植物乳桿菌AR495抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7 向破骨細(xì)胞分化的研究

孫文妮， 楊 茜， 譚卓銘， 文富民， 陳樂蔭， 于 婧， 王光強(qiáng)， 艾連中， 夏永軍 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093

骨質(zhì)疏松癥是由于人體骨代謝異常所致的全身性骨量減少,骨骼微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞,骨脆性增加導(dǎo)致骨折危險(xiǎn)性明顯增加的一種疾病[1]。破骨細(xì)胞是一種巨大的多核細(xì)胞，起源于單核巨噬細(xì)胞/單核系造血前體細(xì)胞，在骨吸收過程中破骨細(xì)胞的形成和活性異常可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[2]。目前對(duì)骨質(zhì)疏松患者的治療主要用激素替代療法，在長期服用過程中會(huì)增加患乳腺癌和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。

益生菌是一類對(duì)宿主有益的微生物[4]，其中包括多種不同種屬的微生物，如乳酸菌、腸球菌、雙歧桿菌等[5]。益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、保護(hù)腸道黏膜屏障、提高機(jī)體免疫力、產(chǎn)生抗菌化合物抵御病原體侵害等多種作用[6]。大量研究證明，乳酸菌對(duì)高膽固醇、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓與糖尿病等疾病有較好的改善作用[7]。

益生菌的狀態(tài)對(duì)其功能發(fā)揮有重要影響。在臨床實(shí)驗(yàn)中，口服巴氏滅活的阿克曼氏菌具有降低總膽固醇、減輕體重、減少脂肪量和髖部周長等效果，而活菌卻沒有這些功效[8]。一些乳酸菌如干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌細(xì)胞壁可通過調(diào)節(jié)免疫炎癥和氧化應(yīng)激來減輕LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[9]。發(fā)酵乳桿菌的細(xì)胞壁蛋白能夠粘附于派爾淋巴結(jié)(PPs)上誘導(dǎo)Th1型反應(yīng)而抑制病原體[10]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，益生菌在緩解骨質(zhì)疏松方面有較好的應(yīng)用潛力[11]。鼠李糖乳桿菌[12]、副干酪乳桿菌[13]和嗜酸乳桿菌[14]等均被證實(shí)能夠通過免疫調(diào)節(jié)來減少骨吸收，抑制破骨細(xì)胞生成。課題組前期研究篩選獲得一株具有緩解骨質(zhì)疏松功能的植物乳桿菌AR495，能夠減少小鼠骨質(zhì)流失。但其對(duì)破骨細(xì)胞的分化以及相應(yīng)通路未知。本文考察了植物乳桿菌AR495不同處理方式(活菌、死菌等)對(duì)核因子-κB受體活化因子配基(RANKL)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響，為解析其緩解骨質(zhì)疏松機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

植物乳桿菌AR495系從發(fā)酵食品中篩選獲得，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.14004。

1.1.2主要試劑和儀器

SYBR Green(上海翌圣生物技術(shù)有限公司，中國)；DMEM完全培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS緩沖液、RANKL(美國GIBCO)；MRS培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司，中國)；抗酒石酸酸性磷酸酶染液(南京建成生物工程研究所，中國)；CCK8檢測(cè)試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)；RAW 264.7細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，中國)；IL-1β ELISA快速檢測(cè)試劑盒、TNF-α ELISA快速檢測(cè)試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司，中國)。Trizol、異丙醇、三氯乙酸、無水乙醇和DEPC水均購自生工(上海，中國)。HPX.9162MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱 (上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司，中國)；SpectraMax i3x型酶標(biāo)儀(奧地利美谷分子)；UV2600型紫外分光光度計(jì)(日本島津)；湘儀L500臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，中國)；Ruskinn 低氧厭氧培養(yǎng)工作站(英國Ruskinn)；LightCycle96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；Bio-rad S1000梯度PCR儀(美國伯樂Bio-rad)；倒置顯微鏡(DMi8，德國Leica公司)；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Countess Ⅱ，美國Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1不同活性成分分組及其處理方法

將活化后的AR495接種至液體MRs培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h，取1 mL培養(yǎng)液4 000 r/min離心10 min，取上清；將沉淀用無菌的PBS洗滌2次后重懸，得活菌；重懸后的菌體于100 ℃中水浴中熱滅活5 min；重懸后的死菌超聲破碎45 min，4 000 r/min離心10 min，取上清得胞內(nèi)物；取沉淀得細(xì)胞壁。將除活菌和死菌外的組分過0.44 mm水相濾頭除菌。其中發(fā)酵液組以MRs培養(yǎng)基作為對(duì)照，消除培養(yǎng)基成分的干擾。

表1 不同活性成分分組及其處理方法

1.2.2細(xì)胞活力測(cè)定

將RAW264.7細(xì)胞以1×104cell/mL的濃度鋪于96孔板中，以DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后分為8組，設(shè)5副孔，第1組設(shè)置為空白對(duì)照，第2組為RANKL誘導(dǎo)組，第3至8組為RANKL+活性成分組，第2至8組均以50 ng/mL RANKL誘導(dǎo)5 d，第3至8組于第3 d時(shí)加入不同組分共培養(yǎng)，且添加不同組分的組均調(diào)整到細(xì)胞濃度為106CFU/mL。第5 d，每孔加入10 μL CCK8試劑，于37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育1 h后在450 nm下測(cè)吸光度[15]。

1.2.3細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將RAW264.7細(xì)胞以1×104cell/mL的濃度鋪于加細(xì)胞爬片的12孔板中，細(xì)胞分組方法同1.2.2。第5 d時(shí)，取出細(xì)胞爬片，按照抗酒石酸酸性磷酸酶染液試劑盒操作說明書進(jìn)行染色。倒置顯微鏡觀察，拍照。每個(gè)處理?xiàng)l件拍8個(gè)隨機(jī)視野，對(duì)細(xì)胞核數(shù)量大于2個(gè)的多核破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)[16]。

1.2.4TRAP酶活測(cè)定

將RAW264.7細(xì)胞以1×104cell/mL的濃度鋪于每孔含有2 mL DMEM完全培養(yǎng)基的12孔板中。細(xì)胞分組方法同1.2.2。第5 d時(shí)取培養(yǎng)液上清。按試劑盒操作說明書中步驟檢測(cè)TRAP酶活力[17]。

1.2.5ELISA測(cè)定細(xì)胞因子

取不同組分共培養(yǎng)5 d后的細(xì)胞培養(yǎng)液，離心獲取上清。用ELISA快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β與TNF-α的含量[18]。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量

將RAW264.7細(xì)胞以1×104cell/mL的濃度鋪于12孔板中，在與不同組分共培養(yǎng)5 d后，每孔中加入1 mL Trizol，輕輕吹打細(xì)胞，收集液體于1.5 mL離心管內(nèi)，于-80 ℃冰箱保存。Trizol法提取細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量使用的引物

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，當(dāng)P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物乳桿菌AR495對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

CCK-8試劑盒常被用于藥物篩選，可以測(cè)定在不同濃度藥物下細(xì)胞的存活率。由表3可以看出，在AR495的菌濃為106CFU/mL時(shí)，不同組分和RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)都會(huì)降低細(xì)胞的相對(duì)活力。其中除模型組外，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的各組分之間均無顯著差異。這說明各組分對(duì)細(xì)胞的活力影響相似，排除了細(xì)胞相對(duì)活力對(duì)其他指標(biāo)的影響。

表3 植物乳桿菌AR495與RAW264.7共培養(yǎng)后RAW264.7向破骨細(xì)胞分化的相關(guān)指標(biāo)

2.2 植物乳桿菌AR495對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)影響

破骨細(xì)胞分化的鏡檢結(jié)果能直觀的顯示不同組分對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制效果。不同組分與巨噬細(xì)胞RAW264.7共培養(yǎng)的結(jié)果在200倍鏡頭下如圖1所示。圖中深色單核圓形的細(xì)胞為未分化的RAW264.7細(xì)胞，顏色較淺的多核不規(guī)則細(xì)胞為分化后的破骨細(xì)胞。從不同處理組共培養(yǎng)后細(xì)胞的染色圖中可以看出，在AR495活菌與發(fā)酵液處理組中，每個(gè)視野下的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯低于其他各組。巨噬細(xì)胞RAW264.7經(jīng)過RANKL誘導(dǎo)后，RANKL與巨噬細(xì)胞表面的RANK配體結(jié)合，啟動(dòng)破骨前體細(xì)胞的分化，并最終融合成多核的破骨細(xì)胞[19]。而AR495活菌與發(fā)酵液均能有效的抑制這種分化的過程。

由每個(gè)視野下破骨細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表3)可看出，活菌組的破骨細(xì)胞數(shù)量降低了49.75%，發(fā)酵液組的破骨細(xì)胞數(shù)量降低了50.84%，而其他組的破骨細(xì)胞數(shù)量相對(duì)于模型組沒有顯著性差異。SUN[20]等利用神經(jīng)肽FF干預(yù)破骨細(xì)胞分化，細(xì)胞形態(tài)變化與本研究抑制，同樣減少了多核破骨細(xì)胞數(shù)量。

2.3 植物乳桿菌AR495對(duì)RAW264.7 TRAP酶活影響

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)是一種糖基化的含金屬蛋白酶，在破骨細(xì)胞中高度表達(dá)，抗酒石酸酸性磷酸酶可以被破骨細(xì)胞釋放到血液中，幾乎被認(rèn)為是是機(jī)體破骨活性的唯一血液指標(biāo)[21]。表3為植物乳桿菌AR495不同處理組與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，每孔細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的TRAP酶活力變化。由表3可知，活菌組與發(fā)酵液組的TRAP酶活力與模型組相比降低了20.89%與49.24%，而其余各組分的TRAP酶活力與模型組相比，都不具有顯著性差異。發(fā)酵液組表現(xiàn)出了比活菌組更好的抑制TRAP酶的表達(dá)的能力，有效的抑制了破骨細(xì)胞的分化。與黃俊飛[22]等人施用西瑞香素抑制TRAP酶活力的結(jié)果相一致。

2.4 植物乳桿菌AR495對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子影響

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可介導(dǎo)白介素-1β(IL-1β)等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些因子在協(xié)同作用下，會(huì)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體分化為破骨細(xì)胞[23]。因此評(píng)價(jià)了AR495不同組分對(duì)細(xì)胞因子TNF-α與IL-1β的抑制作用。如表3所示，活菌組相對(duì)于模型組TNF-α與IL-1β的含量分別降低了141.39 pg/mL和17.09 pg/mL；發(fā)酵液組相對(duì)于模型組TNF-α與IL-1β的含量分別降低了164.37 pg/mL和14.78 pg/mL，這兩組與空白組之間均沒有顯著性差異，說明細(xì)胞內(nèi)TNF-α與IL-1β的表達(dá)被抑制到與正常巨噬細(xì)胞接近的水平。而其他各組如細(xì)胞壁與胞內(nèi)物組雖然相比模型組顯著性的抑制了TNF-α與IL-1β的表達(dá)，但是沒有活菌組與發(fā)酵液組的抑制效果更明顯?；罹c發(fā)酵液這兩種組分都顯示出了對(duì)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的細(xì)胞因子的顯著抑制效果。

2.5 植物乳桿菌AR495對(duì)RAW264.7相關(guān)通路基因表達(dá)影響

圖2顯示了與AR495不同處理組與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白的相對(duì)表達(dá)情況，與模型組相比較，活菌組與發(fā)酵液組均顯著性的抑制了TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB信號(hào)蛋白的表達(dá)。

核因子κB受體活化因子配體(RANKL)能夠特異性的結(jié)合并激活破骨前體細(xì)胞膜上的核因子κB受體活化因子配基(RANK)，TNF受體相關(guān)因子6(TRAF-6)將RANK的信號(hào)直接刺激NFκB的活化，并轉(zhuǎn)運(yùn)活化后的NFκB進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)了破骨細(xì)胞的形成，增強(qiáng)骨代謝機(jī)制[24]。去甲異波爾定同樣通過調(diào)節(jié)此通路抑制了破骨細(xì)胞分化[25]。Toll樣受體4(TLR4)介導(dǎo)的髓樣分化因子88(MyD88)依賴途徑會(huì)活化核因子κB(NF-κB)[26]，這是一條重要的炎癥通路。活菌與發(fā)酵液組對(duì)該條通路的調(diào)節(jié)與VIJAYAN[27]等人研究蛋氨酸下調(diào)破骨細(xì)胞前體中的TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的結(jié)果相一致。而NF-κB是RANKL/TRAF 6通路與TLR4/MyD88通路的交匯點(diǎn)，這兩條通路共同通過NF-κB介導(dǎo)下游的信號(hào)因子，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，引起炎癥反應(yīng)。從結(jié)果中可以看出，這兩種組分是通過分別調(diào)節(jié)RANKL/TRAF6通路與TLR4/MyD88通路來共同抑制破骨細(xì)胞分化的。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過分析巨噬細(xì)胞活力與形態(tài)、TRAP酶活力以及細(xì)胞炎癥因子結(jié)果表明，AR495的活菌與發(fā)酵液均能顯著的抑制TRAP酶的活力以及破骨細(xì)胞的分化，抑制細(xì)胞因子TNF-α與IL-1的產(chǎn)生。同時(shí)通過調(diào)節(jié)RANKL/TRAF 6通路與TLR4/MyD88通路蛋白的表達(dá)來抑制破骨細(xì)胞的分化。本研究為進(jìn)一步解析植物乳桿菌AR495緩解骨質(zhì)疏松機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。