酵母菌發(fā)酵制備葛根酵素的工藝研究

朱德艷

摘 要：以葛根為原料，酵母菌為發(fā)酵菌種，在考察發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵初始pH和接種量的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳工藝。結(jié)果表明，最佳工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間72h、發(fā)酵溫度29℃、發(fā)酵初始pH5.5、酵母菌接種量3%。在此條件下，α-淀粉酶活力為33.56U/mL。

關(guān)鍵詞：酵母菌;葛根酵素;工藝

中圖分類號(hào) TS201.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）13-0149-04

1 引言

葛根為豆科植物的干燥根，是我國(guó)傳統(tǒng)的常用中藥材之一，藥食兩用，其化學(xué)成分主要有黃酮類、三萜皂苷類、葛酚苷類、香豆素類、有機(jī)酸等[1]。葛根味干、辛，性涼，歸肺、胃經(jīng)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有解肌退熱、生津止渴、升陽止瀉之功效，是臨床應(yīng)用較為廣泛的一種中藥材[2]。葛根中富含黃酮類化合物，是一種天然的水溶性色素，具有降血脂、增強(qiáng)免疫力等多種功效。現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，葛根具有抗心律失常、降血壓作用、抗腫瘤作用、降糖降脂、解酒護(hù)肝、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、改善骨質(zhì)疏松等作用[3-5]。葛根中含有大量膳食纖維，可調(diào)理腸胃，有助于排出體內(nèi)毒素;長(zhǎng)期食用還可以使皮膚光滑，起到美容養(yǎng)顏的效果。近年來，隨著人們生活水平質(zhì)量的提高，越來越多的人們?cè)谏钪卸己茏⒅貭I(yíng)養(yǎng)與保健，進(jìn)而對(duì)于食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的要求越來越高。于是，葛根逐漸出現(xiàn)在大眾的視野中，因其具有多種功效及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，使其適合于各類人群食用。如今，各種葛根類在市場(chǎng)的產(chǎn)品層出不窮，葛根粉、葛根混合飲料以及葛根系加工產(chǎn)品。

酵素是采用一種或多種原料，經(jīng)有益菌發(fā)酵的含有多種酶和次級(jí)代謝產(chǎn)物等成分的發(fā)酵產(chǎn)品[6]。酵素是一類特殊的具有催化功能的復(fù)雜蛋白質(zhì)，部分由人體自身生成，部分由飲食補(bǔ)充。酵素具有促進(jìn)新陳代謝、促進(jìn)血液循環(huán)、保護(hù)腸道、調(diào)節(jié)人體酸堿平衡、抗氧化、抗疲勞等功能[7-9]。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，越來越多的人都很注重提高自身的健康水平，而“體內(nèi)酵素的性能和數(shù)量”是衡量健康的一項(xiàng)重要指標(biāo)?，F(xiàn)今，酵素發(fā)展迅速，但我國(guó)大陸地區(qū)有關(guān)酵素的研究尚處于起步階段，與發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)相比，仍有較大差距，國(guó)外的食用酵素產(chǎn)品種類多且在國(guó)內(nèi)的售價(jià)普遍昂貴。盡管如此，酵素類產(chǎn)品依然很受歡迎，將可藥用和食用的葛根制備的葛根酵素，結(jié)合葛根的藥性和酵素的特性，具有良好營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功效。因此，葛根酵素的發(fā)展前景可觀，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊。

本試驗(yàn)利用葛根為主要原料，以酵母菌為菌種進(jìn)行發(fā)酵，以發(fā)酵過程中α-淀粉酶活力為指標(biāo)，發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度，發(fā)酵液pH值，菌種的接種量為條件，測(cè)定發(fā)酵最適條件，以優(yōu)化葛根酵素的制備工藝。

2 材料與方法

2.1 材料、試劑與儀器

2.1.1 材料與試劑 葛根：湖北省仙之靈有限公司;酵母菌：安琪酵母股份有限公司;α-淀粉酶：天津市福晨化學(xué)試劑廠;白砂糖：武漢綠福食品有限公司;白砂糖：武漢綠福食品有限公司;麥芽糖（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠檸檬酸（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠;磷酸氫二鈉（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠可溶性淀粉（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠;酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠;氫氧化鈉（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠;3，5-二硝基水楊酸（化學(xué)純）：上海展云化工有限公司。

2.1.2 試劑配制 （1）標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液：精確稱取麥芽糖0.1g，用蒸餾水溶解定容至100mL。（2）0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液：稱取檸檬酸5.78g，檸檬酸鈉21.32g，加蒸餾水定容至1000mL（取磷酸氫二鉀/鈉45.3g、檸檬酸7.74g）。（3）淀粉溶液1%：由1g淀粉溶液溶于緩沖液中定容至100mL。（4）3，5-二硝基水楊酸溶液：精確稱取3，5-二硝基水楊酸1g，溶于20mL NaOH（2mol/L）溶液中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100mL。蓋緊瓶塞，防止CO2進(jìn)入。

2.1.3 試驗(yàn)儀器 恒溫?fù)u床PH20，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱DH-600，北京科偉永興儀器有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋YC10-18L，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司;恒溫水浴鍋DK-98-1，亞榮生化儀器廠;電子天平JY1002，上海上天精密有限公司。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 工藝流程 工藝流程如下：

葛根→清洗→粉碎→干燥→糖化→酶解→調(diào)糖→滅菌→接種→發(fā)酵→葛根酵素

↓

（酵母菌）

（1）葛根處理：將葛根進(jìn)行清洗、去蟲眼以及去皮處理，切丁，于50℃干燥箱中進(jìn)行干燥，干燥完成后進(jìn)行粉碎過篩，將粉碎后的葛根粉與蒸餾水按比例1∶10（g/mL）混合，煮沸糖化1h。

（2）酶解、調(diào)糖：向糖化好的葛根試液中加入α-淀粉酶酶解，添加量為14U/g，在50℃的水浴中進(jìn)行酶解2h。酶解完成后按照1∶10的比例加入白砂糖調(diào)節(jié)葛根溶液的糖度。

（3）菌種活化：將活性干酵母菌按比例1∶10于蒸餾水中經(jīng)行溶解，放入到30～35℃糖水中，恒溫水浴，放置30min后備用。

（4）滅菌：采用高壓蒸汽滅菌法對(duì)葛根試液進(jìn)行滅菌，121℃滅菌15min后冷卻至室溫備用。

（5）接種：將已經(jīng)處理好的葛根試液按照試驗(yàn)中的要求接種酵母菌。

（6）發(fā)酵：將接種后的葛根試液在試驗(yàn)要求的時(shí)間和溫度等條件下進(jìn)行靜置發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定α-淀粉酶活力。

2.2.2 α-淀粉酶酶活力測(cè)定

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6支試管，按表1進(jìn)行操作，以1號(hào)試管作為空白，沸水浴5min后，用蒸餾水冷卻定容至25mL，在540nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。以麥芽糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2.2 發(fā)酵液中α-淀粉酶活力的測(cè)定 取1mL的發(fā)酵液于試管中，放入40℃水浴保溫5min，再加入1mL淀粉溶液（預(yù)先40℃保溫5min）然后再40℃水浴保溫10min，之后加入2mLDNS進(jìn)行沸水浴5min，最后用蒸餾水定容至25mL于540nm測(cè)吸光度。

以1mL的發(fā)酵液中的淀粉酶，在40℃時(shí)，1min生成1mg的還原糖為1個(gè)酶活力單位（U）。

計(jì)算公式：

[α-淀粉酶活力（U/mL）=C×N10]

式中：N—酶液稀釋倍數(shù);

10—反應(yīng)時(shí)間;

C—麥芽糖濃度

2.2.3 葛根酵素發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.2.3.1 發(fā)酵時(shí)間 向滅菌冷卻后的葛根試液中接入3%的酵母菌，29℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為24h、48h、72h、96h、120h，144h，測(cè)定α-淀粉酶活力，確定酵母菌發(fā)酵葛根酵素的最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.2.3.2 發(fā)酵溫度 在滅菌冷卻后的葛根試液中接入3%的酵母菌，發(fā)酵溫度確定為25℃、27℃、29℃、31℃、33℃，發(fā)酵72h，測(cè)定α-淀粉酶活力，確定最佳的發(fā)酵溫度。

2.2.3.3 發(fā)酵液初始pH 對(duì)已經(jīng)滅菌冷卻好的葛根試液分別調(diào)節(jié)pH在4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，分別接入3%的酵母菌，在29℃條件下，發(fā)酵72h，測(cè)定α-淀粉酶活力，確定發(fā)酵的最適pH。

2.2.3.4 菌種接種量 向滅菌冷卻后的葛根試液中分別接入接種量為2%、3%、4%、5%、6%的酵母菌，調(diào)節(jié)pH5.0后，在29℃條件下發(fā)酵72h，測(cè)定α-淀粉酶活力，確定最佳的接種量。

2.2.4 葛根酵素發(fā)酵正交試驗(yàn) 在酵母菌發(fā)酵葛根酵素單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液的pH值和接種量4個(gè)因數(shù)為考察對(duì)象，以α-淀粉酶活力為指標(biāo)，確定酵母菌發(fā)酵葛根酵素的最佳工藝條件（見表2）。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，麥芽糖含量與吸光度成正比關(guān)系，回歸方程為：y=0.1438x+0.0034（R2=0.9721）。

3.2 不同發(fā)酵條件對(duì)α-淀粉酶活力的影響

3.2.1 發(fā)酵時(shí)間 向滅菌冷卻后的葛根試液中接入3%的酵母菌，29℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間設(shè)為24h、48h、72h、96h、120h，144h，測(cè)定α-淀粉酶活力，結(jié)果見表3。

從圖2可以看出：當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24h時(shí)，葛根酵素中α-淀粉酶活力較低;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72h時(shí)，葛根酵素中α-淀粉酶活力達(dá)到19.50U/mL;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間更長(zhǎng)時(shí)，葛根酵素中α-淀粉酶活力有所下降。分析其原因短時(shí)間的發(fā)酵處理還沒有起到促進(jìn)菌種細(xì)胞生長(zhǎng)，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵時(shí)間有益于酵母菌菌種的生長(zhǎng)繁殖，對(duì)葛根酵素發(fā)酵過程更有益處，但隨著發(fā)酵處理時(shí)間延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗，作用就有所下降。因此，最適發(fā)酵時(shí)間為72h。

3.2.2 發(fā)酵溫度 發(fā)酵溫度分別設(shè)為為25℃、27℃、29℃、31℃、33℃，發(fā)酵72h后測(cè)定α-淀粉酶活力，結(jié)果見表4和圖3。

從表4和圖3可以看出：當(dāng)發(fā)酵溫度為25℃時(shí)，葛根酵素中α-淀粉酶活力較低，當(dāng)溫度上升到29℃時(shí)，酶活力達(dá)到22（U/mL）;隨著溫度的升高，葛根酵素中α-淀粉酶活力有所下降。分析其原因：當(dāng)溫度處于較低水平時(shí)，酵母菌活力還不是很旺盛;當(dāng)溫度適當(dāng)上升時(shí)，其產(chǎn)物合成能力提高;溫度過高，對(duì)酵母菌活力起到抑制作用，其工作能力下降。因此，最適發(fā)酵溫度為29℃。

3.2.3 發(fā)酵初始pH值 發(fā)酵液初始pH值分別設(shè)為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，接入3%的酵母菌，在29℃條件下，發(fā)酵72h，測(cè)定α-淀粉酶活力，結(jié)果見表5和圖4。

從圖4可以看出：當(dāng)初始pH值為4.5時(shí)，葛根酵素中α-淀粉酶活力較低，當(dāng)pH值上升到5.5時(shí)，葛根酵素中α-淀粉酶活力達(dá)到19.50（U/mL）;隨著pH值不斷上升，葛根酵素中α-淀粉酶活力有所下降。分析其原因：當(dāng)pH較低時(shí)，酵母菌的活性不是非常旺盛，適當(dāng)提高pH值有助于酵母菌的發(fā)酵，而過多增加pH將會(huì)對(duì)酵母菌合成產(chǎn)物造成抑制。因此，最適發(fā)酵pH值為5.5。

3.2.4 接種量 向發(fā)酵液中分別接入2%、3%、4%、5%、6%的酵母菌，調(diào)節(jié)pH5.0后，在29℃條件下發(fā)酵72h，測(cè)定α-淀粉酶活力，結(jié)果見表6和圖5。

從表6和圖5可以看出：當(dāng)接種量為2%時(shí)，葛根酵素中α-淀粉酶活力較低，當(dāng)接種量增加至5%時(shí)，葛根酵素中α-淀粉酶活力達(dá)到23.25（U/mL）;隨著接種量的逐漸增加，葛根酵素中α-淀粉酶活力有所下降。分析其原因：接種量較少時(shí)，菌種數(shù)量少，利用葛根生產(chǎn)酵素的效率較弱，而當(dāng)接種量適當(dāng)提高，加大了酵母菌合成的效率，但由于葛根原料是固定的，繼續(xù)提高接種量，導(dǎo)致酵母菌無法得到充足的營(yíng)養(yǎng)，合成產(chǎn)物的能力下降。因此，最適接種量為5%。

3.3 葛根酵素發(fā)酵的工藝優(yōu)化 正交試驗(yàn)結(jié)果見表7。從表7可以看出，酵母菌發(fā)酵制備葛根酵素的最佳組合為A2B2C3D1，即發(fā)酵時(shí)間72h、發(fā)酵溫度29℃、發(fā)酵初始pH5.5、酵母菌接種量3%，4個(gè)因素影響大小為A>C>B>D，即：發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵初始pH值>發(fā)酵溫度>酵母菌接種量。在最佳條件下，α-淀粉酶活力大小為33.56U/mL，高于正交試驗(yàn)中的其他組合。

4 結(jié)論

以葛根為原材料制備葛根酵素，在單因素和正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定了酵母菌發(fā)酵葛根制備酵素產(chǎn)α-淀粉酶活力的最佳條件組合，即發(fā)酵時(shí)間72h、發(fā)酵溫度29℃、發(fā)酵初始pH5.5、酵母菌接種量3%。在此條件下，α-淀粉酶活力為33.56U/mL。

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（責(zé)編：張宏民）