柴黃清胰活血方對重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺氧化應(yīng)激的影響

晉小寧，姜朝麗，劉建琴，仁德芳，王天剛，李 志

1.西南醫(yī)科大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 脾胃病科（瀘州 646000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）依據(jù)其癥狀、體征及預(yù)后的不同可將其分為輕癥、中重度及重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）三類[1]。其中，10%～20%的AP 患者可發(fā)展為SAP，病死率高達(dá)10%～30%，現(xiàn)已成為嚴(yán)重危害我國人民健康以及生命的重大疾病之一[2]。柴黃清胰活血方是由本院脾胃病專家、省名老中醫(yī)創(chuàng)制，具有清熱解毒、瀉熱通腑、行氣止痛、活血化瘀的功效，在本院使用20余年，對重癥急性胰腺炎患者療效顯著[1-4]。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，柴黃清胰活血方對SAP 模型大鼠具有明顯的治療作用[5-9]，但其作用機(jī)制尚不完全明確。本研究旨在通過觀察柴黃清胰活血方對重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺氧化應(yīng)激的影響，為其臨床應(yīng)用、醫(yī)院制劑申報(bào)以及新藥開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SPF 級SD 大鼠128 只，8 w 齡，體重在220～280 g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號(hào):2019DW113。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及劑量

柴黃清胰活血方包括柴胡，黃芩，生大黃，赤芍等，其制劑由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。流浸膏生藥含量為1.514 g/g。批號(hào):20180602。實(shí)驗(yàn)劑量為1.2 g/kg。

1.3 試劑

?；悄懰徕c：牛黃膽酸鈉（公司:sigma，批號(hào):#SLBT9650），戊巴比妥鈉（天津蘭洪新能源科技公司，批號(hào):170108）。HE染色試劑盒（公司：Solarbio，批號(hào)：20191015）、中性樹膠（公司：Solarbio，批號(hào)：1018X021）。總蛋白（TP）測定試劑盒（公司：南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A045-2-2）；丙二醛（MDA）測定試劑盒（公司：南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A003-1-2）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒（公司：南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A001-1-2）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒（公司：南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A005-1-2）；過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（公司：南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A007-1-1）。山羊抗小鼠IgG（Bioss，批號(hào):AG05187292），山羊抗兔IgG（CST，批號(hào):27），HO-1（E6Z5G）Rabbit mAb（公司：CST，批號(hào)：1#$UNIVPA1907003308-25）。

1.4 儀器

KD-BM 生物組織包埋機(jī)（公司：浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）、石蠟切片機(jī)（公司：LEI?CA，型號(hào)：RM2245）、生物顯微鏡（公司：麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，型號(hào)：BA210LED雙目）、正置顯微鏡（公司：Nikon，型號(hào)：ECLIPSE 80i）、凝膠成像系統(tǒng)（公司：Bio-Rad，型號(hào)：Universal Hood Ⅱ）。

1.5 動(dòng)物模型制備與分組

128 只SPF 級雄性SD 大鼠，隨機(jī)分為4 組，即Blank組、Sham組、SAP組、ChaiHuang組，每組32只。術(shù)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，自由進(jìn)食、飲水，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食、不禁飲，實(shí)驗(yàn)前1 h禁飲。稱重，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（6 μL/g）進(jìn)行麻醉，固定，備皮，腹部消毒、鋪巾，沿劍突下腹中線兩側(cè)剪一約2.5～ 3 cm 切口開腹，定位十二指腸，暴露胰膽管，小動(dòng)脈夾夾閉近肝門處胰膽管，使用磨鈍的針頭在十二指腸乳頭對側(cè)腸壁無血管區(qū)刺穿腸壁進(jìn)入腸腔后退出，用1 mL注射器連接事先的針頭，沿預(yù)刺的針孔進(jìn)入腸腔，從十二指腸乳頭逆行進(jìn)入胰膽管，以100 μL/min 速度緩慢推注1 mL/kg 的5%?；悄懰徕c，同時(shí)觀察牛磺膽酸鈉溶液是否倒流入腸道，注射完成后觀察胰腺腫脹、充血情況，取出小動(dòng)脈夾，逐層關(guān)腹，術(shù)后禁食、自由飲水。Sham組大鼠開腹后僅翻動(dòng)十二指腸與胰腺后即關(guān)腹。

1.6 灌胃

術(shù)后1 h 大鼠蘇醒后，Sham 組與SAP 組大鼠灌胃生理鹽水（每次10 mL/kg），ChaiHuang組灌胃柴黃清胰活血方（每次1.2 g/kg），每6 h灌胃一次。

1.7 標(biāo)本采集

各組分別于6，12，24，48 h 取材8 只大鼠，連接血生化管、血常規(guī)管采取腹主動(dòng)脈血；采集每只大鼠相同部位適當(dāng)大小胰腺組織，新鮮組織立即-80℃凍存，其余組織用10%甲醛固定。

1.8 指標(biāo)測定

胰腺組織進(jìn)行HE 染色及病理評分（采用Schmidt 評分法對胰腺組織進(jìn)行鏡下評分，見表1）。血清淀粉酶（AMY）、脂肪酶（LPS）、全血白細(xì)胞（WBC）送至西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測。取胰腺組織塊0.2～1 g，生理鹽水漂洗，剪碎組織塊，放入離心管中，勻漿，將制備好的10%勻漿液，4 ℃，3 000 rpm/min離心10～15 min，取上清液，按照試劑盒說明測定SOD、GSH-Px、CAT、MDA。Western Blot檢測胰腺組織HO-1蛋白的表達(dá)。

表1 胰腺組織評分表

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用prism7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩個(gè)及多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way AN0VA），兩兩比較采用LSD 法，多組比較采用方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色后各組胰腺組織光鏡下觀察病理改變

Blank 組和Sham 組胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，小葉排列整齊，間隔無水腫，葉間隙小葉間隙腺泡間隙正常，無出血、壞死、炎細(xì)胞浸潤、血管擴(kuò)張，兩組胰腺組織相互比較未見明顯差異；與Sham 組相比，6 h SAP 組見葉間隙小葉間隙腺泡間隙明顯擴(kuò)張，有部分腺泡壞死，間隙內(nèi)及血管周圍見明顯炎性細(xì)胞浸潤，12 h SAP 組在6 h 病理改變基礎(chǔ)上，有多發(fā)片狀組織細(xì)胞壞死，壞死灶內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤，24 h SAP在12 h基礎(chǔ)上，葉間隙小葉間隙腺泡間隙縮小，細(xì)胞壞死減少，仍有大量炎性細(xì)胞浸潤，48 h SAP組較24 h 葉間隙小葉間隙腺泡間隙明顯縮小，偶見少許壞死細(xì)胞，有明顯炎性細(xì)胞浸潤；與同時(shí)間點(diǎn)SAP組相比，ChaiHuang組相應(yīng)病理改變明顯改善，見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE，× 200）

2.2 各組胰腺組織病理評分比較

與Blank 組相比，Sham 組胰腺組織病理評分無明顯差異；與Blank 組、Sham 組相比，SAP 組和Chai?huang 組胰腺組織病理評分明顯升高（P<0.05）；與SAP 組相比，ChaiHuang 組病理評分明顯降低（P <0.05），見表2。

表2 胰腺組織病理學(xué)評分（，分）

表2 胰腺組織病理學(xué)評分（，分）

注：a表示與Sham、Blank比較，P<0.05；b表示與SAP比較，P<0.05

2.3 各組大鼠血清AMY、LPS、全血WBC比較

與Blank 組相比，Sham 組血清AMY、LPS、全血WBC 水平無明顯差異；與Blank 組、Sham 組相比，SAP組和ChaiHuang組血清AMY、LPS水平明顯升高（P <0.05），6、12、24 h SAP 組和ChaiHuang 全血WBC 水平升高（P<0.05），48 h 無明顯差異；與SAP組相比，各ChaiHuang 組血清AMY、LPS 水平明顯降低（P <0.05），6、12、24 h ChaiHuang 組血WBC 水平降低（P<0.05），48 h 無明顯差異。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2、圖3、圖4。

圖2 各組大鼠AMY水平比較

圖3 各組大鼠LPS水平比較

圖4 各組大鼠WBC水平比較

2.4 各組大鼠胰腺SOD、GSH-Px、CAT、MDA比較

與Blank 組相比，Sham 組SOD、GSH-Px、CAT、MDA 水平未見明顯差異；與Blank 組、Sham 組相比，SAP組和ChaiHuang組SOD、CAT水平明顯降低（P<0.05），MDA 水平明顯升高（P<0.05），SAP 組和12、24 h ChaiHuang 組GSH-Px水平明顯降低（P <0.05），6、48 h CharHuang 無明顯差異；與模型組相比，柴黃組SOD、GSH-Px、CAT水平較高（P<0.05），MDA水平較低（P<0.05），見圖5，圖6，圖7，圖8。

圖5 各組大鼠胰腺組織SOD的比較

圖6 各組大鼠胰腺組織MDA的比較

圖7 各組大鼠胰腺組織GSH-Px的比較

圖8 各組大鼠胰腺組織CAT水平的比較

2.5 各組大鼠胰腺組織HO-1表達(dá)水平比較

與Blank 組相比，Sham 組HO-1 表達(dá)無明顯差異；與Sham 組相比，SAP 組和ChaiHuang 組HO-1 水平升高（P <0.05）；與SAP 組相比，ChaiHuang 組6、12、24 h HO-1 水平進(jìn)一步升高（P <0.05），48 h HO-1水平未見明顯差異，見圖9，表3。

表3 各組大鼠胰腺組織HO-1水平比較

圖9 各組大鼠胰腺組織HO-1水平比較

3 討論

SAP 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且臨床尚未完全明確，目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制包括胰酶自身消化、炎癥因子、氧化應(yīng)激、腸道菌群移位、微循環(huán)障礙等[10]。其中，氧化應(yīng)激是因?yàn)轶w內(nèi)氧化作用和抗氧化作用之間平衡被打破，產(chǎn)生大量的氧化中間產(chǎn)物，造成氧化損傷。機(jī)體內(nèi)存在兩種抗氧化系統(tǒng)：一種是酶抗氧化系統(tǒng)，包括SOD、CAT、GSH-PX 等；另一種是非酶抗氧化系統(tǒng)，包括維生素E、維生素C等[11]。SOD、CAT、GSH-PX為抗氧化物酶，可反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力；MDA 是不飽和脂肪酸類物質(zhì)過氧化反應(yīng)的終末分解產(chǎn)物，能間接反應(yīng)氧自由基水平[12]；由于血紅素代謝物具有抗氧化、抗凋亡、抗增殖等作用，故HO-1 為一種重要的細(xì)胞保護(hù)酶[13]，Zhang 等[14]實(shí)驗(yàn)證明大鼠SAP 可誘導(dǎo)胰腺HO-1的表達(dá)，故提高HO-1表達(dá)可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。

柴黃清胰活血方主要由柴胡、黃芩、生大黃、赤芍等14味中藥組成，現(xiàn)代藥學(xué)研究其組成藥物可抗炎、抗氧化、止痛、改善循環(huán)等作用[15]。趙曙光等[16]研究表明黃芩的主要成分黃芩甙干預(yù)能顯著抑制SOD活性的下降及降低胰腺組織MDA的含量，可能通過降低胰腺炎的氧化應(yīng)激水平，減輕胰腺炎癥程度而發(fā)揮對胰腺炎的保護(hù)作用；有學(xué)者研究表明大黃的有效成分大黃素具有增加氧自由基清除，抗氧化應(yīng)激的作用[17]；赤芍的有效成分沒食子酸、沒食子酸甲酯可清除DPPH 自由基，誘導(dǎo)血紅素氧化酶-1 的表達(dá)，提高SOD的活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用[18]；厚樸的乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、總生物堿等具有氧自由基清除、抗氧化的作用[19]；丹參的甲醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，水溶性成分可以提高SOD活性，降低MDA水平[20]；枳實(shí)的提取物能有效清除氧自由基，具有抑制脂質(zhì)過氧化作用[21]；以上研究提示上述藥物具有抗氧化的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SAP 組與Sham 組相比，大鼠的血清AMY、LPS、WBC水平較Sham 組明顯升高，且AMY、LPS 升高倍數(shù)類似于人類急性胰腺炎中重癥表現(xiàn)，結(jié)合后期胰腺HE染色光鏡下觀察胰腺組織病理改變，表明SAP 模型大鼠建立成功；ChaiHuang 組與SAP 組相比，Chai?Huang 組AMY、LPS、WBC 水平降低，表明柴黃清胰活血方對SAP 具有治療作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Chai?Huang 組SOD、GSH-Px、CAT 水平高于SAP 組，MDA水平低于SAP 組，提示柴黃清胰活血方可通過減弱過氧化、增強(qiáng)抗氧化對SAP 模型大鼠胰腺損傷產(chǎn)生保護(hù)作用；通過Western Blot方法檢測SAP模型大鼠胰腺組織中HO-1表達(dá)水平，結(jié)果表明ChaiHuang組HO-1水平較SAP組升高，提示柴黃清胰活血方可能通過上調(diào)HO-1 水平對SAP 模型大鼠胰腺損傷起到保護(hù)作用。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究證實(shí)柴黃清胰活血方對SAP模型大鼠胰腺損傷具有保護(hù)作用，可能與其升高SOD、GSH-Px、CAT，減少M(fèi)DA，上調(diào)HO-1，增強(qiáng)胰腺組織抗氧化酶活力、降低氧化應(yīng)激水平有關(guān)。