燈盞花素對(duì)血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)病理改變及Nrf2/HO-1通路的影響

房娉平，闞敏宸，郭立靜，孫 濤，劉文杰，霍浩然

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由一系列腦血管疾病導(dǎo)致的一種嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙綜合征，約占癡呆病人的20%，是僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆類(lèi)型，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量[1]。海馬CA1區(qū)是大腦認(rèn)知功能腦區(qū)，腦缺血或長(zhǎng)期血流低灌注所致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷是VD的病理基礎(chǔ)[2-3]。病理生理學(xué)研究顯示，腦組織缺血缺氧所致氧化應(yīng)激反應(yīng)在VD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。

隨著國(guó)家振興中醫(yī)藥戰(zhàn)略的實(shí)施及中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的深入，中藥治療VD逐漸得到醫(yī)患的關(guān)注與認(rèn)可。燈盞花屬菊科多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥品種，性溫、味辛，具有發(fā)表散寒、消炎止痛之功效，目前臨床多用于心腦血管疾病的治療[6]。燈盞花素(Breviscapine，Bre)是中藥燈盞花的主要活性成分，具有良好的抗氧化活性[7]。核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1(Nrf2/HO-1)通路在機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[8]。本研究探討B(tài)re對(duì)VD大鼠海馬CA1區(qū)病理學(xué)改變及Nrf2/HO-1通路的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠180只，8周齡，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部[SYXK(冀)2018-004]，合格證號(hào)：20191204011。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d[光照/黑暗12 h交替、溫度(25±1)℃、相對(duì)濕度(60±10)%]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 燈盞花素注射液購(gòu)自石藥銀湖制藥有限公司；尼莫地平注射液(nimodipine，NMP)購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)試劑盒、TriQuick Reagent總RNA提取試劑盒和丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物(GSH-Px)試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒購(gòu)自上海novoprotein公司；Nrf2、HO-1、β-actin抗體和IgG二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組、造模與給藥 將180只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、Bre低劑量組(1mg/kg)、Bre中劑量組(2mg/kg)、Bre高劑量組(4 mg/kg)和NMP組(2 mg/kg)，每組30只。參考文獻(xiàn)[9]報(bào)道的方法，術(shù)前12 h禁食、自由飲水，采用鈍性分離并結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈復(fù)制VD大鼠模型；假手術(shù)組分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎。造模完成后，Bre各劑量組和NMP組均每日1次腹腔注射相應(yīng)劑量藥物，假手術(shù)組和模型組每日1次腹腔注射生理鹽水，療程均為14 d[10]。

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)評(píng)學(xué)習(xí)記憶能力 將平臺(tái)固定于第3象限，水溫設(shè)置為(25±1)℃。治療完成后，隨機(jī)取各組10只大鼠，適應(yīng)性訓(xùn)練3 d并誘導(dǎo)大鼠找到位于第3象限平臺(tái)。①定位航行實(shí)驗(yàn)：將每只大鼠分別從第1象限、第2象限、第4象限固定入水點(diǎn)頭朝器壁方向放入水中，記錄找到平臺(tái)的時(shí)間(120 s內(nèi)未找到平臺(tái)則按120 s計(jì)算)，取平均值，即逃避潛伏期；②空間探索實(shí)驗(yàn)：撤除第3象限平臺(tái)，于第1象限固定點(diǎn)頭朝器壁方向放入水中，記錄120 s時(shí)間內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)。逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)分別代表認(rèn)知能力中的學(xué)習(xí)能力和記憶能力。

1.3.3 海馬區(qū)組織病理學(xué)檢查和海馬神經(jīng)元凋亡狀況觀察 麻醉后脊椎脫臼處死，斷頭取腦并去除小腦、腦干后，置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，梯度乙醇脫水和二甲苯透明后行石蠟包埋、4 μm厚度切片，梯度乙醇脫蠟水化。①行常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹(shù)膠封片后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察海馬區(qū)組織病理學(xué)改變；②參照TUNEL試劑盒說(shuō)明進(jìn)行處理，50%甘油封片后觀察神經(jīng)元凋亡狀況；凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)計(jì)算：每只大鼠分別取10張TUNEL染色切片，觀察顯微鏡下細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3.4 電子顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu) 隨機(jī)取各組10只大鼠，麻醉后開(kāi)胸暴露心臟，由“左心室-右心耳”通路依次灌注300 mL生理鹽水和4%多聚甲醛溶液300 mL，斷頭取腦并剝離海馬體，切割成1 mm3后置于4 ℃濃度3%戊二醛溶液中固定2 h，梯度乙醇脫水、還氧丙烷置換、環(huán)氧樹(shù)脂Epon812浸透、包埋、60 nm超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，采用電子顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。

1.3.5 生化分子法檢測(cè)海馬組織MDA含量和SOD、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性 取各組剩余的10只大鼠，麻醉后脊椎脫臼處死、斷頭取腦并剝?nèi)『ｑR組織，稱(chēng)量左側(cè)海馬組織并加入9倍量4 ℃裂解液后研磨勻漿，4 ℃離心(離心半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，時(shí)間5 min)后取上清液，按照試劑盒說(shuō)明，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量，分別采用黃嘌呤氧化法、鉬酸銨法檢測(cè)SOD、CAT活性。

1.3.6 免疫印跡法(Western Blotting)檢測(cè)海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá) 取海馬組織勻漿液，4 ℃行兩次離心(6 000 r/min、離心10 min，取上清液；12 000 r/min、離心30 min，取沉淀)，Bradford法測(cè)定總蛋白含量，95 ℃水浴使蛋白變性，以30 μg蛋白量上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜、5%脫脂牛奶室溫封閉1 h、滴加目標(biāo)蛋白和β-actin一抗4 ℃孵育過(guò)夜、洗膜后滴加IgG二抗室溫孵育2 h，滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色并采用凝膠成像儀形成條帶；通過(guò)條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)海馬組織Nrf2mRNA、HO-1mRNA表達(dá) 取右側(cè)海馬組織頭部0.1 g，采用TriQuick Reagent總RNA提取試劑盒分離純化總RNA，通過(guò)核酸分析儀檢測(cè)RNA濃度和純度后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照RT-PCR試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，設(shè)置RT-PCR程序?yàn)?4 ℃反應(yīng)30 s、60 ℃反應(yīng)30 s、72 ℃反應(yīng)60 s，共40個(gè)循環(huán)，凝膠分析儀成像。以β-actin為內(nèi)參，目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。Nrf2、HO-1、β-actin的RT-PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 與假手術(shù)組比較，模型組逃逸潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.01)；與模型組比較，Bre中劑量組、Bre高劑量組和NMP組逃逸潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加(P<0.01)；與NMP組比較，Bre高劑量組逃逸潛伏期縮短，(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)增加(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較(±s)

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)改變 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常(圓形或橢圓形)，結(jié)構(gòu)完整，排列整齊、層次清晰，核膜核仁邊界清晰。模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，排列紊亂、層次減少，胞體呈三角形或多邊形，核膜、核仁邊界不清，胞核固縮深染等病理學(xué)改變，病理分級(jí)明顯提高。與模型組比較，Bre各劑量組和NMP組海馬CA1區(qū)病理學(xué)改變呈不同程度減輕，病理分級(jí)明顯降低。其中Bre高劑量組神經(jīng)元排列較為整齊、層次清晰、形態(tài)較正常、結(jié)構(gòu)較完整。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)組織病理學(xué)改變(HE，×200)

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu) 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞膜、核膜完整，染色質(zhì)分布均勻，線粒體結(jié)構(gòu)清晰；模型組神經(jīng)元胞膜腫脹破裂，胞核形態(tài)異常，核仁邊界不清，染色質(zhì)固縮，異染色質(zhì)增多，線粒體腫脹、分裂、嵴溶解消失等超微結(jié)構(gòu)病變；與模型組比較，Bre各劑量組和NMP組上述超微結(jié)構(gòu)病變不同程度減輕。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)(×10 000)

2.4 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)可見(jiàn)極少量的凋亡神經(jīng)元；與假手術(shù)組比較，模型組凋亡神經(jīng)元明顯增多，AI升高[(47.26±7.94)%與(3.50±0.61)%，P<0.01]；與模型組比較，Bre各劑量組和NMP組凋亡神經(jīng)元不同程度減少，Bre中劑量組、Bre高劑量組和NMP組AI降低[(22.39±4.85)%、(14.18±2.90)%、(17.45±3.11)%和(47.26±7.94)%，P<0.01]；與NMP組比較，Bre高劑量組AI降低[(14.18±2.90)%和(17.45±3.11)%，P<0.05]。詳見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡狀況(TUNEL，×200)

2.5 各組大鼠海馬組織MDA含量和SOD、CAT活性比較 與假手術(shù)組比較，模型組海馬組織MDA含量升高，SOD、CAT活性降低(P<0.01)；與模型組比較，Bre中劑量組、Bre高劑量組和NMP組MDA含量降低，SOD、CAT活性升高(P<0.01)；與NMP組比較，Bre高劑量組MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠海馬組織MDA含量和SOD、CAT活性比較(±s)

2.6 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，Bre中劑量組、Bre高劑量組和NMP組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與NMP組比較，Bre高劑量組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)升高(P<0.01)。詳見(jiàn)圖4、表4。

圖4 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)電泳圖

表4 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較(±s)

2.7 各組大鼠海馬組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，Bre中劑量組、Bre高劑量組和NMP組Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與NMP組比較，Bre高劑量組Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)。詳見(jiàn)圖5、表5。

圖5 各組大鼠海馬組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)電泳圖

表5 各組大鼠海馬組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)比較(±s)

3 討 論

隨著人口老齡化加劇，腦血管疾病發(fā)病率升高，VD患病人數(shù)逐年增加，嚴(yán)重影響老年人生命健康和生活質(zhì)量。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腦血流低灌注引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織損傷進(jìn)行性加重是VD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制[11]。大腦海馬CA1區(qū)與認(rèn)知功能密切相關(guān)，也是對(duì)缺血缺氧敏感的腦區(qū)，因此，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)為靶點(diǎn)，尋找保護(hù)CA1區(qū)的新型藥物對(duì)改善VD預(yù)后具有重要的臨床意義。

Bre是中藥燈盞花的主要活性成分，具有良好的抗氧化活性。謝雄根等[10]研究顯示，Bre具有改善VD大鼠認(rèn)知功能的作用，但其機(jī)制尚不明確。本研究采用國(guó)際認(rèn)可的雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎法制備VD大鼠模型，腹腔注射燈盞花素進(jìn)行治療并以臨床治療VD一線用藥尼莫地平為陽(yáng)性對(duì)照藥物，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)Bre治療14 d后，VD大鼠逃逸潛伏期縮短且穿越平臺(tái)次數(shù)提高；且經(jīng)Bre治療14 d后，能明顯改善海馬CA1區(qū)組織病變并降低病理分級(jí)，改善海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)病變和神經(jīng)元凋亡狀況，且Bre高劑量組優(yōu)于NMP組，提示Bre對(duì)VD大鼠海馬CA1區(qū)病理改變及學(xué)習(xí)記憶能力具有保護(hù)作用。VD多繼發(fā)于腦卒中等腦血管疾病，血流持續(xù)低灌注使線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)茏鑼?dǎo)致氧自由基(ROS)大量生成，以ROS為底物的SOD、CAT等抗氧化酶被過(guò)度消耗，致使ROS不能被還原代謝而蓄積，破壞核酸、DNA、蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子結(jié)構(gòu)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]；ROS攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化生成MDA[12]；進(jìn)而導(dǎo)致VD發(fā)生后海馬CA1區(qū)病變持續(xù)加重。

Nrf2是體內(nèi)細(xì)胞普遍存在的一種核轉(zhuǎn)錄因子，Deshmukh等[13]研究顯示，Nrf2可誘導(dǎo)抗氧化酶轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而對(duì)機(jī)體的機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)起到重要的調(diào)控作用。HO-1是Nrf2下游基因，氧化應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2被激活入核后將啟動(dòng)HO-1轉(zhuǎn)錄表達(dá)而催化降解血紅素、一氧化氮等，抑制氧化應(yīng)激損傷[14-15]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)燈盞花素治療14 d后，能顯著降低VD大鼠海馬區(qū)組織MDA含量并提高SOD、CAT活性，明顯上調(diào)Nrf2、HO-1 蛋白和mRNA表達(dá)，提示Bre具有抑制VD大鼠海馬區(qū)組織氧化應(yīng)激損傷的作用，可能與激活Nrf2/HO-1通路有關(guān)。

綜上所述，Bre對(duì)VD大鼠海馬CA1區(qū)病理改變和學(xué)習(xí)記憶能力具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1通路進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。VD的病理機(jī)制復(fù)雜，燈盞花素對(duì)VD的治療作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。