1株降解黃曲霉毒素B1的解淀粉芽胞桿菌的分離鑒定及其體外脫毒效果

張曉靜，張楊楊，張曉峰，喬宏興，邊傳周*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，鄭州 450046； 2.微生物生物轉(zhuǎn)化中藥河南省工程實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450046； 3．河南省益生菌生物轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，鄭州 450046；4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450046)

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是一類有害的真菌毒素，主要包括黃曲霉和寄生曲霉代謝分泌的黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)及其衍生物黃曲霉毒素M1(AFM1)、黃曲霉毒素M2(AFM2)[1-2]，其中以AFB1毒性最強(qiáng)、性質(zhì)最穩(wěn)定[3-4]。黃曲霉毒素分布廣泛，糧食生產(chǎn)因?yàn)槊咕舅匚廴径鴵p失慘重，同時(shí)由于其強(qiáng)毒性和致癌性，嚴(yán)重威脅著人類和動(dòng)物的健康[5-7]。

自霉菌毒素被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，科研人員嘗試使用各種方法去除糧食和飼料中的毒素，傳統(tǒng)的霉菌毒素脫毒方法主要依靠物理法和化學(xué)法[8-10]。然而，這些方法在實(shí)際生產(chǎn)運(yùn)用中存在諸多缺陷，如脫毒效率低下、易降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率、毒素二次污染、影響飼料適口性等；同時(shí)由于部分脫毒工藝昂貴，難以規(guī)?；慨a(chǎn)，難以應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)[11-12]。相反，使用微生物降解法進(jìn)行脫毒，安全高效，特異性強(qiáng)，不影響飼料的感官品質(zhì)，且脫毒工藝經(jīng)濟(jì)可行[13-14]。近年來(lái)，利用微生物降解霉菌毒素受到廣大科研人員和養(yǎng)殖業(yè)的青睞，成為研究熱點(diǎn)。本研究以香豆素為唯一碳源，篩選出一批能高效降解AFB1的菌株，并對(duì)脫毒能力最優(yōu)的菌株進(jìn)行了鑒定，同時(shí)對(duì)該菌株發(fā)酵液中脫毒活性組分的脫毒效果進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 菌種及細(xì)胞來(lái)源

采集土壤、酸奶、動(dòng)物糞便、發(fā)霉糧食、發(fā)酵食品等作為待分離樣品，以及實(shí)驗(yàn)室保藏的芽胞桿菌、乳酸菌等菌株；雞肝癌細(xì)胞(LMH)，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)。

1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯(北京奧博星)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂(北京奧博星)，MRS培養(yǎng)基(青島日水)，馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星)，DMEM/F-12(1∶1)營(yíng)養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone)。初篩培養(yǎng)基為改良Hormisch[15]篩選培養(yǎng)基(g·L-1)：KNO30.5，KH2PO40.25，MgSO4·7H2O 0.25，(NH4)2SO40.5，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.003，CaCl2·2H2O 0.005，瓊脂20，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后加入過(guò)濾除菌的香豆素溶液，終濃度為1 g·L-1；種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B培養(yǎng)基(g·L-1)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，pH 7.0。

1.3 主要試劑及儀器

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉)，細(xì)菌生化鑒定管(青島海博)，AFB1ELISA檢測(cè)試劑盒(深圳芬德)，胰蛋白酶(美國(guó)Gibco)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化)，CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(日本Dojindo)，高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀)，多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海博迅)。

1.4 降解AFB1菌株的分離與篩選

使用生理鹽水溶解待分離樣品，吸取上清液轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h。同時(shí)將實(shí)驗(yàn)室保存的菌株搖瓶復(fù)蘇活化。

初篩：取上述搖瓶菌液，適度稀釋后吸取0.1 mL涂布于初篩培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)5 d，挑取生長(zhǎng)較好的菌落，再于初篩培養(yǎng)基上劃線分離3次，從中選取能利用香豆素作為碳源的純種菌株保存?zhèn)溆肹16]。

復(fù)篩：挑取初篩得到的純種菌株接種于50 mL種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24 h。將種子液按照2%比例接入50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)72 h。

向無(wú)菌EP管中加入復(fù)篩菌株發(fā)酵液和AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液(500 ng·mL-1)，使AFB1終濃度為50 ng·mL-1， 同時(shí)以無(wú)菌LB培養(yǎng)基加AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白對(duì)照，37 ℃溫箱內(nèi)振蕩作用72 h，每組處理做3個(gè)平行，重復(fù)2次。作用結(jié)束后，按照AFB1ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)每組AFB1含量，選取AFB1降解率最高的菌株作為目標(biāo)菌株。AFB1降解率按照以下公式計(jì)算：AFB1降解率(%)=(1-試驗(yàn)組AFB1含量/空白組AFB1含量)×100

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將復(fù)篩得到的菌株劃線接種于LB瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～72 h，觀察菌落形態(tài)，并挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，觀察菌體形態(tài)。

1.5.2 生理生化鑒定 參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[17]與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]，對(duì)篩選菌株進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)、7%氯化鈉生長(zhǎng)試驗(yàn)、pH 5.7生長(zhǎng)試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、碳源利用試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)。

1.5.3 16S rDNA鑒定 利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取篩選菌株DNA。使用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1 541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR反應(yīng)體系40 μL：20 μL 2×TaqMix、上下游引物各1 μL、16 μL雙蒸水、2 μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共28個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段大小為1 540 bp的PCR產(chǎn)物送測(cè)序。引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物公司完成。測(cè)序結(jié)果在NCBI上使用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，并構(gòu)建基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 脫毒活性組分的確定

取10 mL篩選菌株發(fā)酵液4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液備用；將菌體沉淀使用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，加入10 mL生理鹽水重懸菌體，制備菌體懸液備用；從上述菌體懸液中吸取5 mL，冰浴條件下超聲波破碎菌體，4 ℃，10 000 r·min-1離心10 min， 收集上清，獲得菌體裂解物上清；菌體破碎沉淀使用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，后用5 mL生理鹽水重懸沉淀，獲得細(xì)菌細(xì)胞裂解物。向發(fā)酵液、上清液、菌體懸液、菌體裂解物上清和細(xì)菌細(xì)胞裂解物中分別加入終濃度為50 ng·mL-1的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同時(shí)以LB培養(yǎng)基加AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白對(duì)照，37 ℃溫箱內(nèi)振蕩作用72 h，每組試驗(yàn)做3個(gè) 平行，重復(fù)2次，作用結(jié)束后測(cè)定各組分AFB1降解率。

1.7 AFB1降解后產(chǎn)物的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

將雞肝癌細(xì)胞(LMH)接種于含有F12培養(yǎng)基(含10% FBS)的培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿瓶底，加入胰蛋白酶消化分散細(xì)胞。向96孔板中接入100 μL的LMH細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h。每孔分別加入10 μL(AFB1終濃度分別為10、20、30、40、50 μg·mL-1) 待測(cè)物質(zhì)，待測(cè)物質(zhì)分為AFB1組(僅含有AFB1)和產(chǎn)物組(AFB1+上清液組兩者作用降解72 h)，各濃度均設(shè)5個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)以僅含細(xì)胞的培養(yǎng)液作為對(duì)照組，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h。吸干96孔板中的培養(yǎng)基，更換成新鮮F12培養(yǎng)基(含2% FBS)。向每孔加入10 μL CCK-8溶液。將96孔板置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下孵育1～4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。樣品的細(xì)胞毒性表示公式：

細(xì)胞毒性(%)= (1-試驗(yàn)樣品OD450 nm/對(duì)照組OD450 nm)×100。

1.8 不同理化因素對(duì)活性組分脫毒效果的影響

取上述AFB1降解率最高的脫毒活性組分5 mL， 分別進(jìn)行熱處理(沸水中煮30 min，恢復(fù)至室溫)、強(qiáng)酸處理(HCl溶液調(diào)節(jié)其pH至1.0，作用2 h 后調(diào)至7.0)、強(qiáng)堿處理(NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至13.0，作用2 h后調(diào)至7.0)、紫外燈照射處理(無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)紫外照射60 min)及蛋白酶K處理(加入終濃度為2 mg·mL-1的蛋白酶K作用2 h)，分別加入終濃度為50 ng·mL-1的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以LB培養(yǎng)基加AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白對(duì)照，每組試驗(yàn)做3個(gè)平行，重復(fù)2次，37 ℃溫箱內(nèi)振蕩作用72 h后對(duì)各組處理的AFB1降解率進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 菌株的篩選

經(jīng)過(guò)初篩得到24株能夠在以香豆素為唯一碳源的培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好的菌株，以對(duì)AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的降解率為指標(biāo)對(duì)初篩菌株進(jìn)行復(fù)篩，從中篩選出1株能夠高效降解AFB1的菌株Y1-B1，其降解率達(dá)到73.2%(表1)。

表1 降解黃曲霉毒素B1菌株的篩選結(jié)果

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 如圖1所示，Y1-B1菌株在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為灰白色、有光澤、呈現(xiàn)不透明的圓形菌落，邊緣不規(guī)則，菌落中心有乳白色突起，呈山丘狀，且菌落不易挑起。Y1-B1菌株培養(yǎng)18～20 h時(shí)革蘭染色，鏡檢為紫色短桿狀菌體，判定為革蘭陽(yáng)性。繼續(xù)培養(yǎng)至后期形成芽胞，芽胞中生(圖2)。

2.2.2 生理生化鑒定 Y1-B1菌株生理生化鑒定結(jié)果如下(表2)，將該鑒定結(jié)果對(duì)比GB/T26428—2010《飼用微生物制劑中枯草芽胞桿菌的檢測(cè)》，可初步判定該菌株屬于枯草芽胞桿菌菌群?？莶菅堪麠U菌菌群是廣大益生菌家族中的一員，枯草芽胞桿菌菌群包括枯草芽胞桿菌及其近緣種群，如解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、萎縮芽胞桿菌(Bacillusatrophaeus)等均屬于該類群[19]。

圖1 菌株Y1-B1在LB培養(yǎng)基上菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain Y1-B1 cultured in LB medium

圖2 菌株Y1-B1形態(tài)(革蘭染色，1000×)Fig.2 Cell morphology of strain Y1-B1(Gram staining, 1 000×)

表2 Y1-B1菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 16S rDNA序列分析 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳得到單一條帶，且條帶大小約為1 540 bp(圖3)，將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。將Y1-B1菌株16S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI上通過(guò)BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，根據(jù) GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)公布的有關(guān)菌種數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。由圖4可知，Y1-B1菌株與Bacillusamyloliquefaciens(KT961125.1)在同一分支中，16S rDNA序列相似性達(dá)到99%。結(jié)合上述形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化鑒定結(jié)果，最終確定該菌株為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.Y1-B1菌株P(guān)CR產(chǎn)物；2. 陰性對(duì)照M. DL2000 DNA marker；1.PCR products of Y1-B1 strain；2. Negative control圖3 Y1-B1菌株16S rDNA PCR結(jié)果Fig.3 PCR of 16S rDNA of strain Y1-B1

2.3 脫毒活性組分的定位

對(duì)解淀粉芽胞桿菌Y1-B1培養(yǎng)物的不同組分進(jìn)行AFB1降解活性測(cè)定。結(jié)果顯示，發(fā)酵液的不同組分均具有一定的黃曲霉毒素B1降解活性(圖5)。其中，上清液的脫毒活性顯著高于菌體裂解物上清、菌體懸液以及細(xì)菌細(xì)胞裂解物，上清液對(duì)AFB1的降解率為87.8%，菌體裂解物上清、菌體懸液和細(xì)菌細(xì)胞裂解物對(duì)AFB1的降解率分別為17.9%(P<0.001)、20.8%(P<0.001)、23.3%(P<0.001)。其中菌體懸液和細(xì)菌細(xì)胞裂解物均具有一定的脫毒能力，分析可能是菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)對(duì)AFB1有一定的吸附作用[20]，同時(shí)Y1-B1菌株的菌體裂解物上清也具有一定的脫毒能力，但其脫毒能力相對(duì)上清液較弱。因此，Y1-B1菌株的胞外分泌物發(fā)揮主要的脫毒作用。與發(fā)酵液的AFB1降解率88.1%相比，細(xì)菌培養(yǎng)上清液的脫毒效果基本相同，無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.4 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)，對(duì)比AFB1及AFB1降解后的產(chǎn)物對(duì)LMH細(xì)胞的毒性。如圖6所示，在相同的AFB1濃度下，產(chǎn)物組對(duì)LMH細(xì)胞的毒性作用均明顯低于AFB1組，且隨著AFB1濃度的升高，兩組細(xì)胞毒性均呈增加趨勢(shì)，分析原因可能是加入的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品終濃度偏高所致。當(dāng)AFB1終濃度為20 μg·mL-1時(shí)，AFB1組細(xì)胞發(fā)生顯著的形態(tài)變化，細(xì)胞皺縮破裂，部分細(xì)胞呈圓形推測(cè)其即將凋亡，而產(chǎn)物組僅有少量細(xì)胞死亡(圖7)。

ns. P>0.05; *. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001ns. P>0.05; *. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001圖5 解淀粉芽胞桿菌Y1-B1的AFB1脫毒活性成分分析Fig.5 Detoxification active component of Bacillus amyloliquefaciens Y1-B1

圖6 AFB1及AFB1降解產(chǎn)物分別處理LMH細(xì)胞的毒性檢測(cè)Fig.6 Cytotoxicity detection of LMH cells treated with AFB1 and AFB1 degradation products

2.5 不同理化處理對(duì)活性組分脫毒效果的影響

不同理化處理對(duì)解淀粉芽胞桿菌Y1-B1脫毒活性物質(zhì)的脫毒效果研究結(jié)果顯示，上清液經(jīng)過(guò)熱處理后，AFB1降解率為89.6%，對(duì)比未作處理上清液87.2%的AFB1降解率，兩者差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明該脫毒活性物質(zhì)對(duì)熱處理具有極好的耐受性。上清液經(jīng)過(guò)紫外照射處理、強(qiáng)堿、強(qiáng)酸和蛋白酶K處理后，脫毒能力均有不同程度的下降，AFB1降解率分別為83.9%(P<0.05)、35.0%(P<0.001)、38.2%(P<0.001)、60.5%(P<0.01)，說(shuō)明紫外照射處理對(duì)其脫毒能力影響較小，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿處理對(duì)其影響較大，蛋白酶K處理僅有部分影響(圖8)。

A. AFB1組；B. 產(chǎn)物組；C. 對(duì)照組A. AFB1; B. AFB1 degradation products; C. Control group圖7 AFB1及AFB1降解產(chǎn)物(AFB1濃度為20 μg·mL-1)分別處理LMH細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)Fig.7 Morphology of LMH cells treated with AFB1 and AFB1 degradation products(AFB1 concentration was 20 μg·mL-1)

ns. P>0.05; *. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001圖8 不同理化處理對(duì)解淀粉芽胞桿菌Y1-B1活性組分脫毒效果的影響Fig.8 Influence of different physical and chemical treatments on the detoxification effects of the active components of Bacillus amyloliquefaciens Y1-B1

3 討 論

由于黃曲霉毒素具有強(qiáng)毒性、高穩(wěn)定性和高致癌性等特點(diǎn)，不僅會(huì)影響糧食及飼料產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)也潛在威脅著人類和動(dòng)物的健康，探索去除或降低黃曲霉毒素的方法具有重要意義。以往的脫毒方法常采用物理法或化學(xué)法，但在使用過(guò)程中存在諸多弊端，如蒙脫石、硅藻土等能吸附飼料中的黃曲霉毒素，但也能吸附飼料中的維生素、微量元素和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分而降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，同時(shí)吸附的毒素有可能在動(dòng)物胃腸道內(nèi)重新釋放，未被代謝或者重新釋放的毒素隨糞便排出造成環(huán)境的二次污染等[21-22]，因此控制黃曲霉毒素的污染急需一種高效率、特異性強(qiáng)以及對(duì)飼料和環(huán)境沒(méi)有污染的技術(shù)。

近年來(lái)，利用真菌和細(xì)菌生物降解霉菌毒素已成為科研人員研究的熱點(diǎn)。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)白腐真菌(Phanerochaetesordida) YK-624產(chǎn)生的錳過(guò)氧化物酶MnP能降解AFB1，降解率高達(dá)86.0%，并發(fā)現(xiàn)其脫毒機(jī)制為MnP先將AFB1氧化為AFB1-8,9-環(huán)氧化物，后水解轉(zhuǎn)化為AFB1-8,9-二氫二醇。Shcherbakova等[24]從球狀莖點(diǎn)霉PG41(PhomaglomerataPG41)發(fā)酵液上清和胞內(nèi)液中分離到兩種蛋白質(zhì)類物質(zhì)，兩種物質(zhì)分別能降解78.0%和66.0%的AFB1，但降解過(guò)程受pH和時(shí)間影響較大，且對(duì)溫度不穩(wěn)定，使用蛋白酶K處理也能明顯降低脫毒效果。Zhang等[25]篩選出一株黑曲霉ND-1(AspergillusnigerND-1)，在最佳發(fā)酵條件下AFB1降解率為58.2%，且其降解過(guò)程為酶促反應(yīng)，脫毒物質(zhì)為胞外產(chǎn)物。Alberts等[26]報(bào)道，紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)發(fā)酵液上清能有效降解AFB1，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該降解過(guò)程為酶促反應(yīng)，AFB1降解酶是分泌到細(xì)胞外的。Adebo等[27]發(fā)現(xiàn)從鰻敗血假單胞菌VGF1(PseudomonasanguillisepticaVGF1)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和葡萄球菌VGF2(Staphylococcussp. VGF2)提取的胞內(nèi)液，在加入蛋白酶抑制劑的情況下，作用6 h后3種細(xì)菌對(duì)AFB1的降解率分別為66.5%、63.0%和100%，當(dāng)不加入蛋白酶抑制劑時(shí)，發(fā)酵液和胞內(nèi)液的AFB1降解率顯著下降。目前報(bào)道的微生物中，降解AFB1多為酶促反應(yīng)，受蛋白酶K影響顯著。蛋白類酶物質(zhì)存在著提取操作繁瑣，酶產(chǎn)量不足，酶性質(zhì)不穩(wěn)定、酶促反應(yīng)條件苛刻、毒素降解過(guò)程緩慢且不完全等問(wèn)題[28-29]，而且大部分脫毒菌株為非安全菌株，不能作為活菌制劑直接添加到飼料中，因此大多數(shù)研究成果仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段，在實(shí)際生產(chǎn)中較難應(yīng)用。本試驗(yàn)以香豆素為唯一碳源篩選出一株能高效降解AFB1的菌株，AFB1降解率達(dá)到73.2%，后期通過(guò)對(duì)其發(fā)酵條件優(yōu)化，該菌發(fā)酵液AFB1降解率由原來(lái)的73.2%提升到86.1%，優(yōu)化效果顯著。經(jīng)鑒定Y1-B1菌株為解淀粉芽胞桿菌，屬于芽胞桿菌屬，與枯草芽胞桿菌親緣性高。作為一種生物拮抗菌來(lái)說(shuō)，解淀粉芽胞桿菌已廣泛應(yīng)用于蔬菜保鮮、工業(yè)酶生產(chǎn)及環(huán)境保護(hù)等眾多領(lǐng)域，并被證實(shí)安全有效。解淀粉芽胞桿菌在其生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，如Arrebola等[30]使用甲醇提取解淀粉芽胞桿菌PPCB004抑菌成分，該抑菌物質(zhì)對(duì)7種柑橘致病真菌具有抗菌作用，經(jīng)色譜分析法分析發(fā)現(xiàn)該抑菌物質(zhì)主要為伊枯草菌素A。Moyne等[31]采用陰離子交換和凝膠過(guò)濾色譜法從枯草芽胞桿菌AU195中分離到桿菌霉素D，該物質(zhì)對(duì)黃曲霉及其他真菌均有很強(qiáng)的抑制作用。Reddy等[32]以200 mL·kg-1的比例將枯草芽胞桿菌發(fā)酵液添加到稻米中，68.0%的黃曲霉生長(zhǎng)被抑制同時(shí)58.0%的黃曲霉毒素被降解。王英國(guó)等[33]從堆肥中分離到一株解淀粉芽胞桿菌，該菌對(duì)尖孢鐮刀菌、毛霉、黑曲霉等均具有強(qiáng)烈的抗真菌活性，對(duì)抗菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化并通過(guò)紅外光譜和質(zhì)譜分析推測(cè)其為一種分子質(zhì)量1 498 Da的肽類物質(zhì)。以上報(bào)道可以看出，解淀粉芽胞桿菌的代謝產(chǎn)物大多具有廣譜抑制真菌的特性。然而，關(guān)于解淀粉芽胞桿菌降解霉菌毒素的研究相對(duì)較少。Farzaneh等[34]從開(kāi)心果中分離到一株枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)UTBSP1，可有效降解營(yíng)養(yǎng)肉湯及開(kāi)心果中的AFB1，降解率分別為85.7% 和95.0%；無(wú)細(xì)胞上清液可使AFB1含量下降78.4%，AFB1的降解是酶促反應(yīng)，可能是一種胞外的組成性酶，降解后AFB1與標(biāo)準(zhǔn)AFB1化學(xué)性質(zhì)不同，失去了熒光性質(zhì)。Farzaneh等[35]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該菌株可顯著降低開(kāi)心果中黃曲霉(Aspergillusflavus)R5的生長(zhǎng)和AFB1的含量，菌株UTBSP1的無(wú)細(xì)胞上清液會(huì)顯著影響黃曲霉孢子的活力；質(zhì)譜分析顯示無(wú)細(xì)胞上清液的甲醇提取物中有兩種化合物與surfactin的環(huán)脂肽和fengycin家族具有高度相似性，并以協(xié)同方式針對(duì)黃曲霉R5表現(xiàn)出強(qiáng)抑菌活性，但對(duì)于降解AFB1的機(jī)制未進(jìn)行深入闡述。關(guān)心[36]從雞糞樣品中分離篩選出1株 蔬菜芽胞桿菌(Bacillusoleronius)GX01，AFB1的降解率達(dá)83.0%，上清液加熱、加蛋白酶K后的降解活性下降顯著，分別為16.2%和23.9%，表明蔬菜芽胞桿菌GX01降解AFB1的物質(zhì)是胞外酶。王佳偉等[37]從堆肥土壤中分離到一株解淀粉芽胞桿菌SG16，其發(fā)酵上清液對(duì)AFB1的降解率能達(dá)到80.6%，但溫度、pH、金屬離子、蛋白酶K等酶促反應(yīng)因素均能影響其解毒酶活力，其活性物質(zhì)初步鑒定為胞外酶，酶促反應(yīng)條件較為嚴(yán)苛。蔡國(guó)林等[38]分離到的解淀粉芽胞桿菌CGMCC-9021能夠高效降解AFB1，結(jié)合硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE FF陰離子交換層析和Superdux 75凝膠過(guò)濾層析方法對(duì)脫毒物質(zhì)進(jìn)行分離純化，后經(jīng)Tricine-SDS-PAGE和質(zhì)譜鑒定初步確定是一種分子質(zhì)量約27 ku的裂解酶。近年來(lái)，芽胞桿菌屬菌株針對(duì)黃曲霉及黃曲霉毒素的研究主要集中在兩個(gè)方面，一是菌株具有抑制黃曲霉及其孢子生長(zhǎng)的能力，活性組分多是脂肽類物質(zhì)等；二是菌株具有降解黃曲霉毒素的能力，活性組分通常是蛋白類酶等，受高溫和蛋白酶K影響大。本試驗(yàn)篩選到的解淀粉芽胞桿菌Y1-B1能代謝產(chǎn)生降解AFB1的脫毒活性物質(zhì)，后期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該脫毒活性物質(zhì)為一種胞外產(chǎn)物，其降解AFB1后的產(chǎn)物對(duì)LMH細(xì)胞的毒性作用顯著降低，特別是該脫毒活性組分對(duì)高溫和紫外線照射處理均表現(xiàn)出較強(qiáng)抵抗力，蛋白酶K對(duì)其脫毒能力影響有限，推測(cè)其可能是一種脂肽類物質(zhì)或耐熱酶類物質(zhì)，這一結(jié)果與目前大多數(shù)研究不同，后期需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

本試驗(yàn)篩選出的解淀粉芽胞桿菌可作為益生菌制劑直接添加到飼料中[39]，既可以在粗放條件下高效降解毒素，又可以發(fā)揮益生菌的益生功能，解決了非安全菌株應(yīng)用于毒素降解時(shí)工藝繁瑣復(fù)雜、生產(chǎn)成本居高不下等問(wèn)題，這是本試驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)。本研究為解決黃曲霉毒素污染問(wèn)題提供了新的微生物種質(zhì)資源，為后續(xù)開(kāi)發(fā)脫霉制劑的產(chǎn)業(yè)化工藝奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

以香豆素為唯一碳源進(jìn)行初篩，通過(guò)測(cè)定對(duì)AFB1的降解能力進(jìn)行復(fù)篩，成功篩選到1株能高效降解AFB1的菌株Y1-B1，降解率達(dá)86.1%。通過(guò)對(duì)Y1-B1菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA 序列分析，確定其為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。通過(guò)測(cè)定Y1-B1菌株各活性組分對(duì)AFB1的降解能力，確定其脫毒物質(zhì)為一種胞外產(chǎn)物。細(xì)胞毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用該活性組分降解AFB1后的產(chǎn)物對(duì)LMH細(xì)胞的毒性作用顯著降低。對(duì)活性組分進(jìn)行不同理化處理發(fā)現(xiàn)，其對(duì)高溫、紫外線抵抗力較強(qiáng)，對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿相對(duì)較差，蛋白酶K僅造成脫毒能力部分減弱。