不同霉菌培養(yǎng)基對Rhinocladiella sp.的影響及其生長水平預估的比較性研究

朱 旼 上海工微所科技有限公司，上海 200233

霉菌在自然條件下廣泛存在于陸地環(huán)境中，至今已發(fā)現(xiàn)超過45 000種[1]。作為其次級代謝產(chǎn)物，霉菌毒素一旦形成即可能存在于真菌菌落的所有部位，包括菌絲、子實體和孢子內(nèi)，或是被分泌到所寄生的基質表面或內(nèi)部，對基質造成污染[2]。經(jīng)世界糧農(nóng)組織估算，在全世界范圍內(nèi)約有25%的農(nóng)作物遭受霉菌污染并產(chǎn)生霉菌毒素，造成的經(jīng)濟損失可達數(shù)十億美元[2]。因此，霉菌已被認定為造成食物短缺的第二大因素，僅次于蟲害[2]。

農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品在遭受霉菌污染后，不僅會引發(fā)外觀以及品質上的劣化，用含有霉菌毒素的飼料喂養(yǎng)家禽家畜會造成的動物臟器損害或流產(chǎn)[3, 4]，嚴重的甚至會引發(fā)幼崽死亡，具有極強的致癌致畸以及致突變作用[1]。另外，由于霉菌毒素的化學穩(wěn)定性很強，產(chǎn)生污染后非常難以從糧食或飼料中去除，并會持續(xù)在后續(xù)的農(nóng)產(chǎn)品加工過程中造成污染[5]。通過富集作用積蓄在飼喂動物體內(nèi)的霉菌毒素會因此殘留在畜產(chǎn)品內(nèi)部，并在被人類食用后，因其具有的腎毒性和肝毒性引發(fā)人體病變，損害健康[1]。

本實驗經(jīng)由對客戶送檢的變性淀粉樣品中發(fā)現(xiàn)的一種特異生長的未知霉菌A所進行的分離、純化、鑒定和驗證，對其性狀進行了詳細研究，并根據(jù)其在3種常用霉菌檢測培養(yǎng)基上的生長差異，及其在5種霉菌培養(yǎng)基上的淀粉樣品加菌試驗結果，試圖尋找一種最適用于該菌株的早期檢出、并能對其生長趨勢進行預估的培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

實驗所使用的儀器包括Zealway GI100TR型高壓滅菌鍋，齊欣LRH-250型恒溫培養(yǎng)箱，精宏XMTD-8222型水浴鍋，北京東聯(lián)哈爾BSC01 360IIA2型超凈工作臺等。

實驗使用的孟加拉紅瓊脂(HB0237-2)、沙氏瓊脂培養(yǎng)基(HB0235-10)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(HB0233)等培養(yǎng)基均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

1.2 菌株分離與純化

本次使用的實驗菌株分離自客戶送檢的變性淀粉樣品。采取對三批間隔送樣的非重復淀粉樣本的分離與純化，同時使用3種不同的培養(yǎng)基進行平板培養(yǎng)，并對所培養(yǎng)的平板內(nèi)菌落進行比較、分離、純化和確證，最終獲得性狀穩(wěn)定的純化目標菌株。

1.2.1菌株分離

將3個不同批次含目標未知霉菌A的淀粉樣品按照國標[6]中的培養(yǎng)溫度，在參考了不同的霉菌檢測標準后，選擇使用孟加拉紅瓊脂(RBA)[6]、沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)[7, 8]和馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)[6, 8]3種培養(yǎng)基，按每個梯度平行2組、每種培養(yǎng)基3個梯度(10-1-10-3)傾倒平皿培養(yǎng)14 d，對比各培養(yǎng)基中菌落形態(tài)后，選擇培養(yǎng)至第10 d，生長在10-2梯度的RBA平皿上性狀穩(wěn)定的典型菌落，作為純化使用的分離菌株A’。

1.2.2菌株純化

挑取該分離菌株A’，接種在RBA平皿上并連續(xù)轉接培養(yǎng)三代。當觀測到的菌落性狀穩(wěn)定且無其他雜菌伴生后，即得到未知霉菌A的初代純化菌株A0。

1.2.3確證試驗

由于純化菌株A0在3種不同培養(yǎng)基上均出現(xiàn)兩種不同形態(tài)的菌落，故對這兩種菌落進行確證試驗，將其分別按照對方優(yōu)勢的生長條件進行培養(yǎng)，觀測菌落形態(tài)，驗證其是否為不同菌株。

1.3 菌種鑒定

本次菌種鑒定委托北京六合華大基因科技有限公司對純化菌株A0進行檢測。將測序結果(表1)進行NCBI-BLAST比對后可得該未知純化菌株A0為Rhinocladiellasp. 137/143/155x214wat (以下簡稱Rhinocladiellasp.)。

表1 引物信息

1.4 試驗方法

1.4.1菌懸液的制備

向滅菌后的2 mL離心管中加入1 mL無菌生理鹽水。選擇新鮮培養(yǎng)的Rhinocladiellasp.純化單菌落一個(直徑1 cm左右)，用1 μL孔徑的一次性接種環(huán)無菌刮取菌落表面孢子2次，將刮取的孢子轉移至離心管的生理鹽水中，用1 mL的一次性移液管反復輕柔吹打離心管中的孢子懸液制成初始孢子勻液。將該初始孢子勻液按照10倍的稀釋度配置10-1～10-5梯度的接種用稀釋菌懸液。

1.4.2純化Rhinocladiellasp.生長試驗

按照該菌懸液梯度，每個梯度接種2塊無菌平皿，每塊使用1 mL菌懸液進行接種。每組10-1～10-5梯度的平皿分別使用RBA、SDA或PDA中的一種，于28 ℃±1 ℃進行培養(yǎng)，并對培養(yǎng)結果進行計數(shù)。

1.4.3確證試驗

分別挑取兩種形態(tài)不同的菌落并按1.4.1步驟分別制備菌懸液。對于生長在培養(yǎng)基表面的菌落直接刮取其孢子部分，底部生長的菌落則將菌落帶培養(yǎng)基整個挑出并在盛有1 mL生理鹽水的離心管中搗碎，將離心管于6 000 r/min離心5 min后吸取上清液備用。

先取2塊空白平皿，每塊選擇一種菌懸液接種1 mL后，傾倒RBA并輕輕晃勻。另取2塊空白平皿，先傾倒RBA后靜置凝固，再于瓊脂表面各選擇其中1種菌懸液接種1 mL并微微傾斜，使菌懸液均勻覆蓋整個瓊脂平面。將2組平皿于28 ℃±1 ℃進行培養(yǎng)。

1.4.4加淀粉樣品的生長試驗

取適量1.1中的RBA和PDA，按照生產(chǎn)商提供的配方表中的有效成分數(shù)據(jù)，參考SDA培養(yǎng)基配方表中葡萄糖與蛋白胨含量進行補全，配制與1.1的SDA配方中葡萄糖與蛋白胨含量一致的改良RBA(RBA改)與改良PDA(PDA改)培養(yǎng)基(表2)。

將按照1.4.1方法制備的1 mL純化Rhinocladiellasp.菌懸液用9 mL無菌生理鹽水稀釋10倍后，加入10 g無菌淀粉樣品中并充分混勻。等淀粉干粉完全吸收10 mL菌懸液后，加入90 mL無菌生理鹽水，充分混勻，制成Rhinocladiellasp.-淀粉-生理鹽水懸濁液。以此懸濁液為10-1稀釋度，使用無菌生理鹽水配制5組10-1～10-5梯度的樣品試液，以每個梯度2塊平行平皿進行接種，每組分別使用表2中的1種培養(yǎng)基于28 ℃±1 ℃同時培養(yǎng)。

表2 培養(yǎng)基成分表(單位：g/L)

2 結果

2.1 淀粉樣品中未知霉菌A的性狀

在使用淀粉樣品研究未知霉菌A的生長曲線時，發(fā)現(xiàn)在雜菌干擾下其肉眼可辨的早期生長從接種后第4 d開始。接種后的第5 d～6 d菌落生長會進入平臺期，期間會小幅增長。6 d后菌落生長主要以增加表面積為主，在數(shù)量上不再有明顯增長。

1～3: 為同一塊平板在接種后第3 d～5 d的變化，箭頭所指的圈中心黑點為同一菌落; 4: 為Rhinocladiella sp.在淀粉樣品中受到其他雜菌干擾下生長至第5 d的情況。1: 培養(yǎng)第3 d； 2: 培養(yǎng)第4 d； 3: 培養(yǎng)第5 d圖1 Rhinocladiella sp.在沙氏瓊脂培養(yǎng)基上的 形態(tài)變化(3 d～5 d)

2.2 純化Rhinocladiella sp.的生長實驗與方差分析

2.2.1純化Rhinocladiellasp.的性狀

純化Rhinocladiellasp. 的菌落生長緩慢且不擴散生長，在SDA和PDA瓊脂表面生長的部分表現(xiàn)為由深色邊緣所包圍的淺灰色圓形菌落，而在RBA表面生長的部分為深色邊緣與淺灰色中層所包圍的灰色中心圓形菌落(圖2)。

1：在RBA表面為深色邊緣、淺灰色中層、中心為深灰色的圓形菌落；2：在SDA表面表現(xiàn)為深色邊緣淺灰色中心的圓形菌落；3：在PDA表面亦表現(xiàn)為深色邊緣淺灰色中心的圓形菌落。

分別使用RBA、SDA和PDA對純化Rhinocladiellasp.進行培養(yǎng)時，在不同培養(yǎng)基及不同稀釋度的平皿內(nèi)均發(fā)現(xiàn)兩種不同形態(tài)的目標菌，一種是緊貼平皿底部生長，從平皿底部可觀測到其中心部位有一深色核狀部分的淺色半透明圓形菌落；另一種是生長在平皿內(nèi)的瓊脂表面，菌落形態(tài)為深灰至黑色天鵝絨樣邊緣光滑的圓形菌落。圖3為PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至第7 d的純化Rhinocladiellasp.，外周淺色、中心有一深色核區(qū)的菌落為其生長在平皿底部的厭氧型，均一深灰色的圓形菌落為生長在培養(yǎng)基表面的好氧型。

圖3 純化Rhinocladiella sp.在PDA培養(yǎng) 基上的形態(tài)(7 d)

采用確證試驗將原本生長在底部的淺色菌落接種至瓊脂表面后，菌落形態(tài)與接種在瓊脂表面、原先即為表面生長的深色菌落表現(xiàn)一致；同時，原先為表面生長的深色菌落，在被接種到平皿底部后也表現(xiàn)出了與原先緊貼平皿底部生長的菌落一致的形態(tài)：具有深色內(nèi)核與淺色外周。

經(jīng)確證試驗檢驗后可得，此2種不同形態(tài)菌落實為純化Rhinocladiellasp.生長的不同表型。生長于平皿內(nèi)瓊脂表面的為其好氧型，緊貼平皿底部生長的為其厭氧型。在對厭氧平板進行長期培養(yǎng)(>10 d)后發(fā)現(xiàn)，在菌落體積增加到一定大小后，其頂部也會突破培養(yǎng)基表面生長并表現(xiàn)出好氧型的菌落形態(tài)，形成上半部鉆透瓊脂表面生長在平面以上、下半部繼續(xù)在瓊脂內(nèi)部生長的形態(tài)(圖4)。

圖4 穿透SDA培養(yǎng)基上表面生長的 厭氧型Rhinocladiella sp.

2.2.23種培養(yǎng)基的比較試驗

純化Rhinocladiellasp.在RBA、SDA和PDA中的生長均從接種后第2 d起可被觀測到，并在第3 d進入生長對數(shù)期，第5 d進入平臺期。同時使用3種培養(yǎng)基對純化Rhinocladiellasp.進行培養(yǎng)，以5 d為一個周期，重復培養(yǎng)5個周期后，對每種培養(yǎng)基在每個菌懸液梯度下單日所得的菌落數(shù)均值進行比較，培養(yǎng)基間差異見圖5。

圖中數(shù)據(jù)為純化Rhinocladiella sp.5日培養(yǎng)的菌落計數(shù)日均值圖5 純化Rhinocladiella sp.在3種培養(yǎng)基上的 生長表現(xiàn)

2.2.3單因素方差分析

對培養(yǎng)第3 d純化Rhinocladiellasp.在3種培養(yǎng)基上的5組菌落計數(shù)平均值使用Excel進行單因素方差分析[9]，結果如表3。

表3 純化Rhinocladiella sp.在3種培養(yǎng)基上培養(yǎng) 第3 d所得菌落數(shù)的單因素方差分析

用同樣方法，對培養(yǎng)第5 d純化Rhinocladiellasp.在3種培養(yǎng)基上的5組菌落計數(shù)平均值進行單因素方差分析，結果如表4。

表4 純化Rhinocladiella sp.在3種培養(yǎng)基上培養(yǎng) 第5 d所得菌落數(shù)的單因素方差分析

2.3 含淀粉樣品的加菌試驗與方差分析

2.3.1加菌試驗的5種培養(yǎng)基比較

使用RBA、RBA改、SDA、PDA和PDA改5種培養(yǎng)基按1.4.4方法進行培養(yǎng)，4 d為一個周期的試驗，共進行3輪試驗。對每種培養(yǎng)基在每個菌懸液梯度下單日所得的菌落數(shù)均值進行比較，各組試驗中第2 d、3 d、4 d平皿上的菌落數(shù)變化情況見圖6，每2 d之間的菌落數(shù)增量均值見圖7。

圖中數(shù)據(jù)為4 d培養(yǎng)的菌落計數(shù)日均值圖6 5種培養(yǎng)基在含淀粉樣品的Rhinocladiella sp.加菌試驗中的表現(xiàn)

2.3.2單因素方差分析

對3輪試驗中，5種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)3 d后得到的3組菌落計數(shù)平均值進行單因素方差分析，結果如表5。

去掉PDA組的數(shù)據(jù)后，對剩下的RBA、RBA改、SDA、PDA改4組數(shù)據(jù)再重復一次方差分析，所得結果如表6。

圖中數(shù)據(jù)為第2 d～第3 d與第3 d～第4 d培養(yǎng)的 菌落計數(shù)增量均值圖7 5種培養(yǎng)基上生長的Rhinocladiella sp. 菌落數(shù)增量

表5 5種培養(yǎng)基在加菌試驗的第3 d所得 菌落數(shù)的單因素方差分析

表6 4種培養(yǎng)基在加菌試驗的第3 d所得菌落 數(shù)的單因素方差分析

3 分析與探討

作為全世界最大的小麥生產(chǎn)國和世界第二大玉米生產(chǎn)國，我國的玉米淀粉產(chǎn)量連年高居淀粉行業(yè)榜首。隨著中原地區(qū)的淀粉加工企業(yè)擴大生產(chǎn)規(guī)模，2018年我國小麥淀粉產(chǎn)量也突飛猛進，市場占比躍居行業(yè)第二[10]。在各類淀粉總產(chǎn)量中，淀粉深加工產(chǎn)品已連續(xù)8年占比超過50%，深加工產(chǎn)品中變性淀粉產(chǎn)量僅次于淀粉糖，位列第二[11]。然而作為我國淀粉行業(yè)最主要的兩種原料，玉米和小麥卻一直飽受霉菌毒素的侵擾。

對于已知的近400種霉菌毒素進行研究后發(fā)現(xiàn)其主要為環(huán)肽、多鯨酸類、萜烯類和含氮代謝產(chǎn)物[2]，而通過谷物對糧食及飼料等農(nóng)產(chǎn)品造成影響的霉菌毒素，則主要是由曲霉菌屬、青霉菌屬、麥角菌屬和鐮刀菌屬所產(chǎn)生[12]，其中嘔吐毒素與玉米赤霉烯酮為近年來我國污染小麥和玉米等最普遍、毒性危害最嚴重的霉菌毒素[3, 13]。

Rhinocladiellasp.此前從未作為農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中的污染源被報道，此次在多種變性淀粉樣品中持續(xù)(>6個月)廣泛地存在，說明其與農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)有著一定程度的關聯(lián)。

Rhinocladiellasp.作為一種生長緩慢的子囊菌綱絲分孢子真菌，因其生長特性，學界對其現(xiàn)有的研究較少，國內(nèi)尚無對其生長特性的詳細研究。該菌種的野外發(fā)現(xiàn)多來自于熱帶及亞熱帶的林木、植物根部及落葉上，如曾詩涵[14]曾在相思樹樣木、樟樹樣木和白匏子樣木的樹種上發(fā)現(xiàn)其入侵；以及VICENTE V A等人[15]則在馬纓丹和銀樺木上發(fā)現(xiàn)過該霉菌。其對人類活動的影響多為經(jīng)由皮膚入侵而引發(fā)的皮膚、臟器感染及住院患者的系統(tǒng)性血液感染等，如GOMES R R等人[16]的研究曾發(fā)現(xiàn)其為著色真菌病的誘因之一；NUCCI M[17]等人的研究也顯示了其與多發(fā)性骨髓瘤以及艾滋病之間的關聯(lián)。

在對人類生產(chǎn)與生活產(chǎn)生的價值方面，Rhinocladiellasp.的作用仍知之甚少。曾有少量研究如KOSHIMURA M[18]等人發(fā)現(xiàn)其對萜類溴化物存在生物轉化的作用；彭程和楊中鐸的研究[19]則顯示其分離的化合物中部分具有中等強度的單胺氧化酶抑制活性；另外WAGENAAR[20]等人則發(fā)現(xiàn)該菌種能通過生物活性分離能產(chǎn)生3種新松胞菌素(cytochalasin),對多種人腫瘤細胞有很強的抑制作用。

胡翔穎[21]等人曾在對與其同屬的Rhinocladiellamackenziei進行研究時，發(fā)現(xiàn)一種來自該菌株的蛋白RmZHD具有良好的玉米赤霉烯酮水解活性和熱穩(wěn)定性，亦將該屬與霉菌毒素關聯(lián)在一起。隨著本次對Rhinocladiellasp.性狀的初步研究，該屬霉菌與淀粉加工行業(yè)的相關性可得到進一步揭示。

由于本次實驗所用菌株須先從客戶提供的淀粉樣品中進行分離，而樣品中混雜大量其他霉菌和酵母，再加上該未知菌株生長緩慢，在低稀釋度組別中經(jīng)常發(fā)生被其他真菌侵占生長空間的情況，造成目標菌被其他真菌覆蓋、抑或是將目標菌誤認為培養(yǎng)基沉淀(如PDA中的未溶解淀粉顆粒)，從而造成計數(shù)時的誤讀。因此在菌株分離時，使用十倍梯度稀釋方法將雜菌密度降低，使得早期生長階段的目標菌能有足夠空間和營養(yǎng)形成菌落。

純化后的Rhinocladiellasp.生長速度比其在淀粉樣品中受到大量雜菌干擾時略快。因無雜菌干擾的環(huán)境能極大提高其在菌落形成初期的觀測機會，使用3種不同培養(yǎng)基對Rhinocladiellasp.的早期觀測報告均從接種后第4 d提早到了第2 d。菌落生長在培養(yǎng)第3 d進入對數(shù)期，菌落數(shù)量呈幾何級增長，并在第5 d進入平臺期。因5 d后菌落數(shù)量增長沒有顯著變化，故將培養(yǎng)基生長對比的觀測周期定為接種后培養(yǎng)第2～5 d。

在經(jīng)過5輪5 d培養(yǎng)后，對比每日各梯度不同培養(yǎng)基中Rhinocladiellasp.菌落的算數(shù)平均數(shù)，發(fā)現(xiàn)兩組培養(yǎng)基數(shù)據(jù)與同日其他兩種培養(yǎng)基數(shù)據(jù)產(chǎn)生明顯差異。其一為培養(yǎng)第3 d的SDA平皿組，其菌落數(shù)量的算數(shù)平均值高出該日其他兩種培養(yǎng)基組別將近一倍；另一組為培養(yǎng)第5 d的RBA，與其他2組培養(yǎng)基之間的平均值差也達到了3～4×104CFU/mL。

為了確認培養(yǎng)基成分是否對實驗結果有顯著影響，將此2 d的5輪菌落計數(shù)分別進行單因素方差分析。由分析結果的p值可得，培養(yǎng)第3 d的組間p=0.042<0.05，故該組數(shù)據(jù)中SDA的培養(yǎng)效果明顯區(qū)別于RBA和PDA，目標菌在SDA培養(yǎng)基上有顯著增殖效應；培養(yǎng)第5 d的組間p=0.82>0.05，故在培養(yǎng)第5 d時三種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果并無顯著差異。

在確定SDA對純化Rhinocladiellasp.具有快速增值和早期預估作用之后，對比3種市售培養(yǎng)基配方，發(fā)現(xiàn)其主要成分在葡萄糖和蛋白胨的用量上具有較大差異。遂將純化生長試驗中表現(xiàn)欠佳的2種培養(yǎng)基：RBA與PDA的配方，按照市售SDA配方進行添補，配置成兩種改良培養(yǎng)基：改良RBA與改良PDA，但保留它們原先含有的孟加拉紅、氯霉素和馬鈴薯浸粉等成分，然后按照純化生長試驗方法，對無菌淀粉樣品中接種純化Rhinocladiellasp.進行培養(yǎng)基對比試驗。

在培養(yǎng)至第3 d時，SDA、RBA和RBA改3種培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)量基本處于同一水平，改良PDA培養(yǎng)基與之略有差距，而市售PDA上生長的菌落數(shù)量最少。

對第3 d數(shù)據(jù)進行2次單因素方差分析之后發(fā)現(xiàn)，盡管PDA改的數(shù)據(jù)在圖中與SDA、RBA和RBA改3種培養(yǎng)基數(shù)據(jù)相差較大，但方差分析結果顯示這4種培養(yǎng)基在培養(yǎng)3 d的菌落數(shù)量都處于相似水平，沒有顯著差異(p=0.13>0.05)，只有市售PDA培養(yǎng)基所生長的菌落數(shù)量與其余4種培養(yǎng)基有顯著差異(p=0.01<0.05)。

觀察培養(yǎng)第2～4 d間每天的菌落數(shù)增長情況可以發(fā)現(xiàn)，盡管淀粉樣品的存在對Rhinocladiellasp.的生長有一定影響，使得SDA的早期快速增殖優(yōu)勢變?nèi)?，但進入對數(shù)生長期第1 d的SDA中Rhinocladiellasp.菌落數(shù)增量仍居5種培養(yǎng)基之首，并且對數(shù)生長期第2 d的增量為所有培養(yǎng)基中最低值，再次證明SDA在有淀粉樣品的情況下，依然能有相對出色的前期增殖與目標菌含量預估作用，可在培養(yǎng)第3 d就使樣品中的Rhinocladiellasp.菌落數(shù)量迅速接近原先培養(yǎng)4 d才可到達的平臺期附近。再加上其瓊脂形態(tài)顏色清澈透明無雜質，對純化Rhinocladiellasp.的濃度預估和早期發(fā)現(xiàn)均有顯著優(yōu)勢，從而能夠幫助客戶最高效地分析產(chǎn)品霉菌污染的原因，改善工藝，保障產(chǎn)品質量安全。