利用剪切波彈性成像技術(shù)評價大鼠非酒精性脂肪性肝病嚴(yán)重程度

周琴，呂國榮，，郭海欣，李靖云，張少波，陳永健

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，福建泉州362000；2.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)院，福建泉州362000；3.晉江市安海醫(yī)院超聲科，福建泉州362000

前言

剪切波彈性成像（Shear Wave Elastography，SWE）能實時定量檢測肝臟硬度，但目前利用SWE評估非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis,NASH）及其相關(guān)肝硬化的研究較少［1］。有研究表明非酒精性脂肪性肝?。∟onalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD）伴隨的多種生物分子改變可能會影響剪切波傳播［2］，但有關(guān)SWE 與NAFLD 相關(guān)分子改變的相關(guān)性鮮有報道。因此，本實驗利用SWE 研究NAFLD大鼠肝臟硬度的改變并進一步明確影響剪切波在NAFLD 肝臟傳播的相關(guān)生物分子，旨在為臨床無創(chuàng)性評估NASH及肝硬化提供參考。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及模型制備

選取雄性SD 大鼠88 只，質(zhì)量250～270 g。隨機選擇40 只作為對照組，其余為實驗組。實驗組按喂養(yǎng)方式不同隨機分為6 個亞組，每個亞組8 只（圖1）。高脂飼料（High-Fat Diet, HFD）：2%膽固醇+15%豬油+5%蛋黃粉+0.5%膽鹽+2%白糖+75.5%普通基礎(chǔ)顆粒飼料；動物和HFD 由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供；蛋氨酸/膽堿缺乏飼料（Methionine-Choline Deficient Diet,MCDD）由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。其中，40%四氯化碳（CCl4）溶液（CCl4：橄欖油=2：3），劑量為1.5 mL/kg，每周兩次。

圖1 實驗動物分組及模型制備Fig.1 Experimental animals grouping and model preparation

1.2 儀器和方法

采用法國聲科SuperSonic Imagine AixPlorer 型實時剪切波彈性成像超聲診斷儀，線陣探頭，頻率4～15 MHz。

（1）肝臟超聲檢查：分別于第1、2、3、8、12周末隨機抽取8只正常組大鼠，與預(yù)定喂養(yǎng)周期結(jié)束的實驗組大鼠進行檢測。檢查前所有實驗動物禁食12 h，禁水6 h。麻醉后肝區(qū)備皮，探頭輕置于大鼠腹部，先行常規(guī)超聲檢查并統(tǒng)一選取肝中葉啟用SWE 模式，盡量避開肝臟大血管、膽道和葉間裂的區(qū)域，于距離體表1.0 cm 處選擇感興趣區(qū)域（Region of Interest,ROI），ROI設(shè)定為直徑約2 mm 的圓形，開啟Q-BOX測量ROI的楊氏模量值，測量5次，取平均值，得到楊氏模量平均值Emean。

（2）病理學(xué)檢查及mRNA 檢測：超聲檢查完成后，解剖肝臟，取肝中葉（即SWE 檢查部位）固定于10%中性福爾馬林并包埋在石蠟中，切片行HE 染色、Masson 染色，光鏡下觀察肝臟組織學(xué)改變。另取一部分肝組織在液氮中快速凍存?？俁NA的提取依照Trizol（Invitrogen）的說明書進行。反轉(zhuǎn)錄依照試劑盒說明書進行。大鼠b-actin 作為內(nèi)參照，設(shè)計引物（表1）。利用RT-PCR 技術(shù)對樣品進行檢測，讀取熒光值。使用2-ΔΔCT方法計算樣本目標(biāo)基因的相對含量。

表1 RT-PCR的引物信息Tab.1 Primer information for RT-PCR

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

參考Kleiner 等［3］的方法，根據(jù)NAFLD 活動性評分（NAFLD Activity Score,NAS）及纖維化等級，將最終病理結(jié)果分為正常組（NAS=0,纖維化F0），單純脂肪變性組（NAS=1～2,纖維化F0），邊界組（NAS=3～4,纖維化F0），NASH 組（NAS≥5, 纖維化F0～F3），肝硬化組（纖維化F4）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件包對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用Spearman 相關(guān)分析法。應(yīng)用多元線性回歸模型對多種影響因素進行顯著性分析。以病理分級為金標(biāo)準(zhǔn)，利用接受者操作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲線建立NASH 及肝硬化的楊氏模量界值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果

對照組切片顯示所有大鼠肝臟均未發(fā)生病變；HFD-1W組中2只可納入正常組，4只納入單純脂肪變性組，2只納入邊界組；MCDD-2W組中單純脂肪變性組和邊界組各1只，余6只納入NASH組；HFD-3W組中2只納入邊界組，6只納入NASH組；MCDD-8W組和MCDD-12W組的所有大鼠均納入NASH組；MCDD-12W/CCl4組中2只評為NASH，6只具有肝硬化改變。

光鏡下正常組的肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，門管區(qū)未見炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞內(nèi)無明顯脂肪空泡，未見纖維間隔形成。隨著病程進展，實驗組逐漸出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)可見大小不等的脂肪空泡，部分肝細(xì)胞呈氣球樣變，小葉內(nèi)可見炎癥、壞死；嚴(yán)重者為肝索排列紊亂，肝竇間隙變窄，纖維間隔形成，可見假小葉形成（圖2）。

2.2 Emean與病理結(jié)果的相關(guān)性

所有大鼠肝臟Emean與NAFLD 嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)（r=0.838,P＜0.001）。NAFLD 不同病理分組間的Emean差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=113.58,P＜0.001）。NASH 組和肝硬化組Emean顯著高于正常組、單純性脂肪變性和臨界組（P＜0.001）。肝硬化組的Emean顯著高于NASH 組（P＜0.001）。在正常組、單純性脂肪變性組和臨界組之間，Emean沒有顯著差異（P＞0.05）。SWE測量見表2和圖2。

圖2 實驗組大鼠肝臟病理表現(xiàn)及SWE測量Fig.2 Pathological manifestations and SWE measurement of rat liver in experimental groups

2.3 Emean與mRNA表達水平的相關(guān)性

MCP-1（r=0.678,P＜0.001）、TNF- α（r=0.340,P=0.001）、I型膠原（r=0.402,P＜0.001）、α-SMA（r=0.561,P＜0.001）均與Emean呈正相關(guān)；且多元線性回歸分析顯示，MCP-1（B=0.560,P＜0.001）和I型膠原（B=0.429,P＜0.001）與Emean呈獨立相關(guān)。不同病理分組的Emean和mRNA表達水平見表2。

表2 不同病理分組的Emean和mRNA表達Tab.2 Emean and mRNA expression in different pathological groups

2.4 ROC曲線分析

SWE 診斷NASH、肝硬化的截值分別為6.0 kPa、9.7 kPa，曲線下面積分別為0.95、0.98，敏感性分別為88.9%、86.5%，特異性分別為100%、92.7%，見圖3。

圖3 SWE對大鼠NASH和肝硬化的診斷效能Fig.3 Diagnostic efficacy of SWE in NASH and liver cirrhosis

3 討論

NAFLD 的發(fā)病率逐年升高，已成為全球最常見的慢性肝?。?］。其疾病譜包括單純性脂肪變性、NASH、肝纖維化和肝硬化［5］。其中，NASH與肝纖維化密切相關(guān)，它是肝硬化和肝癌的顯著危險因素，在NASH相關(guān)的肝硬化患者中，肝癌的發(fā)病率至少為每年1%～2%［6］。目前，肝穿刺活檢仍是確診NASH 及肝硬化的金標(biāo)準(zhǔn)［7］，但其有創(chuàng)性和潛在的并發(fā)癥限制了其在臨床中的應(yīng)用［8］。因此，尋找能夠早期、無創(chuàng)識別NASH及肝硬化的非侵入性檢測手段尤為重要。

超聲彈性成像技術(shù)是一種可對組織硬度進行檢測和評估的新型超聲診斷技術(shù)［9］。其中，SWE是目前最新應(yīng)用于臨床的一種彈性成像技術(shù)。其原理是通過發(fā)射高速聚焦的聲輻射力脈沖在縱向不同深度上連續(xù)聚焦，使不同深度的組織幾乎同時產(chǎn)生橫向位移，通過“馬赫錐”原理，在聚焦部位而產(chǎn)生剪切波，隨后應(yīng)用顏色編碼技術(shù)實時顯示組織彈性圖［10］。本研究通過檢測實驗動物的Emean得出肝臟Emean，提示診斷NASH的最佳臨界點，即當(dāng)Emean≥6.0 kPa時，必須高度警惕NASH的可能性。Kang等［11］將NASH的Emean截值定為5.9 kPa，本實驗結(jié)果與之相近。此外，本實驗認(rèn)為，肝硬化的最佳截值可定為9.7 kPa，該結(jié)果與Deffieux等［12］提出的截值接近。

國內(nèi)外有眾多研究報道了SWE在評估慢性肝炎患者肝纖維化方面的高診斷性能［13-15］，但對評估NAFLD方面尚未得到充分驗證，且NAFLD脂肪變性程度對肝臟硬度是否產(chǎn)生影響仍存在爭議。Petta等［16］研究結(jié)果提示脂肪變性程度是肝臟硬度增高的獨立預(yù)測因子（P=0.03）；Guo等［17］認(rèn)為在不同嚴(yán)重程度的脂肪變性間肝臟硬度并未觀察到明顯的差異，即脂肪變性不影響肝臟硬度值；Rifai等［18］研究發(fā)現(xiàn)肝臟硬度與肝纖維化分級（P＜0.001）和炎癥活性（P＜0.05）相關(guān)，但肝臟脂肪變性對肝臟硬度的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究在對NAFLD大鼠肝臟病理改變進行分析時發(fā)現(xiàn)，NASH組和肝硬化組的肝臟硬度顯著高于正常、單純性脂肪變性和臨界組（P＜0.001），肝硬化組的肝臟硬度也顯著高于NASH組（P＜0.001），而正常組、單純性脂肪變性組和臨界組之間，肝臟硬度沒有顯著差異（P＞0.05）。由此推測，肝臟硬度可能與纖維化程度相關(guān)，而與脂肪變性無關(guān)。NAFLD初期，肝臟還未出現(xiàn)纖維化，肝臟硬度未發(fā)生明顯變化，隨著NAFLD發(fā)展，纖維化程度逐漸加重，肝臟硬度和病變程度呈正相關(guān)。

NAFLD 伴隨著許多生物分子變化，包括促炎和纖維化細(xì)胞因子的激活。據(jù)報道，MCP-1、TNF-α、I型膠原、α-SMA 的mRNA水平與NAFLD 的發(fā)病機制密切相關(guān)［19］。這些改變可能會影響超聲波和剪切波傳播，但對其影響較大的分子生物學(xué)指標(biāo)是哪些仍未知［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然MCP-1、TNF-α、I型膠原和α-SMA 這4 種mRNA 的表達均與NAFLD 嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，但MCP-1 和I型膠原的mRNA 表達與Emean呈獨立相關(guān)（P＜0.001）。MCP-1可趨化巨噬細(xì)胞進而引起肝臟炎癥浸潤，并激活肝星狀細(xì)胞導(dǎo)致I型膠原大量堆積，炎癥反應(yīng)和I型膠原沉積都促進了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［21］。由此推測，MCP-1 和I型膠原可能通過誘導(dǎo)肝纖維化進展從而影響剪切波傳播。