‘冬美人’愈傷組織誘導研究

尹立輝 宛倩 劉歡歡 高慧喆 苑軒楠 劉暢

摘 要：以‘冬美人（Pachyveria pachyphytoides Walth）的外植體進行愈傷組織誘導，從不同外植體、消毒方式、激素濃度、光源等方面研究了‘冬美人外植體在誘導愈傷組織過程中適宜的培養(yǎng)條件與環(huán)境因素。結(jié)果表明，‘冬美人愈傷組織誘導最適宜的外植體為葉片;在消毒方式上，采用75%酒精中浸泡5s，0.1%HgCl2溶液浸泡10s，1.5%抗壞血酸溶液浸泡10s，可以大幅度減輕外植體褐化的程度，并且污染率也較低;不同類型光源，以日光燈培養(yǎng)效果最好，褐化程度也相對較輕;在激素配比上，最佳愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5mg/L+NAA1.0mg/L，誘導率為64%;在培養(yǎng)基中加入一定量的活性炭，可以少量減輕外植體的褐化程度。

關(guān)鍵詞：‘冬美人;愈傷組織;誘導率

中圖分類號 S567.239文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）13-0028-03

Abstract： Callus induction of Pachyveria pachyphytoldes Walth explants was studied. This experiment mainly from different explants， concentration of hormone， light intensity， concentration of additives， to study the winter beauty stem segments or blade in the induction of callus of the optimum culture conditions and environmental factors in the process. Through research and found that， on the choice of explant and winter beauty of tissue culture in callus induction suitable explant is young， but in training time stem section earlier callus induced; In terms of disinfection method，5s soaked with 75% alcohol，10s soaked with 1.5% ascorbic acid and 10s soaked with 0.1% HgCl2 can greatly reduce the degree of Browning light winter beauty， and the pollution rate is also low. Under the light intensity， under the light intensity around 1500lx， with the increase of time， the culture effect is the best and the Browning degree is relatively light. In the hormone mix， the optimal induction hormone is MS+ 6-BA 1.5 mg/L+NAA 1. 0 mg/L， the induction rate is 64%， in this case， the explants of winter beauty have less Browning degree and less pollution. The addition of activated carbon can effectively inhibit Browning， and the growth of its explants is good. In the culture medium without activated carbon， the explant obviously browned and died.

Key words： Pachyveria pachyphytoldes; Walth Callus; Induction rate

‘冬美人（Pachyveria pachyphytoides Walth），也被稱作東美人，為景天科、厚葉草屬和石蓮花屬雜交培育的園藝品種，喜溫暖、干燥和光照充足的環(huán)境，耐旱性強，葉形較美，株型美觀，應用方便。由于多肉植物的市場需求量大，高效大量的繁殖是解決上述問題的重要途徑。通過組培快繁體系的建立[1-4]，能有效解決繁殖系數(shù)較低、增殖速度較慢的問題。

1 材料與方法

選取‘冬美人新鮮、無病蟲害葉片和莖段，在整株植物的中上部剪取。以MS含蔗糖和瓊脂的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上根據(jù)設計的培養(yǎng)基配方，分別添加不同含量的植物生長調(diào)節(jié)劑和活性炭（見表1）。將配置好的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)瓶，每瓶約30mL，做好標記，于121℃下高溫滅菌20min，冷卻待用。培養(yǎng)溫度均為（25±1）℃，培養(yǎng)的光照強度為2000～4000Lx（光源為日光燈、LED紅藍燈），光照時數(shù)12h·d-1（每日6：00—18：00），空氣相對濕度40%～60%。培養(yǎng)基中均添加瓊脂13g·L-1，蔗糖30g·L-1，pH值為5.6～5.8。

采用‘冬美人葉片或莖段為外植體時，先用流水沖去表面的浮土，然后浸泡于加有適量清潔劑的水中3～5min并不斷攪拌，再用流水沖洗5～10min，用吸水紙吸取表面所帶的水分。放在底部有孔洞的小瓶中，在流水下沖洗30min，然后置于超凈工作臺上待用。

在超凈工作臺上先用75%的酒精浸泡，去離子水沖洗3遍，然后用0.1%HgCl2溶液浸泡，為了提高外植體活性，加入1～2滴吐溫80，去離子水沖洗3遍，因為存在褐化現(xiàn)象，隨后在1.5%抗壞血酸溶液中浸泡，去離子水沖洗3遍。外植體浸泡時間詳見表2。

將消毒后的‘冬美人葉片切成1cm2大小，莖段切成0.5cm長，接種于預先配制好的培養(yǎng)基上。每個處理接種30瓶，每瓶接種2～3塊，培養(yǎng)時間為30d，調(diào)查項目包括污染率、死亡率、褐化率、誘導率等。相關(guān)計算公式如下：

污染率（%）=污染個數(shù)/接種個數(shù)×100;

死亡率（%）=死亡個數(shù)/接種后未污染個數(shù)×100;

褐化率（%）=褐化個數(shù)/接種后未污染個數(shù)×100;

愈傷組織誘導率（%）=愈傷組織萌動個數(shù)/接種后未污染個數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體對愈傷組織形成的影響 以‘冬美人葉片和莖段為外植體，經(jīng)過消毒處理，在MS加不同比例激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。由表3可知，以莖段為外植體誘導愈傷組織污染率高于葉片，且外植體褐化現(xiàn)象更嚴重，而且在剪取材料時，葉片比莖段更易獲得。因此，在‘冬美人組織培養(yǎng)中愈傷組織誘導適宜的外植體是葉片。

2.2 不同消毒處理對愈傷組織形成的影響 由表4可知，不同的消毒方式及消毒時間對‘冬美人外植體污染率、死亡率及生長狀況有著明顯的差異。由于外植體較幼嫩，消毒時間過長會增加死亡率，特別是在75%酒精中的浸泡時間超過10s，則外植體死亡率超過80%，因此要嚴格控制浸泡時間，盡量控制在5s以內(nèi)。在接種后的觀察中發(fā)現(xiàn)，外植體褐化現(xiàn)象嚴重，因此在消毒過程中又采用1.5%的抗壞血酸溶液浸泡，對褐化現(xiàn)象有一定的抑制效果。綜上，應采取處理Ⅴ的消毒方式，即75%酒精中浸泡5s，0.1%HgCl2溶液中浸泡10s，1.5%抗壞血酸溶液中浸泡10s。

2.3 不同光源類型對愈傷組織形成的影響 由圖1可知，接種第3天，LED光源照明的培養(yǎng)瓶中外植體即開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。在接種第6天，除了日光燈光源外，其他光源培養(yǎng)中均出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，植物切口開始發(fā)黑。在接種第9天，在LED燈雙管光源條件下，褐化現(xiàn)象明顯加重，褐化率達到75%，且日光燈條件下也開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。在接完種12d后，出現(xiàn)褐化現(xiàn)象的外植體已經(jīng)接近死亡，培養(yǎng)基大面積焦黑。由此可見，LED紅藍燈光源下的外植體褐化現(xiàn)象較嚴重，而日光燈管光源處理的外植體褐化現(xiàn)象則明顯減輕。

2.4 不同激素濃度對愈傷組織形成的影響 以‘冬美人葉片為外植體，考察3種激素6-BA、NAA、2，4-D及不同濃度配比對‘冬美人愈傷組織誘導的影響，結(jié)果見表5。由表5可知，NAA和6-BA對‘冬美人愈傷組織誘導均有促進作用，而2，4-D則作用不明顯。當6-BA為1.5mg/L，且NAA濃度為1.0mg/L時，誘導率最高為64%，由圖2可知，誘導出的黃綠色緊密愈傷組織。因此，最佳愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5mg/L+NAA1.0mg/L。

2.5 不同活性炭濃度對愈傷組織形成的影響 在‘冬美人愈傷組織誘導研究中，外植體褐化是較常見的問題之一。如果褐化嚴重，會造成愈傷組織的部分死亡。因此，如何抑制褐化是‘冬美人愈傷組織誘導研究中的一個關(guān)鍵問題?；钚蕴烤哂形接泻ξ镔|(zhì)的能力，劉香江[5]、李鳳華[6]等均使用活性炭來抑制或減緩褐化，取得了較好的效果。本研究以葉片為外植體，在MS培養(yǎng)基中添加活性炭的濃度分別為0、1、3、5g/L，每組接種外植體20瓶。如表6所示，添加活性炭對褐化現(xiàn)象有一定的抑制作用，但并不明顯。

3 結(jié)論

3.1 結(jié)論 本研究結(jié)果表明：（1）最適宜的外植體是冬美人植株的葉片，以莖段為外植體誘導愈傷組織污染率高于葉片，且外植體褐化嚴重。（2）應采取處理Ⅴ的消毒方式，即75%酒精中浸泡5s，去離子水沖洗3次，0.1%HgCl2溶液中浸泡時間為10s，去離子水沖洗3次，1.5%抗壞血酸溶液中浸泡時間為10s，去離子水沖洗3次，吸干水備用。（3）LED紅藍燈管光源下的外植體褐化現(xiàn)象較嚴重，日光燈管光源處理的外植體褐化現(xiàn)象明顯減弱，因此，建議采用日光燈。（4）最佳愈傷組織誘導培養(yǎng)基為：MS+6-BA1.5mg/L+NAA1.0mg/L，誘導率為64%。（5）添加活性炭對褐化現(xiàn)象有一定的抑制作用，但并不明顯。

3.2 討論 外植體誘導過程中遇到褐化現(xiàn)象較嚴重，由產(chǎn)生褐化的原因可知，選擇適宜的外植體以及最佳培養(yǎng)條件，能從根本上減少褐化的發(fā)生概率。研究中采用了一些對于褐化現(xiàn)象常用的處理方法，例如，對于容易褐化的材料可間隔2～24h培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)瓶，這樣連續(xù)處理7～10d后，褐化現(xiàn)象會得到控制或大為減輕。在培養(yǎng)基中加入抗壞血酸（50～100mg/L）或檸檬酸（150mg/L）等抗氧化劑能夠較有效地避免或減輕褐化現(xiàn)象。添加0.1%～0.5%的活性炭等吸附劑，對防止褐化也有較明顯的效果。但是活性炭等吸附劑在吸附有毒物質(zhì)的同時，也會吸附其他營養(yǎng)物質(zhì)[5-7]。對于這一問題今后還需要進一步研究。

參考文獻

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（責編：張宏民）