天然抗氧化劑及協(xié)同作用研究進(jìn)展

劉 賀,朱奕昊,劉亭亭,任永芳,王正平,3,劉 敏,

(1.聊城大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 聊城 252059；2.聊城大學(xué) 生物制藥研究院，山東 聊城 252059；3.聊城高新生物技術(shù)有限公司，山東 聊城 252059)

0 引言

從天然產(chǎn)物中提取出來(lái)的活性成分是我國(guó)醫(yī)藥寶庫(kù)的重要組成部分，很多活性成分具有抗氧化作用。與合成的抗氧化劑相比，這些天然抗氧化物質(zhì)具有毒性小、活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1]。近年來(lái)，對(duì)天然抗氧化劑的研究越來(lái)越廣泛而深入。當(dāng)兩種或多種抗氧化活性成分共同使用時(shí)，若其抗氧化作用優(yōu)于同濃度下兩種或多種單一成分的抗氧化作用之和，表明這些活性成分之間存在協(xié)同抗氧化作用[2]。具有協(xié)同性的活性成分共同使用時(shí)不僅會(huì)提高療效，還可以降低成本[1]。

由于正常的生理代謝過(guò)程產(chǎn)生的自由基一般不會(huì)對(duì)人體造成傷害，但是過(guò)量的自由基會(huì)引發(fā)各種疾病，加速人體衰老[3]。一些慢性疾病如糖尿病和高血壓，主要是因?yàn)轶w內(nèi)氧化和抗氧化體系的失衡所引起的[4]，所以需要補(bǔ)充抗氧化劑清除體內(nèi)過(guò)量的自由基以恢復(fù)體內(nèi)平衡。抗氧化劑尤其是具有協(xié)同性的天然抗氧化劑對(duì)清除自由基具有顯著效果。抗氧化劑在使用過(guò)程中會(huì)不可避免地與食品蛋白或人體蛋白結(jié)合，這就可能對(duì)抗氧化劑的活性產(chǎn)生影響。本文主要對(duì)天然抗氧化活性成分、蛋白對(duì)抗氧化性的影響、一些天然抗氧化劑的協(xié)同作用以及協(xié)同作用的優(yōu)化進(jìn)行了綜述。

1 天然抗氧化活性成分

合成的抗氧化劑如二丁基羥基甲苯(BHT)、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)等對(duì)人體有一定的毒性，所以植物中存在的安全、低毒、廉價(jià)、高效的天然抗氧化活性成分受到人們的廣泛關(guān)注。目前研究較多的天然抗氧化活性成分主要有多酚類、維生素類、多糖類等化合物，其中多酚類化合物根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同又可劃分為黃酮類、芪類、酚酸類等化合物[5]。

天然多酚類化合物種類繁多，在植物界分布廣泛并且來(lái)源豐富，其共同特點(diǎn)是因含有多個(gè)酚羥基而具有良好的抗氧化活性。因此他們的抗氧化能力一直是天然植物化學(xué)、天然藥物和食品應(yīng)用研究的重點(diǎn)。這些物質(zhì)可以減輕活細(xì)胞和組織中蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物的氧化損傷，從而降低某些慢性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[6]。多酚類化合物的抗氧化機(jī)理主要包括以下幾個(gè)方面：通過(guò)單電子轉(zhuǎn)移和氫原子轉(zhuǎn)移直接清除自由基；與過(guò)渡金屬離子絡(luò)合；抑制與氧化相關(guān)的酶如脂肪氧合酶和黃嘌呤氧化酶的活性；提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶的活性[7-9]。本課題組[10]利用維生素C(VC)做陽(yáng)性對(duì)照比較了白皮杉醇和氧化白藜蘆醇的抗氧化活性，這兩種多酚類物質(zhì)的抗氧化活性明顯強(qiáng)于VC。B環(huán)中的羥基位置對(duì)抗氧化活性有顯著的影響，如白皮杉醇B環(huán)中位于鄰位的兩個(gè)酚羥基容易形成分子內(nèi)氫鍵，這一結(jié)構(gòu)特性賦予了白皮杉醇較強(qiáng)的抗氧化活性。羥基個(gè)數(shù)、位置以及是否含有雙鍵對(duì)抗氧化劑的活性具有一定的影響。Zeng等人[11]比較了六種結(jié)構(gòu)相似的天然抗氧化劑(圖1)的抗氧化活性，活性順序?yàn)椋涸ㄇ嗨谺2活性大于表兒茶素活性，表沒(méi)食子兒茶素活性大于表兒茶素活性，槲皮素活性大于黃旗松素活性，槲皮素活性大于蘆丁活性。比較他們結(jié)構(gòu)的差異，B環(huán)中5’-OH、C環(huán)中C2C3雙鍵以及二聚體結(jié)構(gòu)提高了活性物質(zhì)的抗氧化活性，C環(huán)中C3糖基化使活性物質(zhì)的抗氧化性降低。盡管多酚類化合物具有良好的抗氧化活性，但特殊的分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其穩(wěn)定性和溶解性較差，降低了其在體內(nèi)的吸收效率[7]。

注：1：表沒(méi)食子兒茶素； 2：表兒茶素； 3：原花青素B2； 4：黃旗松素； 5：槲皮素； 6：蘆丁。

維生素是人體必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，VC和維生素E(VE)分別是水溶性和脂溶性抗氧化劑。VC可以減少和中和自由基，如過(guò)氧化氫。VE可以通過(guò)與脂質(zhì)過(guò)氧化鏈反應(yīng)中產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基反應(yīng)來(lái)保護(hù)膜不被氧化[12]。番茄紅素是維生素類化合物中有效的抗氧化劑，能使活性氧失活，它去除單線態(tài)氧的能力是VE的10倍[13]。補(bǔ)充適量的維生素可以在體內(nèi)發(fā)揮較好的抗氧化作用，但是攝入過(guò)多會(huì)引起中毒，增加機(jī)體的氧化損傷。

多糖類化合物能夠影響與自由基相關(guān)酶的活性從而表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，并且能夠通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來(lái)防止衰老[14]。羅敏等人[15]通過(guò)體內(nèi)外抗氧化實(shí)驗(yàn)研究米胚多糖的抗氧化能力，體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明米胚多糖具有一定的清除自由基的能力，并且清除自由基能力具有濃度依賴性，體外實(shí)驗(yàn)表明米胚多糖可以提高小鼠血清及組織中抗氧化酶活性。王曉敏等人[16]采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)表明山藥多糖的抗氧化活性顯著高于VC，具有較好的體外抗氧化活性。多糖類化合物提取簡(jiǎn)單、來(lái)源豐富、種類繁多，但是其分子量大、提取純度低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其抗氧化作用與哪些結(jié)構(gòu)有關(guān)還需深入研究[17]。

2 蛋白對(duì)抗氧化活性的影響

天然抗氧化劑在食品和制藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，在使用過(guò)程中不可避免地與食品蛋白或人體蛋白發(fā)生相互作用。蛋白與抗氧化劑的相互作用可能會(huì)降低或升高抗氧化劑的抗氧化活性[18]。本課題組的研究[10]發(fā)現(xiàn)，氧化白藜蘆醇和白皮杉醇與溶菌酶或胰蛋白酶的結(jié)合導(dǎo)致這兩種活性物質(zhì)的抗氧化活性降低。這是因?yàn)閮煞N酶與活性物質(zhì)的結(jié)合掩蔽了具有自由基清除能力的羥基，從而削弱了抗氧化劑的供氫能力，這也說(shuō)明溶菌酶和胰蛋白酶可以保護(hù)活性物質(zhì)不被氧化。此外，溶菌酶對(duì)這兩種活性成分抗氧化活性的影響程度大于胰蛋白酶，這是因?yàn)閮煞N酶與活性物質(zhì)的相互作用強(qiáng)度不同。在Zhang等人[19]的研究中發(fā)現(xiàn)，在DPPH模型中人血清白蛋白與酚酸類抗氧化劑的結(jié)合提高了自由基清除能力。人血清白蛋白中的硫基占血清中游離硫基的80%，其本身具有一定的抗氧化活性，所以人血清白蛋白與抗氧化劑結(jié)合后總抗氧化能力提升。趙煥焦等人[20]研究了β-乳球蛋白對(duì)黑米花色苷抗氧化性的影響。黑米花色苷、β-乳球蛋白和β-乳球蛋白-黑米花色苷的自由基清除率分別為72.56%、36.66%和85.72%，雖然總抗氧化能力提升，但是β-乳球蛋白-黑米花色苷復(fù)合物較黑米花色苷的自由基清除率增加值小于β-乳球蛋白的自由基清除率。所以β-乳球蛋白還是由于與黑米花色苷結(jié)合形成的氫鍵造成了羥基掩蔽，使黑米花色苷的抗氧化活性降低?？傊?，蛋白與活性物質(zhì)的相互作用以及蛋白自身的抗氧化性是影響抗氧化能力的主要因素。若蛋白與抗氧化劑結(jié)合作用強(qiáng)，則可能由于對(duì)羥基的強(qiáng)掩蔽而使抗氧化劑的抗氧化能力降低。反之，結(jié)合作用弱則可能會(huì)由于蛋白具有一定的抗氧化能力，從而提高了總抗氧化能力。表1中列舉了一些其他蛋白對(duì)抗氧化活性的影響。

表1 不同蛋白對(duì)抗氧化活性的影響

3 天然抗氧化劑之間的協(xié)同作用

不同活性物質(zhì)之間相互作用會(huì)產(chǎn)生協(xié)同、拮抗和加和作用[25，26]?？寡趸钚晕镔|(zhì)之間產(chǎn)生協(xié)同作用主要是因?yàn)椋?(1)生成了抗氧化活性更高的抗氧化劑； (2)抗氧化劑的螯合效應(yīng)； (3)不同溶解度的抗氧化劑的相互作用； (4)不同作用機(jī)制的抗氧化劑的相互作用[27]。評(píng)價(jià)協(xié)同作用的參數(shù)有協(xié)同系數(shù)(SE)和聯(lián)合指數(shù)(CI)，計(jì)算公式如[28，29]

(1)

(2)

(3)

其中ρESC為實(shí)驗(yàn)清除率，A1為加入抗氧化劑的自由基溶液吸光度，A0為相同濃度抗氧化劑的吸光度，A為不加抗氧化劑的自由基溶液吸光度，ρTSC為理論清除率

(4)

其中(D)1、(D)2分別為混合溶液清除率為x%中兩種抗氧化劑的濃度；(Dx)1、(Dx)2分別為兩種抗氧化劑單獨(dú)作用時(shí)清除率為x%時(shí)的濃度。當(dāng)協(xié)同系數(shù)大于1或聯(lián)合指數(shù)小于1時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同作用。

3.1 天然多酚類化合物與其他抗氧化劑的協(xié)同作用

多酚類化合物因其對(duì)人體健康大有裨益而受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注，這類化合物含有多個(gè)酚羥基使其成為供氫體，可提供與自由基配對(duì)的電子。多酚類化合物抗氧化活性強(qiáng)，能與其他抗氧化劑一起在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，有效清除體內(nèi)的自由基[30]。

綠原酸和蘆丁在DPPH自由基、超氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化體系中均具有良好的協(xié)同抗氧化性[31]。在DPPH模型中，蘆丁和綠原酸的濃度分別為7.5、14 μmol/L時(shí)協(xié)同系數(shù)最大，協(xié)同系數(shù)達(dá)1.35。并且，混合濃度增大后，協(xié)同系數(shù)有減小的趨勢(shì)。這說(shuō)明混合濃度升高會(huì)使清除能力增強(qiáng)，但是不代表協(xié)同性會(huì)隨濃度的升高而增強(qiáng)。綠原酸的協(xié)同性不僅與濃度配比有關(guān)，還與兩者的抗氧化活性差異有關(guān)。當(dāng)抗氧化活性差別較大時(shí)，抗氧化性強(qiáng)的抗氧化劑所占比例越大，協(xié)同性越好[32]。

Mao等人[33]研究發(fā)現(xiàn)桂花和綠茶在DPPH模型中存在協(xié)同抗氧化性。桂花和綠茶是對(duì)人體健康有益的兩種天然作物，這兩種植物之間的協(xié)同性在于各種抗氧化活性成分的協(xié)同性累積，其中綠茶中的沒(méi)食子酸與桂花中的毛蕊花糖苷之間的協(xié)同性為這兩種植物的協(xié)同性貢獻(xiàn)最大。

相同比例的抗氧化劑在不同的抗氧化模型中由于作用機(jī)理不同會(huì)產(chǎn)生不同的協(xié)同效果。Skroza等人[34]研究了白藜蘆醇與兒茶素、沒(méi)食子酸、咖啡酸之間的協(xié)同性。兒茶素與白藜蘆醇之間的協(xié)同性用多種實(shí)驗(yàn)方法均被證實(shí)。在鐵離子還原(FRAP)模型中，白藜蘆醇與兒茶素或咖啡酸之間存在協(xié)同性，并且咖啡酸與白藜蘆醇的協(xié)同性大于兒茶素與白藜蘆醇這一組合。在DPPH模型中，只發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇與兒茶素之間存在協(xié)同性，而咖啡酸與白藜蘆醇之間存在了拮抗性。

Ciosek等人[35]研究了黃酮類化合物與生育三烯酚在脂質(zhì)體系中的相互作用。氧化作用主要發(fā)生在脂質(zhì)相中，通過(guò)再引發(fā)機(jī)制，位于油水界面的黃酮類化合物與生育三烯酚相互作用，產(chǎn)生協(xié)同作用。并且，當(dāng)抗氧化活性強(qiáng)的抗氧化劑位于形成自由基的相中，而活性較低的抗氧化劑存在于界面時(shí)，會(huì)產(chǎn)生最大的協(xié)同效應(yīng)。Bo等人[36]對(duì)草本植物與天然抗氧化劑在DPPH模型中的協(xié)同作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)加入脂溶性抗氧化劑(如槲皮素和α-生育酚)比加入水溶性抗氧化劑(如抗壞血酸和兒茶素)更容易產(chǎn)生協(xié)同作用。并且在脂溶性或水溶性抗氧化劑與草本植物相互作用的體系中，改變脂溶性抗氧化活性物質(zhì)的濃度，協(xié)同系數(shù)有明顯的改變；但是改變水溶性抗氧化劑濃度，協(xié)同系數(shù)無(wú)明顯改變，這說(shuō)明脂溶性抗氧化劑在DPPH模型協(xié)同體系中起主導(dǎo)作用。

3.2 天然維生素類化合物與其他抗氧化劑的協(xié)同作用

不同抗氧化劑之間的協(xié)同作用強(qiáng)度取決于它們之間的相互作用，任何一種抗氧化劑濃度的變化都會(huì)對(duì)協(xié)同作用效果產(chǎn)生影響。Liu等人[37]對(duì)番茄紅素、VE、VC和β-胡蘿卜素四種抗氧化劑之間的協(xié)同作用利用DPPH模型進(jìn)行了研究。四組分混合溶液協(xié)同作用最強(qiáng)時(shí)，番茄紅素、VC、VE和β-胡蘿卜素的濃度分別為15、0.16、5和10.83 μmol/L，協(xié)同系數(shù)為1.34。在三組分混合溶液中，只有番茄紅素+VE+VC的組合顯示協(xié)同抗氧化性。在兩組分的混合溶液中，只有含番茄紅素的混合溶液有協(xié)同性，原因是番茄紅素使VE再生，VC使番茄紅素再生。Fabre等人[38]和Pan等人[29]的研究也證實(shí)了由于抗氧化劑的再生可以使得體系中產(chǎn)生協(xié)同抗氧化性。

濃度和不同的濃度配比對(duì)協(xié)同性產(chǎn)生顯著影響在Zora等人[39]的研究中也有所體現(xiàn)。番茄紅素+葉黃素、番茄紅素+β-胡蘿卜素、α-生育酚+β-胡蘿卜素之間存在明顯的協(xié)同抗氧化性，并且番茄紅素+葉黃素這一組合的協(xié)同性最強(qiáng)，協(xié)同系數(shù)為1.47。β-胡蘿卜素和α-生育酚的協(xié)同性在Zou等人[40]的研究中也被證實(shí)。β-胡蘿卜素和α-生育酚的結(jié)合有效地抑制了脂質(zhì)過(guò)氧化，兩組分的過(guò)氧化值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單一組分的過(guò)氧化值，說(shuō)明這兩種活性組分之間具有協(xié)同抗氧化性。這兩者之間的協(xié)同性可以用α-生育酚的再生來(lái)解釋。

3.3 天然多糖類化合物與其他抗氧化劑的協(xié)同作用

多糖和酚類抗氧化劑的協(xié)同抗氧化研究相對(duì)較少，有研究表明靈芝孢子多糖和茶黃素在ABTS模型中有協(xié)同抗氧化作用[41]。兩種抗氧化劑具有協(xié)同性可能是因?yàn)殪`芝孢子多糖和茶黃素之間的修復(fù)再生產(chǎn)生新的酚類化合物。白海娜等人[42]用聯(lián)合指數(shù)評(píng)價(jià)了多糖和多酚類化合物的協(xié)同抗氧化性，原花青素+黑木耳多糖、白藜蘆醇+黑木耳多糖在DPPH和ABTS模型中具有協(xié)同抗氧化性，咖啡酸+黑木耳多糖、兒茶素+黑木耳多糖在DPPH中有協(xié)同抗氧化性。這些組合具有協(xié)同抗氧化性可能有兩個(gè)原因：一是與自身結(jié)構(gòu)有關(guān)，二是兩種抗氧化劑相互作用產(chǎn)生新的抗氧化物質(zhì)。

4 協(xié)同作用的響應(yīng)面優(yōu)化

響應(yīng)曲面法(RSM)常被食品工業(yè)用于開(kāi)發(fā)和優(yōu)化新產(chǎn)品和工藝，已有研究將該方法用于協(xié)同抗氧化性的實(shí)驗(yàn)中[43]。圖2為響應(yīng)面優(yōu)化示意圖，最高點(diǎn)為最大協(xié)同系數(shù)值，底面坐標(biāo)可以得到各物質(zhì)的最優(yōu)濃度。響應(yīng)曲面法可以檢查兩種化合物之間所有可能的組合，從而可以確定抗氧化劑之間的協(xié)同性，并得到最大協(xié)同系數(shù)以及對(duì)應(yīng)的濃度配比。孫玥等人[44]通過(guò)響應(yīng)曲面分析分別得到了阿魏酸、根皮素和VE在DPPH、ABTS和FRAP模型中的最大協(xié)同系數(shù)以及對(duì)應(yīng)的物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)。通過(guò)響應(yīng)面的優(yōu)化處理可以找到一個(gè)最佳的復(fù)配比例，這在配方應(yīng)用中具有很大的潛力。

圖2 響應(yīng)面優(yōu)化示意圖

5 總結(jié)與展望

具有抗氧化活性的天然成分越來(lái)越受到人們的關(guān)注，食用含有抗氧化活性成分的食物可以延緩衰老，提高人體免疫力。而具有協(xié)同性的兩種或多種抗氧化劑的聯(lián)合使用不僅可以有效提高體系的抗氧化活性，還可以大大降低產(chǎn)品的成本，因而成為食品等諸多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。濃度是物質(zhì)間是否具有協(xié)同性的一個(gè)重要因素，任何一種抗氧化劑濃度的改變都會(huì)對(duì)體系的協(xié)同抗氧化作用產(chǎn)生影響。

在過(guò)去的研究中，抗氧化活性物質(zhì)之間具有協(xié)同性已經(jīng)被研究證實(shí)，采用多種抗氧化劑共同作用可以有效提高抗氧化能力，但是抗氧化劑間最大協(xié)同性下的濃度配比尚未進(jìn)行充分研究。不同抗氧化劑之間的相互作用會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)的活性，所以響應(yīng)曲面優(yōu)化具有重要意義。最佳濃度配比的得出，對(duì)于優(yōu)化食品添加劑或藥物配方，提高經(jīng)濟(jì)效益具有重要指導(dǎo)意義。由于協(xié)同性在不同的氧化模型中結(jié)果有差異，所以在實(shí)驗(yàn)時(shí)宜采用多種模型來(lái)驗(yàn)證。在今后的實(shí)驗(yàn)中，有必要開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)從而進(jìn)一步闡釋其相互作用機(jī)制。