修飾后的蛋白質(zhì)包括許多Ras小G蛋白家族成員（H-Ras、K-Ras、N-Ras、Ras2、Rap2、RhoB、RhoE、Rheb、TC10、TC21）、核纖層蛋白LaminA和LaminB。動(dòng)粒蛋白CENP-E和CENP-F、cGMP磷酸二酯酶α、G蛋白的γ亞基變體、DnaJ熱休克蛋白同源物、視紫紅質(zhì)激酶和過(guò)氧化物酶體膜蛋白Pex19和PxF等，GGTase-1修飾的蛋白質(zhì)底物主要是一些小G蛋白（Rac1、Rac2、RalA、Rap1A、Rap1B、RhoA、RhoB、RhoC、Cdc42、Rab8、Rab11、Rab13等）、G蛋白γ亞基變體、cGMP磷酸二酯酶β和植物的鈣調(diào)蛋白CaM53等[5]。目前已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)、真菌、病毒、原生動(dòng)物等編碼的蛋白質(zhì)都可以發(fā)生異戊二烯化修飾[6]，但蛋白質(zhì)異戊烯基修飾在病毒中鮮有報(bào)道。

2 異戊二烯化修飾與病毒

本文從Uniprot-KB數(shù)據(jù)庫(kù)、病毒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、流感病毒數(shù)據(jù)庫(kù)、非洲豬瘟病毒數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了人類(lèi)和動(dòng)物相關(guān)病毒蛋白序列，將這些蛋白按不同的病毒科分類(lèi)分別輸入異戊二烯化算法預(yù)測(cè)服務(wù)器網(wǎng)站PrePS（https://mendel.imp.ac.at/PrePS/）進(jìn)行預(yù)測(cè)[7]，結(jié)果如下表1。

表1 人類(lèi)和動(dòng)物相關(guān)病毒蛋白異戊二烯化修飾預(yù)測(cè)Table 1 Prenylation prediction of human and animal viral proteins

（續(xù)上表）

由于研究技術(shù)方法的限制，目前已經(jīng)鑒定的異戊二烯化修飾病毒蛋白較少。早期研究人員通過(guò)放射性標(biāo)記和脂質(zhì)抗體檢測(cè)技術(shù)證明了丁型肝炎病毒大抗原蛋白HDAg[8]和偽狂犬病病毒US2蛋白[9]是異戊二烯化修飾蛋白。通過(guò)應(yīng)用甲羥戊酸合成酶抑制劑他汀，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)膽固醇合成通路和中間代謝產(chǎn)物異戊二烯基對(duì)病毒至關(guān)重要。但大多數(shù)研究人員認(rèn)為，病毒對(duì)異戊二烯化的依賴(lài)是其通過(guò)修飾宿主蛋白影響病毒生存。

與之不同的是，本文預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)有16個(gè)科的人和動(dòng)物相關(guān)病毒蛋白具有很高的置信度可能發(fā)生異戊二烯化修飾，尤其是腺病毒科、嗜肝DNA病毒科、皰疹病毒科、巨大病毒擬菌病毒科、虹彩病毒科、痘病毒科和逆轉(zhuǎn)錄病毒科的多種病毒蛋白可能發(fā)生異戊二烯化修飾，其中又以大基因組病毒最多。本文結(jié)合已有的對(duì)病毒與異戊二烯化修飾的知識(shí)和預(yù)測(cè)的病毒蛋白修飾結(jié)果，重點(diǎn)對(duì)與人類(lèi)健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)密切相關(guān)的幾種病毒和異戊二烯化修飾的關(guān)系進(jìn)行介紹。

2.1 偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）偽狂犬病病毒編碼的衣殼蛋白US2不含跨膜區(qū)和定位信號(hào)，但在感染細(xì)胞中卻定位于細(xì)胞質(zhì)膜和胞質(zhì)囊泡表面。Amanda等[9]證明了PRV US2蛋白的C末端可以發(fā)生異戊二烯化修飾，進(jìn)而通過(guò)與Tubulin結(jié)合被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)膜上，該修飾對(duì)其亞細(xì)胞定位是必需的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在成熟的病毒粒子中US2蛋白是非異戊二烯化修飾的，提示非修飾的US2蛋白在PRV感染過(guò)程中結(jié)合微管蛋白輔助病毒粒子脫殼并進(jìn)一步幫助其他衣殼蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，而異戊稀基修飾的US2蛋白則發(fā)揮不同的功能。本文預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，牛皰疹病毒US2蛋白也可能發(fā)生異戊二烯化修飾，但其可能是不同于PRV US2的法尼基化，而是偏好亮氨酸的香葉基化修飾。

2.2 非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）早期研究發(fā)現(xiàn)，異戊烯基修飾抑制劑能夠有效抑制ASFV的入侵、復(fù)制和釋放。Quetglas等[16]用異戊烯基抑制劑處理巨噬細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)ASFV入侵效率降低，病毒在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制減少，病毒粒子形態(tài)發(fā)生受到抑制，大量囊膜前體和未成熟病毒粒子聚集在細(xì)胞膜周?chē)?，病毒工廠(chǎng)大小減小。研究人員認(rèn)為，異戊烯基化通過(guò)影響宿主細(xì)胞小GTPase的異戊二烯化修飾，從而對(duì)病毒的生命周期產(chǎn)生影響。有趣的是，ASFV編碼B318L是反式香葉基焦磷酸合成酶，能夠催化合成GGPP和長(zhǎng)鏈異戊稀基底物[17]。并且，在ASFV感染的細(xì)胞中GGPP升高25倍[18]。該基因?qū)SFV在豬原代巨噬細(xì)胞中的復(fù)制是必需的。目前尚無(wú)研究證實(shí)ASFV蛋白能夠被異戊烯基化修飾，本文預(yù)測(cè)到ASFV編碼L83L和I9R等病毒蛋白可能是異戊二烯化底物蛋白。而B(niǎo)318L可能是通過(guò)合成GGPP底物促進(jìn)宿主或病毒蛋白的異戊二烯化修飾，從而影響病毒粒子的組裝、成熟和釋放。

2.3 丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）研究表明，HCV的有效復(fù)制依賴(lài)于宿主蛋白FBXL2（F-box蛋白，SCF復(fù)合物組成部分之一）的香葉基化修飾。HCV蛋白NS5A能特異性地和香葉基化修飾的FBXL2發(fā)生相互作用，且與IP3R3形成三重復(fù)合物，從而使IP3R3靶向泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，抑制IP3R3介導(dǎo)的Ca2+釋放和其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，最終促進(jìn)HCV的復(fù)制[19]。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)2～6型HCV的NS5A蛋白C末端是CSMS，可能發(fā)生法尼基化修飾（FT值為-1.727，p值為5.1e-02）。NS5A還能和Viperin相互作用，該作用發(fā)生在脂滴表面和復(fù)制復(fù)合體，并且依賴(lài)于NS5A的N末端兩親性螺旋和C末端[20-21]，表明法尼基化修飾可能在其中發(fā)揮重要作用。

2.4 丁型肝炎病毒（Hepatitis delta virus，HDV）Glenn等[8]首先鑒定到HDV的 大抗原蛋白HDAg羧基末端CPRQ基序能夠發(fā)生異戊二烯化修飾，進(jìn)而促進(jìn)HDAg與HBsAg結(jié)合和病毒粒子的組裝[10-11]。研究表明，CPRQ基序的法尼基化修飾對(duì)其核定位、抑制RNA復(fù)制和病毒粒子的組裝是必需的[12]。法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑Lonafranib能夠顯著抑制HDV的組裝[13-14]。目前，Lonafranib已經(jīng)在120多名HDV患者中服用，并且正在進(jìn)行三期臨床試驗(yàn)[15]。值得注意的是，Lonafranib已被美國(guó)食品及藥物管理局和歐洲藥品管理局指定為治療早衰癥的孤兒藥。

2.5 小鼠白血病病毒（Murine leukemia virus，MuLV）盡管沒(méi)有預(yù)測(cè)到MuLV編碼蛋白可以發(fā)生異戊二烯化修飾，但Overmeyer等[22]研究發(fā)現(xiàn)他汀能夠通過(guò)抑制Rab1p和Rab6p的香葉基化修飾，抑制了細(xì)胞蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，使得MuLV前體囊膜糖蛋白gPr90env不能遷移到高爾基體進(jìn)行酶解加工，最終抑制了病毒粒子的組裝。

2.6 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）研究表明，他汀能夠通過(guò)上調(diào)CD4+T淋巴細(xì)胞中細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶抑制因子p21抑制HIV的感染和復(fù)制[23]。他汀也能夠抑制HIV-1潛伏感染的U1細(xì)胞釋放病毒粒子，該作用與他汀抑制了膽固醇的合成無(wú)關(guān)，而是通過(guò)抑制蛋白質(zhì)香葉基化修飾[24]。當(dāng)回補(bǔ)GGPP時(shí)，能夠逆轉(zhuǎn)他汀對(duì)HIV-1釋放的抑制作用。有趣的是，盡管小GTPase對(duì)HIV的復(fù)制很重要，然而，預(yù)測(cè)到HIV編碼的Nef蛋白可能發(fā)生異戊二烯化修飾。推測(cè)異戊二烯化修飾通過(guò)促進(jìn)Nef蛋白靶向反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)劫持多種細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控因子，從而減少細(xì)胞膜表面的MHC-1類(lèi)分子[25]，利于病毒的感染和生存。值得注意的是，HIV-1的前體囊膜糖蛋白gp160和MuLV的囊膜糖蛋白具有相似的切割位點(diǎn)，并且也依賴(lài)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體上進(jìn)行切割成熟[22]。因此，推測(cè)香葉基化修飾可能通過(guò)作用于Rab蛋白促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)并最終促進(jìn)HIV-1的囊膜糖蛋白的酶解成熟。

2.7 γ皰疹病毒（Murine gammaherpesvirus 68，MHV68）盡管尚無(wú)證據(jù)表明γ皰疹病毒編碼相關(guān)蛋白能夠發(fā)生異戊二烯化修飾，但Lange等[26]發(fā)現(xiàn)MHV68的復(fù)制需要膽固醇代謝的中間產(chǎn)物對(duì)宿主蛋白進(jìn)行異戊二烯化修飾，進(jìn)而促進(jìn)病毒復(fù)制。利用他汀抑制膽固醇合成途徑及其中間代謝產(chǎn)物異戊二稀基的產(chǎn)生，能夠呈顯著抑制MHV68在原代巨噬細(xì)胞中的復(fù)制和在腹膜腔滲出細(xì)胞中的激活。

2.8 巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）Potena等[27]研究發(fā)現(xiàn)氟伐他汀能夠顯著抑制CMV在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的復(fù)制、成熟病毒粒子的產(chǎn)生、抗原基因的表達(dá)和病毒DNA的合成。有趣的是，CMV的復(fù)制依賴(lài)于NF-κB信號(hào)通路，而他汀能夠有效阻斷CMV誘導(dǎo)的NF-κB的激活。有意思的是，用PrePS程序預(yù)測(cè)到CMV編碼的IRL9蛋白極有可能發(fā)生法尼基化修飾（FT值為0.187，p值為4.7e-03）。IRL9蛋白目前功能未知，因此，猜測(cè)他汀可能通過(guò)抑制該蛋白的法尼基化修飾，最終抑制了NF-κB信號(hào)通路和CMV復(fù)制。

2.9 腺病毒E1A蛋白大量研究表明，腺病毒E1A蛋白通過(guò)其N(xiāo)末端CR結(jié)構(gòu)域與p300和Rb等細(xì)胞蛋白結(jié)合發(fā)揮細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能，而其C末端則通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄共抑制因子CtBP抑制了E1A蛋白N末端的轉(zhuǎn)化活性[28]。E1A蛋白C末端異戊二烯化修飾可能通過(guò)促進(jìn)其膜定位增強(qiáng)與CtBP的結(jié)合，從而限制E1A蛋白的致癌活性。有趣的是，在較古老的腺病毒中E1A蛋白并不能發(fā)生異戊二烯化修飾[29]，提示腺病毒的異戊二烯化修飾可能是其進(jìn)化過(guò)程中新出現(xiàn)的事件。

3 總結(jié)和展望

異戊二烯化作為一種通過(guò)共價(jià)連接異戊二烯基團(tuán)到蛋白質(zhì)上，從而將其靶向到細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上的翻譯后修飾，其不僅在細(xì)胞的正常生命活動(dòng)的多個(gè)過(guò)程匯總發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時(shí)也影響了病毒生命周期的多個(gè)過(guò)程。雖然目前僅有丁型肝炎病毒HDAg和偽狂犬病病毒US2蛋白被證明可以發(fā)生異戊二烯化修飾，但預(yù)測(cè)仍有很多威脅人類(lèi)公眾衛(wèi)生和健康的病毒以及危害家禽養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)的動(dòng)物病毒編碼較多蛋白可能發(fā)生異戊二烯化修飾。

令人振奮的是，針對(duì)HDAg法尼基化的抑制劑Lonafranib對(duì)HDV患者具有較好的治療效果。這提示可通過(guò)藥物干預(yù)病毒蛋白的脂質(zhì)修飾來(lái)防控動(dòng)物傳染病，或可能通過(guò)針對(duì)相關(guān)修飾蛋白上的基序突變開(kāi)發(fā)新型減毒活疫苗等。因此，仍需進(jìn)一步探究病毒蛋白的異戊二烯化修飾及在病毒各個(gè)生命周期過(guò)程中發(fā)揮的生物學(xué)作用。