固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定奶糖中7種合成著色劑的含量

張楠楠 上海工微所科技有限公司，上海 200233

食品著色劑是為食品著色的一類(lèi)食品添加劑，分為天然著色劑和合成著色劑。合成著色劑由于色澤鮮艷，易著色，成本較低，穩(wěn)定性好，在食品加工過(guò)程中被廣泛使用。然而長(zhǎng)期過(guò)量攝入到人體，可能會(huì)導(dǎo)致慢性中毒，更有甚致畸致癌等風(fēng)險(xiǎn)[1]。因此，我國(guó)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[2]中對(duì)不同食品中各種合成著色劑的使用和限量做出了明確規(guī)定。

目前測(cè)定合成著色劑的方法也比較多，如高效液相色譜法[3,4]、超高效液相色譜法[5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]等，高效液相色譜法是較為普遍的檢測(cè)手段，且對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求相對(duì)較低。GB 5009.35—2016[7]和SN/T 1743—2006[8]中高效液相色譜法測(cè)定食品中合成著色劑的方法，是采用聚酰胺粉吸附法進(jìn)行提取，但在實(shí)際操作過(guò)程中，由于過(guò)程繁瑣，損耗嚴(yán)重，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢測(cè)效率[9]。固相萃取法是目前常用的一種提取方法，能夠?qū)悠分械纳剡M(jìn)行凈化和富集，并能最大程度的降低雜質(zhì)對(duì)結(jié)果的影響，具有方便快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[10]。

本文通過(guò)沉淀劑沉淀奶糖樣品中的蛋白質(zhì)、脂肪和明膠等物質(zhì)，甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)溶液提取，混合弱陰離子交換小柱凈化，高效液相色譜法多波長(zhǎng)檢測(cè)奶糖中的檸檬黃、日落黃、新紅、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅和亮藍(lán)這7種合成著色劑的含量，靈敏度高，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單，實(shí)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：奶糖，市售。

7種合成著色劑：檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)和誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 μg/mL，北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司)；氨水、甲酸、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，DIKMA)；乙酸銨(色譜純，MACKLIN)，實(shí)驗(yàn)室用水均為一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Scientific U3000高效液相色譜儀(DAD-3000二極管陣列檢測(cè)器，賽默飛世爾科技公司)；超聲波清洗器(KQ-100，昆山市超聲儀器有限公司)；固相萃取儀(Supelco SPE)；CNW poly-sery PWAX弱陰離子交換SPE小柱(150 mg/6 mL，北京迪馬科技公司)；防腐氮吹儀(EFTT-DC12，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；電子天平(MS204TS，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；離心機(jī)(TDL-5A，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的配制

準(zhǔn)確吸取200 μL檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)和誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，加水溶解配制成20.0 μg/mL的儲(chǔ)備液，再逐級(jí)稀釋至0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL和5.00 μg/mL。

1.3.2儀器條件

色譜柱：SunShell C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；

保護(hù)柱：SunShell Guard Cartridge Column RP；

流動(dòng)相：A:甲醇；B：0.02 mol/L乙酸銨；

流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10.0 μL；

檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；

檢測(cè)波長(zhǎng)：400 nm，529 nm，630 nm。

梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3.3樣品前處理

稱(chēng)取2 g(精確至0.000 1 g)樣品于離心管中，加5 mL溫水溶解，5 mL硫酸鋅溶液(120 g/L)，10 mL甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)溶液，用氨水調(diào)節(jié)pH至8.0～9.0，震蕩均勻，超聲30 min，4 500 r/min離心5 min，收集上清液，重復(fù)提取3次，合并上清液。用甲酸調(diào)節(jié)上述溶液pH至6.0，待凈化。PWAX弱陰離子交換小柱使用前先用5 mL甲醇和5 mL水活化小柱，取10.0 mL待凈化液上樣，用5 mL水淋洗小柱并吹干，最后用5 mL10%的氨化甲醇洗脫，收集洗脫液。洗脫液于50 ℃水浴并氮吹至近干，用甲醇∶0.02 mol/L乙酸銨溶液(1∶1，v/v)定容至1.0 mL，混勻，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過(guò)濾上機(jī)。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC檢測(cè)色譜圖

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.35—2016[7]和SN/T 1743—2006[8]選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，由于該波長(zhǎng)是折中選取了各色素都有吸收的一個(gè)共用波長(zhǎng)，既不是各色素的最大吸收波長(zhǎng)，又不是干擾少、穩(wěn)定性好的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)[11,12]，因此在此波長(zhǎng)下可能會(huì)導(dǎo)致某些色素化學(xué)吸收有干擾，靈敏度較低。為了使7種合成著色劑均有較好的靈敏度，本文采用二級(jí)陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)(200 nm～900 nm)對(duì)7種合成著色劑進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)各合成著色劑的吸收光譜圖確定檸檬黃和日落黃的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為400 nm，莧菜紅、胭脂紅、新紅和誘惑紅的檢測(cè)波長(zhǎng)為529 nm，亮藍(lán)的檢測(cè)波長(zhǎng)為630 nm。由圖1可知，在相應(yīng)的檢測(cè)波長(zhǎng)下，7種合成著色劑的背景干擾小，響應(yīng)值高。

A：400 nm；B：529 nm；C：630 nm圖1 合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.2 前處理優(yōu)化

2.2.1沉淀劑的選擇

奶糖中主要的干擾物質(zhì)有蛋白質(zhì)、脂肪和明膠等，如果不除去這些干擾物，則試樣液較渾濁，不利于固相萃取柱的凈化。通過(guò)試驗(yàn)分別采用硫酸-鎢酸鈉溶液、乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液、三氯乙酸-乙腈溶液、硫酸鋅-氫氧化鈉溶液、硫酸鋅-氨水溶液這幾個(gè)沉淀體系沉淀蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸-鎢酸鈉溶液和三氯乙酸-乙腈溶液無(wú)法有效沉淀，離心后上清液仍然混濁，無(wú)法進(jìn)行下一步固相萃取凈化。由于部分色素在較酸或較堿條件下，顏色易發(fā)生變化，因此在硫酸鋅溶液作用下沉淀，氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)樣液pH，會(huì)影響提取效果。乙酸鋅-亞鐵氰化鉀和硫酸鋅-氨水溶液作為沉淀劑對(duì)7種合成著色劑的提取效果的影響見(jiàn)表2。由表2可知，乙酸鋅-亞鐵氰化鉀沉淀體系的回收率偏低，可能是由于部分合成著色劑與蛋白共同被沉淀分離，致回收率偏低，并且乙酸鋅-亞鐵氰化鉀自身的顏色使被測(cè)溶液顏色發(fā)生變化產(chǎn)生干擾，達(dá)不到檢測(cè)目的。硫酸鋅-氨水溶液能有效的沉淀蛋白質(zhì)和脂肪，得到較好的回收率，因此本文選擇該沉淀體系。

表2 不同沉淀劑對(duì)合成著色劑回收率(%)的影響

2.2.2提取液的選擇

將奶糖加水溶解后，加5 mL硫酸鋅溶液沉淀，氨水調(diào)節(jié)pH后，加入不同的提取液進(jìn)行合成著色劑的測(cè)定。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[13-17]，本文選擇用水∶10%氨水溶液(9∶1)、甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1)、乙醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1)、甲醇∶乙腈∶水∶10%氨水溶液(5∶3∶1∶1)、乙醇∶乙腈∶水∶10%氨水溶液(5∶3∶1∶1)、甲醇∶乙醇∶乙腈∶10%氨水溶液(3∶3∶3∶1)這六種不同的提取液進(jìn)行比較，以上比例都為體積比，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，通過(guò)比較上述六種提取液提取效果，發(fā)現(xiàn)甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)的提取效果最好，既能保證色素的萃取效果，又能降低蛋白質(zhì)等干擾物在提取液中的溶解程度，更有利于固相萃取的凈化。此外，使用提取液萃取樣品中的色素時(shí)，提取次數(shù)越多，會(huì)導(dǎo)致上清液越渾濁，越不利于固相萃取。因此，甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)提取液重復(fù)提取三次，即能把奶糖中的合成著色劑提取完全，也能保證提取液較快較好的凈化。

表3 不同提取液對(duì)合成著色劑回收率(%)的影響

2.3 線(xiàn)性范圍和檢出限

由表4可知，在0.02 μg/mL～20.00 μg/mL的線(xiàn)性范圍內(nèi)，7種合成著色劑具有較好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r≥0.999 96。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算檢出限，7種合成著色劑的檢出限見(jiàn)表4。

表4 7種合成著色劑保留時(shí)間、線(xiàn)性方程、 相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 加標(biāo)回收率

選擇原味奶糖樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分別添加3個(gè)水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平做6個(gè)平行，采用硫酸鋅-氨水溶液沉淀，甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)溶液提取，PWAX小柱凈化，上機(jī)測(cè)定，計(jì)算得出加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如表5所示。加標(biāo)濃度為0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg時(shí)，該方法7種合成著色劑的回收率為82.9%～99.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.36%～2.78%，能滿(mǎn)足檢測(cè)要求。

表5 奶糖中7種合成著色劑的平均回收率和 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.5 樣品檢測(cè)情況

在市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)不同口味的奶糖，采用1.3.3實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)其樣品中的合成著色劑含量，結(jié)果如表6所示。結(jié)果表明，在這些樣品中，不同口味的奶糖中均檢出合成著色劑，但均未超出標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014[2]中規(guī)定的最大使用限量。

表6 不同口味奶糖合成著色劑檢測(cè)情況

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)便、高效的，可同時(shí)測(cè)定奶糖中7種合成著色劑含量的方法。通過(guò)比較不同沉淀劑的沉淀效果，以及不同提取液對(duì)樣品中合成著色劑的提取效果，選擇硫酸鋅-氨水溶液沉淀蛋白，甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)溶液提取，采用弱陰離子交換固相萃取小柱對(duì)樣品中的合成著色劑進(jìn)行凈化富集，7種合成著色劑實(shí)現(xiàn)了良好的分離。同時(shí)利用二極管陣列檢測(cè)器多波長(zhǎng)分析功能，提高目標(biāo)物的響應(yīng)值，降低了樣品中基質(zhì)的干擾，從而獲得更低的檢出限和更好的精密度。7種合成著色劑在0.02 μg/mL～20.00 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999 96，方法檢出限為0.03 mg/kg。加標(biāo)水平在0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg時(shí)，平均回收率在82.9%～99.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.8%，并且能滿(mǎn)足實(shí)際樣品分析的需要。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適合于奶糖樣品中多種合成著色劑的同時(shí)測(cè)定。針對(duì)其他基質(zhì)較為復(fù)雜的樣品，也可參考該方法開(kāi)展檢測(cè)。