國產(chǎn)藥物輔料磺丁基倍他環(huán)糊精鈉的注射安全性研究

申 健，孫 濤

(1.濰坊學(xué)院 化學(xué)化工與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濰坊 261061；2.復(fù)旦大學(xué) 藥學(xué)院，上海 201203)

0 引言

新冠疫情(COVID-19)仍在全球肆虐。2020年5月1日，美國食品藥品管理局(U.S.Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)授予“吉利德科學(xué)”公司的抗病毒藥物——瑞德西韋以緊急使用權(quán)，用于新冠的臨床治療[1]。SBCD(圖1(a))是瑞德西韋的主要成藥輔料，在瑞德西韋藥物分子制劑化過程中起到了重要的增溶、保護等作用。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)的數(shù)據(jù)，瑞德西韋的12%(重量/體積比)由SBCD構(gòu)成[2]。

圖1 (a)SBCD的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖；(b)SBCD與客體藥物通過分子識別作用形成包合物的過程

SBCD是美國“Cydex”公司開發(fā)出的倍他環(huán)糊精的重要衍生物[3]。SBCD是由1,4-丁烷磺內(nèi)酯與倍他環(huán)糊精羥基發(fā)生取代反應(yīng)制備，其上市產(chǎn)品的平均取代度為6.2-6.9。SBCD具備良好的水溶性，溶解度超過50 g；其生物穩(wěn)定性優(yōu)于母體倍他環(huán)糊精；且其對小分子藥物的包合力更強；腎毒性更低，溶血性和生物刺激性均較小。因此，SBCD被廣泛應(yīng)用于提高許多小分子藥物的注射成藥性能[4]。但SBCD的生產(chǎn)及銷售，長期以來被匈牙利Cyclolab公司壟斷，是我國一款著名的被“卡脖子”的藥用輔料產(chǎn)品。在當(dāng)今復(fù)雜國際形勢下，開發(fā)、研究和實現(xiàn)國產(chǎn)化的SBCD，顯得尤為重要。近年來經(jīng)過不斷努力，國產(chǎn)SBCD的生產(chǎn)制備等有了新突破，特別是國內(nèi)最大的環(huán)糊精類產(chǎn)品生產(chǎn)公司——山東濱州智源生物科技有限公司，在環(huán)糊精的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究領(lǐng)域有了顯著進展。進一步縮小與國外先進輔料產(chǎn)品在各方面的差距，是當(dāng)前亟待研究的課題。

從新藥研發(fā)角度看，人類使用的藥品及輔料都必須經(jīng)過嚴(yán)格的毒理實驗測試，前期需采用動物實驗進行安全性評價，以證明其對人體無急、慢性毒性，且無致癌、致病、致畸、致毒、致突變、致殘的作用[4]。SBCD主要通過包合作用增溶和穩(wěn)定小分子藥物，這種超分子主客體式成藥形式(一般是1∶1的摩爾比，圖1(b))，而SBCD分子量一般大于常見小分子藥物，這注定在成藥過程中SBCD用量相比于其他類型的藥用輔料要大得多。加上SBCD可直接用于注射劑型，因此對其毒理學(xué)研究是非常有必要性的。鑒于國產(chǎn)SBCD仍屬于“卡脖子”級產(chǎn)品，其安全性和大劑量注射研究，成為制約其推廣的瓶頸，本課題的開展顯得尤為重要。

1 材料和方法

1.1 藥物、試劑與器械

SBCD為山東濱州智源生物科技有限公司生產(chǎn)，批號SB20200413、SB20200505、SB20200517，生產(chǎn)日期為2020年4-5月，有效期至2022年4-5月。0.9%生理鹽水，自配；75%酒精，自配；1 mL注射器；40 mL灌注注射器；大鼠固定籠。

1.2 動物

清潔級SPF級SD大鼠25只，雄性13只，雌性12只。飼養(yǎng)溫度：20-23 ℃，濕度：50%-60%，試驗前大鼠禁食(不禁水)12 h。

1.3 SBCD取代度的測定

利用美國藥典中推薦SBCD測定標(biāo)準(zhǔn)的毛細管電泳的方法來檢測SBCD取代度[5]。具體如流動相：乙腈：0.1 M硝酸鉀水溶液(1:4，體積比)；待檢測SBCD溶液濃度：10 mg/mL；檢測器：示差折光檢測器；檢測器溫度：35±2 ℃；分離柱：7.8 mm×30 cm分析柱，填充L37填料；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

1.4 紅細胞懸液的制備

SD雄性大鼠眼瞼取血3 mL，3000 r/min離心10 min去除血漿和纖維蛋白原等，留沉淀紅細胞，再加入10倍量的生理鹽水，重復(fù)離心步驟，反復(fù)洗滌三次，至上清液澄清無色，留得的紅細胞沉淀用生理鹽水配成2%的混懸液，待用。

1.5 溶血作用測定

用生理鹽水分別配置濃度為10、20、50、100、150 mg/mL的磺丁基-β-環(huán)糊精溶液，EP管中加入200 μL紅細胞懸液和800 μL SBCD溶液，搖勻后，置于37 ℃中緩慢搖晃1 h，將溫育好的試管溶液以3000 r/min離心10 min后，取上清液轉(zhuǎn)入96孔板中，用酶標(biāo)儀讀取每個試管溶液的OD值，選擇的波長為545 nm，陽性對照為蒸餾水，陰性對照為生理鹽水。用下面方程式計算溶血率

n=(ODt-ODnc)/(ODpc-ODnc)×100%，

其中ODt為受試管吸光度；ODnc為陰性管吸光度；ODpc為陽性吸光度。

1.6 細胞培養(yǎng)

HEK-293細胞用含10%胎牛血清和100 IU/mL的雙抗(青霉素-鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，飽和濕度5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合度達到70%-80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代或制成單細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 SBCD對HEK-293細胞存活率的影響

取對數(shù)生長期的HEK-293細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×103個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，將96孔板置于37 ℃，飽和濕度5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待其貼壁完全后，每孔分別更換濃度為150、100、50、20、10 mg/mL的兩個批次和原研SBCD培養(yǎng)基溶液，設(shè)置空白孔(無細胞培養(yǎng)基)和對照空(有細胞，但培養(yǎng)基內(nèi)不加SBCD)，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8 增強型溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，利用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在450 nm波長處的光密度OD值。則細胞存活率m為

m= [(As-Ab)/(Ac-Ab)] ×100%，

其中As為實驗孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、環(huán)糊精)的吸光度；Ac為對照孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、無環(huán)糊精)的吸光度；Ab為空白孔(不含細胞和環(huán)糊精的培養(yǎng)基、 CCK-8)的吸光度。

1.8 高濃度SBCD注射液配置

SBCD注射液現(xiàn)配現(xiàn)用。精確稱取SBCD25 g，加入到30 mL、0.9%的生理鹽水中，在室溫、避光下超聲2 h，溶解至完全澄清透明狀態(tài)，避光儲存在4 ℃冰箱中。

1.9 大鼠的大劑量靜脈注射實驗

大劑量靜脈注射預(yù)實驗：先取清潔級SD大鼠4只，體重190-210 g，雌雄各半。注射前大鼠稱重，利用大鼠固定裝置固定大鼠，75%酒精消毒尾靜脈，尾靜脈注射給藥(3000 mg/kg體重)，每周給藥一次，給藥時觀察大鼠反應(yīng)，給藥后觀察大鼠行為，給藥2次。給藥2周內(nèi)觀察大鼠生存率。

大劑量靜脈注射實驗：取清潔級SD大鼠25只，雄性13只，雌性12只，體重190-210 g。注射前大鼠稱重，利用大鼠固定裝置固定大鼠，75%酒精消毒尾靜脈，以1.0 mL/250 g尾靜脈注射0.9%生理鹽水，注射速度為0.5 mL/min，每周給藥1次，給藥時觀察大鼠反應(yīng)，給藥后觀察大鼠行為，給藥2次。給藥2周內(nèi)觀察大鼠生存率。

1.10 大鼠的大劑量靜脈注射后灌流實驗

將大鼠以10%水合氯醛(0.3-0.4 mL/100 g)或戊巴比妥鈉(5-6 mg/100 g)麻醉。切勿麻醉過量，否則大鼠可能在灌流前死亡。大鼠麻醉后，沿劍突上剪開0.5 cm皮膚，鈍性分離，不要隨意剪以防出血，出血量過大會直接影響灌流效果。后再剪開皮膚、暴露肌層，而后仍需鈍性分離肌層暴露肋骨，用有齒鑷將肋骨提起，U字型剪開、翻起后以血管鉗固定，此時心臟暴露，用眼科剪將心尖部剪裂，用平頭灌注針從心尖裂處稍用力即刺入左心室，順勢上探，遇脫空感則為入主動脈。灌流前用生理鹽水沖洗輸液器并排掉氣泡。打開輸液器后，開始灌注37 ℃溫生理鹽水，見右心耳明顯充盈后，將右心耳剪開后使血涌出。灌注前20 s，維持速度60-80滴/min，防止初期灌注過快沖破肺部血管致使口鼻出水，使灌流效果不佳；之后控制在150-180滴/min，在灌流400 mL生理鹽水(含150 μL肝素注射液)后，后迅速換上4℃的多聚甲醛(4%)生理鹽水溶液，約20-40 s內(nèi)可見大鼠全身明顯抽動，約30-60 s后漸止，多聚甲醛灌注應(yīng)先快后慢，前3-5 min以同生理鹽水的速度灌，而后可控制于60-90滴/min，灌流結(jié)束后需將組織取出，置于4 ℃的多聚甲醛(4%)生理鹽水溶液中后固定24 h，之后石蠟切片并利用蘇木精-伊紅染色法 (Hematoxylin-eosin staining，HE) 染色，利用顯微鏡觀察HE染色結(jié)果。

2 結(jié)果和討論

2.1 SBCD取代度研究

倍他環(huán)糊精是由7個D-吡喃葡萄糖構(gòu)成的環(huán)狀低聚糖，每個葡萄糖殘基上有3個可被取代的羥基(分別是1、2、6位)，而SBCD是由倍他環(huán)糊精作為反應(yīng)原料，在堿性條件下，羥基被1,4-丁烷磺酸內(nèi)酯烷基化的鈉鹽[6]。因此，不同的投料比、加料順序和反應(yīng)溫度等條件不同，會導(dǎo)致SBCD的取代度有區(qū)別。隨著SBCD取代度的不同，其包合性能、穩(wěn)定性，乃至下游溶血性、安全性等參數(shù)或性能也均會不同[7]。我們利用毛細管電泳的方法，檢測了原研和國產(chǎn)SBCD的取代度的差別。由圖2結(jié)果可以看出，原研和國產(chǎn)SBCD的取代度差別不大，峰形略有細微差異，峰值取代度均在7左右。因此理論上，原研和國產(chǎn)SBCD對同一小分子藥物的包合性能差別不大。

圖2 原研和國產(chǎn)SBCD(批號SB20200413)的取代度比較結(jié)果

2.2 溶血性

環(huán)糊精類衍生物在用于注射給藥輔料時，安全性是需考慮的第一因素。盡管FDA已經(jīng)批準(zhǔn)其在食品和藥品中的應(yīng)用，但在內(nèi)部報告中仍提到：考慮到環(huán)糊精類衍生物溶血性，對其參與的注射劑型需額外慎重[8]。紅細胞破裂，血紅蛋白逸出稱為紅細胞溶解，簡稱溶血。溶血指標(biāo)是輔料用于注射劑型前一個非常重要的參考依據(jù)[9]。在輔料生物相容性測試時，如出現(xiàn)嚴(yán)重溶血行為，則該測試輔料不能用于注射劑型。根據(jù)《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》，輔料的溶血性測試遵循隨機、對照、重復(fù)的原則來進行，觀察測試輔料對受試動物紅細胞的影響。

SBCD濃度小于50 mg/mL時，試管紅細胞全部下沉，上清液呈現(xiàn)無色澄明狀態(tài)，無溶血現(xiàn)象出現(xiàn)。濃度為100、150 mg/mL時，溶液呈淡紅色，管底有紅細胞殘留。國產(chǎn)批號SB20200413、SB20200505、原研組濃度為150 mg/mL時，溶血百分比分別為13.7%，16.3%，14.5%。結(jié)果如下。

圖3 不同濃度的SBCD濃度的溶血百分比

智源提供的兩批SBCD產(chǎn)品在50 mg/mL時，仍展現(xiàn)了令人滿意的有限溶血行為。與原研相比，所有數(shù)據(jù)點均無統(tǒng)計學(xué)差異。SB20200505批次，溶血性能甚至優(yōu)于原研產(chǎn)品。該實驗初步為智源SBCD產(chǎn)品，可用于注射劑輔料提供了進一步佐證。

輔料的本身性質(zhì)、雜質(zhì)、pH、無機鹽(引起滲透壓變化)等均可能導(dǎo)致溶血，本實驗的進行，驗證了智源提供的兩批SBCD產(chǎn)品在以上指標(biāo)中均不亞于原研產(chǎn)品。

2.3 腎毒性

人胚胎腎細胞293(HEK-293)，是一個衍生自人胚胎腎細胞的細胞系。對HEK-293的細胞毒性進行研究，可用于初步表征藥物輔料對人體正常組織、特別是腎組織的生理毒性[10]。三組細胞存活率隨SBCD濃度升高逐漸降低，SBCD濃度10 mg/mL時，孵育24 h后細胞存活率大于80%，各組之間的細胞存活率并未存在顯著差異(圖4)。

圖4 不同濃度的SBCD的細胞存活率

智源提供的兩批SBCD產(chǎn)品在10 mg/mL時，HEK-293細胞仍有80%以上存活，證明了其較低的細胞毒性。與原研相比，所有數(shù)據(jù)點均無統(tǒng)計學(xué)差異。該實驗初步為智源SBCD產(chǎn)品，在用于注射劑輔料時，不會造成生理毒性提供了進一步佐證。

2.4 超大劑量注射安全性

SBCD可作為增強生物相容性、絡(luò)合劑、增溶劑、滲透劑、穩(wěn)定劑、片劑或膠囊劑的稀釋劑、粘度增加劑和降低水的活性等，用于注射劑、口服固體制劑、眼用制劑、鼻內(nèi)制劑、吸入劑和外用制劑，還可以作為滲透壓劑或增溶劑用于控制制劑等。

因為SBCD分子量較大，所包裹的藥物一般都是小分子化合物，一般是1:1應(yīng)用進行包合[11]。因此，如果后期進行靜脈給藥的話，環(huán)糊精的用量會比真正的發(fā)揮療效的藥用量大的多。因此，對SBCD的生物安全性，特別是大劑量注射的安全性考察，顯得尤為重要[12]。因此本項研究中，選取了超大劑量的SBCD劑量(3000 mg/kg體重，遠遠大于常規(guī)注射所需濃度)[13]，直接注射進動物體內(nèi)觀察動物的生存和主要臟器變化。如此劑量被證實安全，可順延推測低于此劑量的SBCD的生物安全性也是良好的。綜合前期實驗中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)秀的耐溶血性，可結(jié)合在一起得到SBCD大劑量注射的安全性良好的結(jié)論。

表1 大鼠靜脈注射大劑量給藥預(yù)實驗結(jié)果

表2 大鼠靜脈注射大劑量給藥正式實驗結(jié)果

第1周給藥：25只大鼠第一次給藥完畢后，3000 mg/kg體重。尾靜脈打藥時大鼠比較暴躁，可能與濃度大時有一定滲透壓刺激性有關(guān)。生存率100%。給藥后大鼠正常進食飲水，無反?，F(xiàn)象。

第2周給藥：尾靜脈打藥時大鼠仍然比較暴躁。生存率仍是100%。大鼠體重穩(wěn)步上升，24 h內(nèi)監(jiān)測體溫，無顯著性變化。但是需要注意的是：6只大鼠(24%)給藥尾部部位出現(xiàn)紅腫、皮膚輕度潰爛現(xiàn)象。

第3周給藥：尾靜脈打藥時大鼠比較暴躁。生存率仍是100%。大部分大鼠體重穩(wěn)步上升，24 h內(nèi)監(jiān)測體溫，無顯著性變化。給藥后大鼠尾部出現(xiàn)輕微顫抖現(xiàn)象。

20只大鼠(80%)給藥尾部部位出現(xiàn)紅腫、皮膚輕、中度潰爛現(xiàn)象。因此可以認(rèn)為，磺丁基-β-環(huán)糊精鈉生物相容性良好，即時是超大劑量下也不會出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。但是超大劑量下SBCD會導(dǎo)致給藥溶液膠體滲透壓上升，致使給藥部位有一定刺激性，在用藥時需要注意少量多次、低滲溶液配制藥物等操作。經(jīng)動物倫理委員會動物福利準(zhǔn)則評估，給藥3次后，如再次給藥會導(dǎo)致動物較強疼痛感，不適合繼續(xù)給藥，因此將給藥次數(shù)停留在3次。以上結(jié)果均表明表明SBCD靜脈給藥安全度較大，為注射用藥的包合輔料的臨床應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

環(huán)糊精本身是有淀粉經(jīng)酶發(fā)酵所得，屬于典型的低聚糖結(jié)構(gòu)。某些細菌(如大腸桿菌)，有可能利用環(huán)糊精或其衍生物作為碳源，進行繁殖，因此熱源是環(huán)糊精系列產(chǎn)品的重要控制指標(biāo)。本實驗中，給藥前后大鼠體溫均無明顯變化，證明智源生產(chǎn)的SBCD熱原控制良好。

給藥周期結(jié)束后，大鼠麻醉后分別經(jīng)生理鹽水和4%多聚甲醛灌流，包括心肝脾肺腎等主要臟器解剖切片后，經(jīng)HE染色結(jié)果如下。經(jīng)分析，主要臟器無明顯異?，F(xiàn)象(圖5)。

圖5 超大劑量SBCD尾靜脈給藥(批號SB20200517)三周后主要臟器的HE染色處理結(jié)果(放大400倍)，(a)-(e)分別為心、肝、脾、肺、腎(比例尺為25 μm)

3 結(jié)論

進一步發(fā)展我國“卡脖子”的技術(shù)，是當(dāng)前國內(nèi)科研界孜孜不倦追求的目標(biāo)。SBCD作為一種在藥物制劑領(lǐng)域需求量巨大，效果良好的材料，其國產(chǎn)化的目標(biāo)，在當(dāng)今科研和國際形勢下顯得尤為迫切，而制劑材料的安全性為首要考慮因素[13]。本文對國產(chǎn)的SBCD的取代度、溶血行為、對腎上皮細胞毒性，以及超大劑量靜脈注射安全性等關(guān)鍵數(shù)據(jù)和指標(biāo)進行了評估。我們研究發(fā)現(xiàn)，山東濱州智源生物科技公司，作為國內(nèi)環(huán)糊精生產(chǎn)和應(yīng)用領(lǐng)域的領(lǐng)軍者，其生產(chǎn)的SBCD的安全性能指標(biāo)上，基本已達到或超過了Cydex公司原研水平，這為打破國外公司對該關(guān)鍵產(chǎn)品的壟斷，奠定了重要基礎(chǔ)。