非經(jīng)典細(xì)胞焦亡體外模型的構(gòu)建

石玉華，傅心雨，鄭夢潔，呂 倩，師福山

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058)

炎性小體主要是由模式識別受體、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)、炎性Caspase(含半胱氨酸蛋白水解酶)組成的功能性多蛋白復(fù)合物[1-2]。炎性小體激活后，活化的Caspase激活切割pro-IL-1β和pro-IL-18轉(zhuǎn)化為活性IL-1β和IL-18，并且切割全長gasdermin D(hGSDMD-FL)使其裂解為GSDMD-C端(GSDMD-p20)和GSDMD-N端片段(GSDMD-p30)，有活性的GSDMD-N端片段在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)打孔，形成10～20 nm孔徑的膜孔，最終導(dǎo)致炎癥細(xì)胞死亡，稱為細(xì)胞焦亡[3-4]。細(xì)胞焦亡是一種全新的細(xì)胞死亡方式[5-6]，是由Gasdermin家族蛋白(主要是gasdermin D, GSDMD)介導(dǎo)的、以細(xì)胞膜形成孔洞、破裂以及細(xì)胞內(nèi)容物大量釋放為特征[7]。炎性Caspase，主要包括Caspase-1和Caspase-4/5/11，分別在經(jīng)典和非經(jīng)典炎性小體中發(fā)揮作用[8-9]。經(jīng)典的細(xì)胞焦亡是由活化后的炎癥性半胱氨酸氨酶-1(Caspase-1)切割GSDMD所介導(dǎo)，通過特異性切割GSDMD形成GSDMD-N端(GSDMD-p30)，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔并同時促進(jìn)LDH的釋放，最終引起細(xì)胞焦亡[10]。非經(jīng)典細(xì)胞焦亡是脂多糖(LPS)入侵至細(xì)胞胞質(zhì)中，進(jìn)而活化Caspase-4/5 (人)、Caspase-11 (鼠)，然后激活狀態(tài)的Caspase-4/5/11直接裂解GSDMD為GSDMD-C端和GSDMD-N端片段，活性GSDMD-N端促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生焦亡現(xiàn)象[11]。非經(jīng)典細(xì)胞焦亡與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，進(jìn)一步研究Gasdermin D介導(dǎo)的非經(jīng)典細(xì)胞焦亡的調(diào)控機制將對疾病的預(yù)防治療、新藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。本研究成功構(gòu)建了非經(jīng)典細(xì)胞焦亡的體外模型，為后續(xù)其激活機制和藥物研究提供可靠的模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞株及菌株 pCMV-N-MYC、p3XFLAG-CMV-7.1和pcDNA3.1-MYC-C真核表達(dá)載體和人胚腎細(xì)胞HEK293T細(xì)胞株均由本實驗室保存；Trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù) (TransGen Biotech) 有限公司。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒(RN001)購于上海奕杉生物科技有限公司；PCR試劑盒(2×RapidTaqmaster mix P222)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(R312-01)、無縫克隆試劑盒(ClonExpress?II One Step Cloning Kit, C112) 和DNA marker (7E321K9)購于南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒(B518141-0100)購于上海生工生物工程股份有限公司；質(zhì)粒小提中量提取試劑盒(DP118)購于天根(TIANGEN) 公司；限制性內(nèi)切酶SalⅠ、NotⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ和ApaⅠ購于NEB (New England Biolabs)；VigoFect轉(zhuǎn)染試劑(201E)購于北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司；anti-FLAG (F1804)和anti-MYC抗體(C3956)購自Sigma公司；anti-GAPDH抗體(sc-365062)購于Santa Cruz Biotechnology公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG (abs200002)和羊抗鼠(abs20039 ss)購于Absin公司；QuickBlockTMWestern封閉液(P0252)、QuickBlockTMWestern一抗稀釋液(P0256FT)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LDH檢測試劑盒(G1780)購自Promega公司；PI (碘化丙啶)檢測試劑盒(51-66211E)購于BD Pharmingen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞總RNA提取及cDNA合成 使用RNA提取試劑盒提取人外周血的單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞總RNA后，使用PrimeScript RT reagent Kit配制體系，按照說明書的程序在PCR儀內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 引物設(shè)計 通過NCBI數(shù)據(jù)庫找到Caspase-4(基因序列號: NM_001225.4)、hGSDMD-FL(基因序列號: NM_024736.7)和hGSDMD-p30(基因序列號: NM_024736.7)的編碼序列，使用SnapGene和CE Design V1.04軟件設(shè)計相應(yīng)引物。無縫克隆引物設(shè)計原則：在插入片段正反向擴增引物的5′端加入線性化載體兩末端同源序列，使擴增后的插入片段5′和3′最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應(yīng)一致的同源序列(15～20 bp， 不包括酶切位點)。完成引物設(shè)計后由上海生工生物工程股份有限公司合成。各個基因片段的引物設(shè)計如表1所示。

表1 基因片段引物序列

1.2.3 PCR擴增 各目的片段以合成的cDNA為模板，采用PCR方法擴增Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-p30基因，反應(yīng)體系(50 μL)如下：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，cDNA模板1～5 μL (不超過PCR反應(yīng)總體積的1/10)，上下游引物各2 μL，補足ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完畢后，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.4 質(zhì)粒構(gòu)建 制備線性化載體，將空載體分別選擇合適的酶切位點，對載體進(jìn)行線性化。其中p3XFLAG-CMV-7.1空載體使用SalⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，pCMV-N-MYC空載體使用HindⅢ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，pcDNA3.1-MYC-C空載體使用HindⅢ和ApaⅠ進(jìn)行雙酶切。酶切完成后，回收各個片段及PCR產(chǎn)物，用ClonExpress?II One Step Cloning Kit進(jìn)行重組反應(yīng)，將DNA片段插入到線性化載體中。取10 μL重組產(chǎn)物加到100 μL Trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，在熱激和冷激后，加入500 μL無抗生素的培養(yǎng)基放入37 ℃搖床200轉(zhuǎn)復(fù)蘇1 h，取100 μL復(fù)蘇了的菌液涂布在含氨芐抗生素的培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后，挑取單克隆菌落搖菌，12～18 h后用天根提取試劑盒提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行雙酶切電泳驗證質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。將酶切成功的重組質(zhì)粒送至生工生物工程股份有限公司測序，將測序正確的質(zhì)粒分別命名為pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL、pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC。

1.2.5 HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞(6～8)×104個·孔-1接種于24孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁長至密度為40%～60%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 h，更換新鮮的完全培養(yǎng)液，置37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每孔轉(zhuǎn)染方法：0.5 μL VigoFect與24.5 μL生理鹽水混合，混勻后室溫孵育5 min； 重組質(zhì)粒與生理鹽水混合至總體積25 μL；將稀釋的VigoFect逐滴加入稀釋的DNA溶液中，輕輕混勻后將所得的轉(zhuǎn)染工作液共50 μL在室溫放置15 min， 然后逐滴加到500 μL細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻細(xì)胞培養(yǎng)液，置37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后6 h 更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24 h后，收取細(xì)胞上清液和細(xì)胞蛋白進(jìn)行相應(yīng)的檢測。

1.2.6 蛋白表達(dá)驗證 待HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后, 棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，加入含1 mmol·L-1PMSF的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA法蛋白定量后，加入上樣緩沖液混合后100 ℃水浴10 min，取變性蛋白20 μL上樣，通過10% SDS-PAGE電泳分離，先80 V后120 V恒壓電泳后，蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至0.45 μm的PVDF膜上，300 mA恒流電轉(zhuǎn)90 min, QuickBlockTMWestern封閉液封閉30 min，分別加入Flag一抗、MYC一抗和GAPDH一抗置于4 ℃孵育過夜。次日，配制TBST溶液洗3次，每次8 min，分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠的二抗，置于搖床上孵育1 h。孵育結(jié)束后再用TBST溶液洗3次，每次8 min。 ECL發(fā)光，在光化學(xué)成像儀內(nèi)進(jìn)行成像顯色，檢測目的蛋白電泳條帶。

1.2.7 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞 (6～8)×104個·孔-1接種于24孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁長至40%～60% 為宜；兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時所用的量分別如下：pCMV-MYC-Caspase-4 600 ng、p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL 600 ng。轉(zhuǎn)染24 h后離心取上清，CytoTox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay檢測LDH的釋放情況。

1.2.8 PI(碘化丙啶)染色步驟 HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基，用500 μL預(yù)冷的1×PBS 洗2遍棄上清，加入200 μL PI染色試劑(工作濃度2.5 μg·mL-1)避光孵育15 min后，再用500 μL預(yù)冷的1×PBS洗2遍，最后用熒光倒置顯微鏡觀察PI染色情況。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行分析，計量組比較采用t檢驗；**.P<0.01； ***.P<0.001。

2 結(jié) 果

2.1 Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-p30基因擴增

以合成的cDNA為模板，PCR擴增Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-P30基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見擴增產(chǎn)物大小和預(yù)期大小一致(圖1)。

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.Caspase-4；2. hGSDMD-FL；3.hGSDMD-p30基因M. DL2000 DNA marker; 1.Caspase-4; 2. hGSDMD-FL; 3.hGSDMD-p30 gene圖1 PCR擴增結(jié)果Fig.1 Electrophoresis pattern of PCR amplification products

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

重組產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至Trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，挑取單克隆菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切驗證：①重組質(zhì)粒pCMV-MYC-Caspase-4 (圖2A)使用SalⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，pCMV-MYC-Caspase-4酶切后大小分別為3 776和1 134 bp；②重組質(zhì)粒p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL (圖2B)使用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL酶切后大小分別為4 709和1 455 bp；③重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC (圖2C)使用HindⅢ和ApaⅠ雙酶切，pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC雙酶切后大小分別為5 380和825 bp。酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2D，結(jié)果表明各個重組質(zhì)粒通過酶切后均和預(yù)期大小一致，通過生工測序結(jié)果進(jìn)一步證明了各個重組質(zhì)粒均構(gòu)建成功。

2.3 蛋白表達(dá)驗證

將構(gòu)建成功的pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL及pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞蛋白，通過Western blot驗證各重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。各融合蛋白的大小分別為：pCMV-MYC-Caspase-4 45.7 ku，p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL 55.6 ku，pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC 32.0 ku。結(jié)果如圖3所示。證明重組質(zhì)粒pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL均在HEK293T細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。但是，無法檢測到GSDMD-p30的表達(dá)，這是該蛋白可能對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[12]所致。

2.4 非經(jīng)典細(xì)胞焦亡模型的體外構(gòu)建

為了在HEK293T細(xì)胞中構(gòu)建非經(jīng)典炎癥小體激活介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡模型，根據(jù)研究報道，細(xì)胞焦亡可通過檢測細(xì)胞上清LDH的釋放、熒光觀察PI染色情況、GSDMD有無被切割為有活性的N端p30片段等手段確定。將p3XFLAG-GSDMD-FL(600 ng)、MYC-Caspase-4(600 ng)這2個構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于HEK293T細(xì)胞中，通過檢測上清中LDH的分泌情況、Western blot檢測Gasdermin-D(GSDMD)切割水平及熒光觀察PI染色情況確定非經(jīng)典細(xì)胞焦亡模型是否構(gòu)建成功。結(jié)果可見，Caspase-4與N端標(biāo)簽的GSDMD全長共轉(zhuǎn)染或者單獨轉(zhuǎn)染C端標(biāo)簽的GSDMD-p30均可導(dǎo)致LDH的顯著上升(**.P<0.01; ***.P<0.001)，而單獨轉(zhuǎn)染GSDMD全長或者Caspase-4組無明顯變化(圖4)，熒光顯微鏡觀察共轉(zhuǎn)染組可見明顯的PI染色(圖5)，通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Caspase-4可以將全長的GSDMD切割為N端的p30片段，這與LDH和PI的結(jié)果相一致(圖4)。此外，GSDMD-N端p30陽性對照和共轉(zhuǎn)染的結(jié)果類似，細(xì)胞均表現(xiàn)出了顯著的焦亡現(xiàn)象(圖4)。因此，以上結(jié)果均表明，成功構(gòu)建了非經(jīng)典細(xì)胞焦亡體外模型。

A. pCMV-MYC-Caspase-4表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖; B. p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖; C. pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖; D.重組質(zhì)粒酶切電泳鑒定圖(M. DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pCMV-MYC-Caspase-4；2. p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL；3.pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC)A. Schematic diagram of pCMV-MYC-Caspase-4; B. Schematic diagram of p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL; C. Schematic diagram of pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC; D. Electrophoresis pattern of expression plasmid(M. DL2000 DNA marker; 1.pCMV-MYC-Caspase-4; 2. p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL; 3.pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC)圖2 各表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定Fig.2 Electrophoresis pattern of expression plasmids digestion identification

圖3 Western blot檢測各融合蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 Recombinant vectors in HEK293T cells detected by Western blot

3 討 論

細(xì)胞焦亡是一種依賴于Caspase-1和Caspase-4/5/11 并且具有促炎性質(zhì)的程序性細(xì)胞死亡，是機體在清除病原感染和受到內(nèi)源危險信號刺激時的重要免疫防御反應(yīng)[13-14]。

2015年，邵峰課題組通過CRISPR/Cas9方法進(jìn)行全基因組篩選，確定了GSDMD蛋白是所有炎性Caspase的直接底物，是細(xì)胞焦亡的真正執(zhí)行者[8]。同期Nature的另外一項獨立研究通過化學(xué)誘變的小鼠突變體篩選，發(fā)現(xiàn)非典型炎性小體信號傳導(dǎo)是通過人Caspase-4/5(小鼠Caspase-11)裂解gasdermin D，最終都導(dǎo)致切割后的N端GSDMD在細(xì)胞膜內(nèi)部打孔，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和焦亡[9,15]。與典型細(xì)胞焦亡相比，最近發(fā)現(xiàn)的非典型細(xì)胞焦亡在其機制和病理生理意義上仍缺乏研究。

圖4 各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后LDH的釋放量及WB驗證表達(dá)情況Fig.4 Production of LDH and the expression of proteins measured by Western blot

在驗證蛋白表達(dá)過程中，作者的研究表明重組質(zhì)粒pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL均能在HEK293T細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，研究報道GSDMD-p30引發(fā)顯著的細(xì)胞死亡[8-9]，與Lei等[12]的研究一致，作者通過多次試驗也無法檢測到GSDMD-p30的表達(dá)，這可能與GSDMD-p30結(jié)構(gòu)域?qū)λ拗骷?xì)胞產(chǎn)生的劇烈毒性作用[12]有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究通過構(gòu)建能夠誘導(dǎo)非經(jīng)典細(xì)胞焦亡的重組質(zhì)粒，經(jīng)Western blot驗證無誤后共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，通過檢測LDH的釋放，GSDMD全長片段是否被切割以及PI染色的情況表明成功在體外構(gòu)建了非經(jīng)典細(xì)胞焦亡模型，為今后細(xì)胞焦亡機制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

圖5 各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PI染色情況Fig.5 PI staining observed by fluorescence microscope