MTHFR和MTRR 基因多態(tài)性及增補葉酸與早產(chǎn)的相關(guān)性分析

陳雪 劉小暉 王興 周秉博 郝勝菊 鄭雷

早產(chǎn)是一類復(fù)雜性疾病，目前研究熱點仍然是鑒定新的易感基因和多態(tài)位點，從單個基因的易感性研究向基因通路或基因組的研究轉(zhuǎn)變，通過探索“基因-環(huán)境”交互作用闡明早產(chǎn)發(fā)病機制，而葉酸攝入與葉酸代謝酶基因多態(tài)性交互作用可能是導(dǎo)致早產(chǎn)的其中一個通路[1]。流行病學(xué)資料調(diào)查發(fā)現(xiàn)，葉酸攝入不足和低血清葉酸濃度會導(dǎo)致早產(chǎn)。國外人群研究表明，育齡婦女孕前1年補充葉酸可預(yù)防50%以上的重度早產(chǎn)[2]。亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase, MTRR)是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，參與同型半胱氨酸代謝。研究顯示，MTHFRC677T和MTRR基因多態(tài)性在早產(chǎn)中可能是通過促進“葉酸——高同型半胱氨酸血癥——甲基化”途徑來產(chǎn)生作用[3]，但目前小樣本量的流行病學(xué)研究MTHFR基因多態(tài)性和早產(chǎn)相關(guān)性的結(jié)果不一致[4-7]。

中國育齡婦女葉酸缺乏率較高，北方高于南方[8]。甘肅地處中國的西北，經(jīng)濟欠發(fā)達(dá)，蔬菜攝入量不足，育齡婦女葉酸攝入也不足。本研究采用病例-對照設(shè)計，研究孕產(chǎn)婦增補葉酸、易感基因MTHFR、MTRR多態(tài)性與早產(chǎn)的關(guān)系，初步探索基因環(huán)境交互作用與早產(chǎn)的關(guān)系，為開展預(yù)防工作、降低甘肅省早產(chǎn)發(fā)生率提供科學(xué)依據(jù)。

對象與方法

一、對象

本研究選取2017年5月—2018年8月在甘肅省婦幼保健院分娩早產(chǎn)兒的162例孕產(chǎn)婦作為病例組，按照1∶1比例選取同時期分娩正常孕周新生兒的孕產(chǎn)婦162例作為對照組，并采用問卷形式收集兩組流行病學(xué)及臨床資料。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～40歲、蘭州市居住一年以上、妊娠滿28周不足37周、自然發(fā)動宮縮或胎膜早破等引發(fā)早產(chǎn)患者，對于因妊娠高血壓疾病、糖尿病、妊娠期膽汁淤積等合并癥可能由于醫(yī)療干預(yù)導(dǎo)致早產(chǎn)的患者不納入病例組。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：足月分娩(巨大兒除外)孕婦、孕婦年齡相差不超過1歲、居住地類型(城市或農(nóng)村)一致、末次月經(jīng)相差不超過2周(避免因季節(jié)及空氣質(zhì)量對妊娠結(jié)局的影響)、無妊娠合并癥。排除雙胎和多胎、新生兒有先天性疾病患者。

二、方法

經(jīng)知情同意后，分別采集兩組新生兒母親靜脈血，提取全血中的 DNA，進行葉酸代謝相關(guān)基因檢測。

1.MTHFR和MTRR基因的檢測：采用熒光定量 PCR 反應(yīng)對MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G位點的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymor-phism，SNP)分型進行檢測。相關(guān)儀器試劑均購自美國 Applied Biosystems(ABI)公司產(chǎn)品。反應(yīng)所用Taqman-MGB 探針信息如表1所示。每個反應(yīng)的體系為總體積10 uL，包含濃度為20 ng/uL的DNA模板1 uL、2×Taqman Universal Master Mix 5 uL、20×Taqman-MGB探針0.5 uL，去離子水3.5 uL。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，隨后進行20個循環(huán)的擴增(92 ℃15 s，60 ℃ 1 min)，再進行 30 個循環(huán)的擴增(89 ℃15 s，60 ℃ 90 s)，之后 4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后在 ABI7900 型熒光定量 PCR 儀上讀取樣品孔中的終點熒光，利用其分析軟件確定各樣本的基因分型結(jié)果。對研究對象MTHFRA1298C、C677T和MTRRA66G位點進行測定。按照基因檢測結(jié)果，可將個體對葉酸利用能力風(fēng)險等級進行劃分，分成高度風(fēng)險、中度風(fēng)險、低度風(fēng)險及未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險共四個等級(見表2)。

表1 Taqman-MGB 探針?biāo)谖恢肨able 1 The location of Taqman-MGB Probe

表2 MTHFR和MTRR基因風(fēng)險等級評估表Table 2 The risk rating scale for MTHFR and MTRR genes

2.統(tǒng)計學(xué)處理：本研究采用雙錄入方法，應(yīng)用EpiData 3.1進行數(shù)據(jù)的錄入，Excel 2010及SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，各因素組間比較采用卡方檢驗，單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的因素納入多因素Logistic進行分析，α取0.05為檢驗水準(zhǔn)。

結(jié) 果

一、研究對象一般特征

本研究按照對照組與病例組納入標(biāo)準(zhǔn)，共納入新生兒324例，病例組162例，男96例，女66例，對照組162例，男91例，女71例。樣本MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G位點的數(shù)據(jù)分別通過Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，P>0.05，均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，證明研究樣本具有該區(qū)域群體代表性。其中，孕婦年齡、受教育程度、孕前BMI指數(shù)、孕期體重增加、文化程度等因素經(jīng)分析與早產(chǎn)無關(guān)。

二、早產(chǎn)相關(guān)因素的單因素分析

研究結(jié)果顯示，與漢族孕婦相比，少數(shù)民族孕婦為早產(chǎn)的危險因素，OR=2.28，說明少數(shù)民族婦女出生早產(chǎn)兒的概率較漢族婦女高；與城鎮(zhèn)婦女比較，農(nóng)村婦女是早產(chǎn)的危險因素，OR=2.99；與非蘭州市居住的婦女相比，蘭州市居住的孕婦是早產(chǎn)的危險因素，OR=2.18；與初次懷孕相比，懷孕3次以上是早產(chǎn)的危險因素，OR=1.77；與沒有妊高癥的孕婦相比，有妊高癥的婦女為早產(chǎn)的危險因素，OR=4.63；與自然懷孕的孕婦相比，采用輔助生殖技術(shù)受孕是早產(chǎn)的危險因素，OR=9.67；與沒有服用葉酸的孕婦相比，服用葉酸的孕婦是早產(chǎn)的保護性因素，OR=0.14；與孕期前3個月服用葉酸相比，孕期服用葉酸3～6個月與6個月以上是早產(chǎn)的保護性因素，OR值分別為0.12、0.25；與孕期沒有藥物服用史的孕婦相比，有藥物服用史的孕婦為早產(chǎn)的危險因素，OR=1.96。見表3。

表3 早產(chǎn)的單因素分析結(jié)果Table 3 Risk factors of preterm birth

續(xù)表3

三、早產(chǎn)相關(guān)因素的多因素Logistic回歸分析

以是否生育早產(chǎn)兒為因變量，以單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的10個因素為自變量，包括民族、戶籍、居住地、孕次、是否有妊高癥、是否輔助生殖技術(shù)、有無服用葉酸、孕前3個月服用葉酸、孕期服用葉酸3～6個月與6個月以上、孕期藥物服用史，應(yīng)用多因素logistic回歸進行分析。多因素logistic回歸結(jié)果顯示，農(nóng)村戶籍、蘭州本地居住、妊高癥、采用輔助生殖技術(shù)受孕4個因素為早產(chǎn)的危險因素；孕前3個月、孕期3～6個月和孕期6個月以上服用葉酸是早產(chǎn)的保護性因素。結(jié)果見表4。

表4 早產(chǎn)危險因素的多因素Logistic回歸結(jié)果Table 4 Multivariate logistic regression on risk factors of preterm birth

四、MTHFR 和MTRR基因多態(tài)性與孕期服用葉酸情況對早產(chǎn)的影響

根據(jù)基因風(fēng)險等級評估，分為未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險、低度風(fēng)險、中度風(fēng)險、高度風(fēng)險4組，應(yīng)用卡方檢驗對不同風(fēng)險組是否服用葉酸與早產(chǎn)的關(guān)系進行分析，結(jié)果顯示，在早產(chǎn)組中，各風(fēng)險組是否服用葉酸差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險組中，孕婦是否服用葉酸對早產(chǎn)結(jié)局無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在低風(fēng)險組中，孕婦是否服用葉酸對早產(chǎn)結(jié)局無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在中度風(fēng)險組中，孕婦是否服用葉酸對早產(chǎn)結(jié)局具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在高風(fēng)險組中，孕婦是否服用葉酸對早產(chǎn)結(jié)局也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表5 基因多態(tài)性與孕期服用葉酸情況對早產(chǎn)的影響 [例(%)]Table 5 Effects of gene polymorphism and folic acid supplementation during pregnancy on preterm delivery [n(%)]

討 論

一、早產(chǎn)相關(guān)影響因素分析

1.MTHFR和MTRR基因的影響：分子流行病學(xué)和遺傳學(xué)研究已經(jīng)對葉酸代謝通路中關(guān)鍵酶基因多態(tài)和出生缺陷的易感性進行了大量報道，其中MTHFRC677T和A1298C位點成為研究的熱點[9]。這兩個位點也被用來研究與早產(chǎn)易感性的關(guān)系，但是結(jié)論不一致。MTHFR和MTRR基因缺陷導(dǎo)致的葉酸利用能力下降成為尋找早產(chǎn)易感遺傳因素的熱點[10]。相關(guān)研究顯示[11]，TT基因型與葉酸代謝功能障礙有關(guān)，導(dǎo)致血漿中同型半胱氨酸含量增高，繼而導(dǎo)致機體生化功能的異常，從而導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)。也有研究提示MTHFR基因與MTRR基因多態(tài)性與葉酸代謝相關(guān)，導(dǎo)致機體同型半胱氨酸濃度的增加[12]。本研究在單因素分析中，尚不能認(rèn)為MTHFR基因和MTRR基因的多態(tài)性與早產(chǎn)有直接的關(guān)系，關(guān)于此方面的研究尚需進一步研究探討，MTHFR基因和MTRR基因的多態(tài)性可能因不同環(huán)境因素交互作用而導(dǎo)致早產(chǎn)的發(fā)生。

2.孕期服用葉酸對早產(chǎn)的影響：本研究針對葉酸服用的時間進行分層分析，研究發(fā)現(xiàn)，孕前服用葉酸，與孕前1個月開始相比，孕前3個月服用葉酸是早產(chǎn)的保護性因素，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，孕前6個月開始服用葉酸，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。孕前3個月服用葉酸可以顯著較低早產(chǎn)的風(fēng)險，提倡備孕婦女孕前3個月開始服用葉酸。本次研究還發(fā)現(xiàn)孕期服用葉酸也是早產(chǎn)的保護性因素，與孕期3個月相比，孕期服用葉酸至3～6個月是早產(chǎn)的保護因素；與服用葉酸3個月相比，孕期服用葉酸至6個月以上也是早產(chǎn)的保護性因素，說明孕期服用葉酸至6個月以上可以顯著降低早產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險。胎兒神經(jīng)管畸形的發(fā)生是在懷孕的前28 d內(nèi)，而此時大多數(shù)孕婦還未意識到已經(jīng)懷孕，所以面臨著葉酸缺乏的風(fēng)險，并會影響到胎兒[13]。因此預(yù)防神經(jīng)管缺陷，葉酸補充的最佳時間應(yīng)該從準(zhǔn)備懷孕前3個月至整個孕早期，這樣可使胎兒患神經(jīng)管畸形的風(fēng)險減少50%～70%[14]。在孕中、后期，寶寶DNA的合成，胎盤、母體組織和紅細(xì)胞增加都使孕婦對葉酸的需要量大大增加，所以即使寶寶的神經(jīng)系統(tǒng)在孕早期已經(jīng)發(fā)育完成，但孕中、后期葉酸的缺乏仍然會引起巨幼紅細(xì)胞性貧血、先兆子癇、胎盤早剝的發(fā)生風(fēng)險。

3.MTHFR和MTRR基因多態(tài)性與孕期因素交互作用對早產(chǎn)的影響：根據(jù)相關(guān)研究[14]，MTHFR和MTRR基因是葉酸代謝過程的關(guān)鍵基因，其多態(tài)性可能導(dǎo)致葉酸代謝的異常，引起不同的疾病，如高同型半胱氨酸血癥，但目前關(guān)于基因多態(tài)性與環(huán)境交互作用對早產(chǎn)的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，基因型的不同可以對妊娠結(jié)局產(chǎn)生不同的影響。基因型風(fēng)險等級評估越高的人群，可能存在葉酸代謝障礙，而通過服用葉酸，一定程度上彌補了葉酸缺乏的需求，可能會避免早產(chǎn)的發(fā)生風(fēng)險。孕前服用葉酸在不用基因風(fēng)險等級中差異不同，研究發(fā)現(xiàn)在早產(chǎn)組中，各風(fēng)險組是否服用葉酸差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；在中度風(fēng)險組及高風(fēng)險組中，孕婦是否服用葉酸對早產(chǎn)結(jié)局也有統(tǒng)計學(xué)意義。說明隨著基因型的不同，對服用葉酸的時間差異具有顯著性。說明對高風(fēng)險組人群的葉酸服用，按照個體差異，需要服用葉酸從孕前3個月至孕期6個月以上。本次研究為初次探討不同基因型孕前服用葉酸的影響，在未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險組中，孕期服用葉酸的時間長短，對早產(chǎn)的結(jié)局也不同，在高風(fēng)險組，也得出一致的結(jié)果，而低度風(fēng)險組與中度風(fēng)險組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究通過葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性與葉酸服用之間交互作用的研究發(fā)現(xiàn)，對于孕婦孕期服用葉酸，可以根據(jù)孕婦基因型的不同進行個體化服用指導(dǎo)，這對孕婦臨床服用葉酸具有重要指導(dǎo)意義。

本研究通過探討早產(chǎn)的相關(guān)因素，明確了服用葉酸、孕前3個月服用葉酸、孕期3～6個月服用葉酸與孕期6個月以上服用葉酸為相關(guān)保護性因素，孕前、孕期服用葉酸應(yīng)根據(jù)不同基因型選擇個體化服用，如基因風(fēng)險等級越高，葉酸服用時間應(yīng)延長至孕前3個月、孕期6個月以上。本研究的局限性包括未涉及葉酸服用劑量，樣本量偏少，尚需進一步探討研究。